程序降溫過程中吲哚乙酸對生菜種子抗低溫脅迫的影響

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(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所， 上海 200093)

·研究報告·

程序降溫過程中吲哚乙酸對生菜種子抗低溫脅迫的影響

張晨雪，韓穎穎，李維杰，劉寶林，沈夢琪，周強

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所， 上海 200093)

種子是植物越冬的重要生存策略，種子低溫保存是種質(zhì)資源保存的主要方式。選取含水生菜種子作為研究對象，利用程序降溫儀制造不同的降溫速率(3 ℃/h和60 ℃/h)，研究吲哚乙酸(IAA)對種子抗寒性的影響。結(jié)果表明，相比于快速降溫(60 ℃/h)，慢速降溫(3 ℃/h)有利于生菜種子內(nèi)源IAA的積累。外源施加IAA可以降低程序降溫(經(jīng)慢速降溫后更顯著)過程中生菜種子的冷凍傷害，其中以200μm的IAA對種子進行預(yù)處理效果最顯著。無論降溫速率如何，生菜種子遇到低溫脅迫后SOD活性和脯氨酸含量會顯著增加。外源施加IAA濃度越高，對SOD活性產(chǎn)生抑制作用，而IAA對脯氨酸含量有促進作用。降溫速率以及外源IAA濃度也會對冷相關(guān)的ICE 1、HOS 1基因的相對表達量產(chǎn)生影響。

吲哚乙酸; 生菜種子; 抗寒性; 低溫脅迫

自然界中，植物的生長受到來自外界多方面的壓力[1-2]。植物要存活，自身必須形成相關(guān)的應(yīng)答機制。因此，如何響應(yīng)這些壓力成為植物是否能夠生存的重要因素[1]。在這些非生物影響因素中，低溫是比較常見外界脅迫因素[3]。

低溫對植物生長影響較大，最主要的傷害是破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致代謝失調(diào)[4]。因此植物逐漸形成了多種防御機制，其中最重要的一個方面是利用植物激素對低溫脅迫產(chǎn)生響應(yīng)。在植物主要的5大激素中，生長素是最早被發(fā)現(xiàn)的，生長素又稱吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，在植物體中主要通過色氨酸依賴途徑合成，能夠在適宜的條件下，控制植物的生長進程[5]。有關(guān)研究證實，生長素作為植物對環(huán)境適應(yīng)的調(diào)控者存在，生長素通路的相關(guān)因子能夠響應(yīng)低溫脅迫[6]。

植物通過種子進行越冬，所以種子與植物植株相比具有更強的抗寒能力[7]。對種子的抗寒機制進行研究可能會得到與植株抗寒不同的新的調(diào)控機制。

植物種質(zhì)資源的保存主要以低溫保存為主[7]。目前根據(jù)種子的耐低溫能力，將種子分為2類，一類是正常型，這類種子耐干燥，耐低溫，比如生菜、水稻；另一類是頑拗型，如椰子、油梨、紅毛丹等，其種子的最低含水量要求較高，如果種子脫水至低于最低含水量，則種子失去萌發(fā)能力。這類種子由于含水量較高，造成對低溫不耐受性，而長期保存種子的種子庫溫度控制在-10～-20 ℃，所以這類種子長期保存比較困難?？紤]到有些瀕危植物的種子屬于頑拗性種子(如多毛坡壘，箭毒木)，解決頑拗性種子的低溫保存問題具有重要的意義[8]。

生菜種子是一種正常類型(orthodox)的種子，其干燥后種子含水量較低，能耐受寒冷，是低溫保存的模式植物。顧琦珺等[9]研究了含水生菜種子低溫保存過程中的物理學(xué)變化，以便對具有一定含水量的種子在低溫處理過程中的機制變化進行探索，為頑拗性種子的低溫保存提供節(jié)點；其研究表明，含水生菜種子在快速和慢速程序降溫過程中快速降溫能夠產(chǎn)生2個放熱曲線，而慢速降溫只產(chǎn)生1個放熱曲線。這些差異性可能是由于胚以及胚乳冰晶的產(chǎn)生不同步造成的。含水生菜種子的致死溫度發(fā)生在-15～-20 ℃之間。

本實驗選取生菜種子為研究對象，通過分析經(jīng)程序降溫至-20 ℃后的內(nèi)源IAA含量變化以及外源施加不同濃度的IAA對經(jīng)程序降溫后發(fā)芽率以及抗逆脅迫有關(guān)生化指標(biāo)的影響，分析種子的抗寒性與IAA、生長素響應(yīng)通路之間的關(guān)系，以期對現(xiàn)有的研究進行補充，同時能夠為其它類型種子的低溫保存提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材 料

生菜種子(LactucasativaL.)，IAA標(biāo)準(zhǔn)品，瓊脂粉，雙蒸水，甲醇，三氯甲烷，乙酸乙酯，0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液，0.1 mol/L的鹽酸溶液，液氮。

1.2 種子預(yù)處理和程序降溫

將干燥的生菜種子分別添加于含有0，100，200，500μmol/L濃度的IAA營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱(光照16 h，黑暗8 h，光照強度為1 660 lx (21±1)℃下恒溫吸水膨脹預(yù)處理11 h后取出，再置于程序降溫儀中，分別進行快速降溫(速率為60 ℃/h)和慢速降溫(速率為3 ℃/h)至-20 ℃。

1.3 內(nèi)源IAA相對含量測定

取4 g未施加外源IAA預(yù)處理、降溫處理至-20 ℃的生菜種子進行內(nèi)源IAA的提取。內(nèi)源IAA的提取參考龔曉崇等[11]、謝勇平等[12]方法進行。

借助液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Scientific Q Exactive LC-MS, 美國 Thermo)檢測IAA的相對含量。色譜條件：BEHC 18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm)流速：0.2 mL/min流動相設(shè)定：前2 min甲醇80%，水20%，2 min后甲醇50%，水50%，6 min甲醇30%，水70%。質(zhì)譜條件：噴霧電壓3 000 V，蒸發(fā)溫度385 ℃ ，鞘氣壓力30 psi，毛細(xì)管溫度249 ℃，采用全掃描質(zhì)譜。每個樣品做3次重復(fù)。

1.4 發(fā)芽率的統(tǒng)計

將程序降溫處理后的生菜種子播種于MS固體培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基播種50粒，每個IAA處理濃度做3個平行重復(fù)，放置于恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每天12：00時統(tǒng)計其發(fā)芽情況，以種子露白，胚根長2 mm作為發(fā)芽依據(jù)。發(fā)芽率(%)=供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%[10]。

1.5 SOD活性以及脯氨酸含量測定

將程序降溫處理后至-20 ℃的生菜種子，根據(jù)章秀福等[13]氮藍四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)光還原法進行SOD活性的測定，重復(fù)3次。

根據(jù)孫學(xué)文等[14]磺基水楊酸法測脯氨酸含量，重復(fù)3次。

1.6 反轉(zhuǎn)錄和real-time PCR

根據(jù)Trizol法提取處理后生菜種子總的RNA。選用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa，大連)運用2步法進行cDNA合成，完成反轉(zhuǎn)錄。在NCBI基因庫中查找ICE 1，HOS 1基因序列，利用Beacon designer軟件進行引物設(shè)計，引物設(shè)計見表1，引物合成委托生工生物工程(上海)有限公司完成。建立PCR反應(yīng)體系后，以生菜的管家基因ACTIN為內(nèi)參進行real-time PCR。用Excel 2003以及SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

表1 引物序列

基因名稱序列(5’to3’)ACTINF:CTGGTGTGATGGTAGGTATGGR:CTCGTTGTAGAAAGTGTGATGCICE1F:TCGGACATAGTTCTTCTTTCR:GTGACGCCATTGATTACCHOS1F:GTTGGTCTGGTCGTGATGR:CTTCGTCATCGCTTGTTTCATC

2 結(jié)果與分析

2.1 程序降溫對內(nèi)源IAA相對含量的影響

生菜種子內(nèi)源IAA抽提后，經(jīng)過LC-MS進行相對定量分析。分析負(fù)離子模式下提取的離子電流圖，確定未經(jīng)過程序降溫處理以及經(jīng)過快、慢速程序降溫處理后的種子中IAA的相對含量。

不同處理后的種子IAA含量如圖1所示，經(jīng)過比較可知，快速和慢速降溫處理后種子IAA相對含量都大于對照組的含量。進一步比較快速和慢速降溫的含量，發(fā)現(xiàn)慢速降溫的IAA相對含量遠遠大于快速降溫。說明低溫脅迫能夠造成生菜種子內(nèi)源IAA的積累，這可能是種子為了適應(yīng)生存而產(chǎn)生的一種應(yīng)急機制；利用2種不同降溫速率產(chǎn)生的IAA進行相對定量比較，可以進一步推測外界溫度變化的速率對其內(nèi)源IAA的積累產(chǎn)生一定的影響，溫度變化速率較慢可以更好地促進其內(nèi)源IAA的積累。

注：Control-21表示未經(jīng)程序降溫處理；S-20表示慢速降溫至-20 ℃；F-20表示快速降溫至-20 ℃。圖1 不同處理內(nèi)源IAA相對含量比較

2.2 IAA預(yù)處理后生菜種子的耐凍性

不同濃度的IAA處理生菜種子，并經(jīng)過快、慢速降溫后播種，并對發(fā)芽情況進行連續(xù)觀測，直至不再有種子發(fā)芽為止，統(tǒng)計其發(fā)芽數(shù)并根據(jù)公式計算出發(fā)芽率。發(fā)芽率結(jié)果如圖2所示。

不同濃度的IAA對未經(jīng)程序降溫的種子發(fā)芽率的影響不大，這說明外源IAA濃度對種子的生長發(fā)育產(chǎn)生的作用效果不大。生菜種子在經(jīng)過程序降溫處理后發(fā)芽率都有所下降，慢速降溫的發(fā)芽率下降幅度略高于快速降溫處理，這表明慢速降溫持續(xù)冷凍的時間比較長，對種子造成的損害要大。而加入200μmol/L的IAA處理后，顯著提高了慢速降溫后的發(fā)芽率，表明施加此濃度的IAA對種子在慢速降溫產(chǎn)生的低溫脅迫中起到較好保護作用，降低了種子的冷凍傷害，因此200μmol/L為慢速降溫中最適保護濃度?？焖俳禍貤l件下，100～500μmol/L 的IAA 均能顯著提高種子耐凍性和發(fā)芽率，3種施加濃度差異性不大。

注：Control-21表示未經(jīng)程序降溫處理；S-20表示慢速降溫至-20 ℃；F-20表示快速降溫至-20 ℃。圖2 不同處理后的種子發(fā)芽率

2.3 IAA預(yù)處理對SOD活性以及脯氨酸含量的影響

2.3.1 SOD活性結(jié)果與分析

在低溫脅迫的過程中，植物會產(chǎn)生大量的自由基，自由基過多會給植物帶來巨大的傷害。SOD的作用就是能夠清除過多的自由基，抑制氧化作用的發(fā)生，從而減輕或避免凍害的發(fā)生，所以SOD指標(biāo)能夠作為檢驗其抗寒性的指標(biāo)之一。分析不同濃度的IAA處理后的生菜種子SOD活性的變化，就能夠間接得出IAA與抗寒性的關(guān)系以及不同濃度的IAA與其抵御冰凍傷害能力的關(guān)系。

注：Control-21表示未經(jīng)程序降溫處理；S-20表示慢速降溫至-20 ℃；F-20表示快速降溫至-20 ℃。圖3 不同處理后種子SOD活性

SOD活性結(jié)果如圖3所示，不論施加IAA與否，未經(jīng)程序降溫處理的種子SOD活性顯著低于程序降溫處理后的種子，IAA濃度對未程序降溫的種子的SOD活性的影響不大。

在程序降溫過程中，與常溫(21 ℃)處理后的種子相比，SOD的活性都顯著增加，這是種子自身固有的能夠響應(yīng)過冷溫度的機制。不管外加IAA濃度是多少，快速降溫后SOD活性增加量略高于慢速降溫。不論是快速降溫還是慢速降溫，IAA預(yù)處理濃度越高， SOD活性越低。在快速降溫過程中，這種隨IAA濃度下降的趨勢更加明顯。慢速降溫過程，施加200μmol/L IAA后SOD活性降到最低。

注：Control-21表示未經(jīng)程序降溫處理；S-20表示慢速降溫至-20 ℃；F-20表示快速降溫至-20 ℃。圖5 不同處理后ICE 1(a)基因和HOS 1基因(b)相對表達量

2.3.2 脯氨酸含量結(jié)果與分析

由圖4可知，在常溫(21 ℃)下，無論是否施加外源的IAA或者是施加濃度不同的IAA進行培養(yǎng)，不會造成內(nèi)部游離脯氨酸含量過多，并且其含量維持在較低的水平上。

不論是快速降溫還是慢速降溫后，當(dāng)生菜種子受到低溫脅迫時，與未經(jīng)處理相比，游離的脯氨酸會發(fā)生很大程度的提高。相比于慢速降溫，快速降溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的脯氨酸要高于慢速降溫。施加外源的IAA(100～500μmol/L)，能夠顯著提高脯氨酸的含量，這可能是脯氨酸合成機制中受到IAA的正調(diào)控。

注：Control-21表示未經(jīng)程序降溫處理；S-20表示慢速降溫至-20 ℃；F-20表示快速降溫至-20 ℃。圖4 不同處理后種子脯氨酸含量

2.4 IAA對冷相關(guān)的基因相對表達量的影響

2.4.1 低溫脅迫下ICE 1的表達量分析

ICE 1是冷誘導(dǎo)過程中的重要因子，在常溫條件下不活躍，但在遇到低溫脅迫時能特定結(jié)合在CBF3的啟動子上，隨后CBF3再結(jié)合在下游目的基因的啟動子上，誘導(dǎo)COR的表達，提高其抗寒性[15]。ICE 1基因編碼ICE 1，故ICE 1基因是與冷調(diào)節(jié)相關(guān)基因。

分析經(jīng)過處理后生菜種子ICE 1基因的相對表達量，結(jié)果如圖5 a所示。慢速降溫能夠?qū)е翴CE 1基因表達量的相對上調(diào)，而快速降溫則導(dǎo)致其表達量的相對下調(diào)，這說明降溫速率差異對ICE 1的基因表達有影響。但是，慢速降溫過程中，IAA抑制了ICE 1的表達，而快速降溫過程中IAA促進了ICE 1的表達，這與IAA明顯地促進快速降溫條件下的種子耐凍性一致。

2.4.2 低溫脅迫下HOS 1的表達量分析

HOS 1是調(diào)控ICE 1的一個泛素連接酶，調(diào)控ICE 1的水平[16]。HOS 1存在于細(xì)胞質(zhì)，在遇到低溫脅迫后，轉(zhuǎn)移在細(xì)胞核中積累，這個過程能使冷反應(yīng)的信息得到傳輸，從而產(chǎn)生響應(yīng)[17]，所以HOS 1基因也是與冷相關(guān)基因。分析HOS 1基因的相對表達量(圖5 b)可知，在常溫過程中，IAA濃度對HOS 1的表達量影響不大。 在程序降溫過程中，它與ICE 1的表達趨勢一致，即慢速降溫條件下其水平提高，而在快速降溫條件下水平受到抑制。施加IAA和程序降溫之后，HOS 1與ICE 1也表現(xiàn)出相同的變化趨勢。即在慢速降溫過程中，施加IAA抑制HOS 1基因表達；在快速降溫過程中，施加IAA濃度則促進HOS 1基因表達。這可能與HOS 1調(diào)控ICE 1的水平有關(guān)，所以其表達隨著ICE 1 mRNA水平變化而變化。

3 討 論

IAA是植物激素中最早被發(fā)現(xiàn)的一種，不僅僅是植物生長和發(fā)育過程中不可缺少的調(diào)節(jié)物質(zhì)，還能在植物遇到生物非生物脅迫過程中起到一定的調(diào)控作用，這包括能夠響應(yīng)低溫脅迫，所以說生長素通路是植物耐低溫機制中重要的組成部分[18]。Du H等的研究發(fā)現(xiàn)，在通常情況下，低溫處理會降低植物體內(nèi)IAA氧化酶活性，從而使IAA的含量上升，同時與IAA生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因會在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生改變，這些改變與內(nèi)源IAA水平保持一致[19]。所以可以得出結(jié)論，內(nèi)源IAA水平受到了低溫的控制。

本次研究對程序降溫后內(nèi)源IAA的變化進行測定，慢速降溫和快速降溫都能增加其含量，并且經(jīng)慢速降溫的IAA的含量明顯高于快速降溫處理后的IAA含量，這可能是因為慢速降溫造成了更長時間的低溫傷害，種子內(nèi)源合成更高水平的IAA來抵抗脅迫，這從側(cè)面證實了IAA在低溫冷凍脅迫中發(fā)揮一定的保護作用，另一方面，研究了外施IAA對種子抗寒性的影響，分別進行發(fā)芽率表型實驗以及SOD活性和脯氨酸含量的測定。發(fā)芽率是最直觀的判斷種子損傷程度的實驗，快、慢速降溫對種子產(chǎn)生了傷害，而施加外源的IAA對種子在降溫的過程中大多能起到一定的保護作用，這種保護作用在快速降溫中比較明顯，同時不同濃度IAA對種子在快速降溫中的保護作用差別不大。而在慢速降溫中，200μmol/L的IAA對其保護作用最佳。脯氨酸和SOD都是植物體內(nèi)有關(guān)抗逆境脅迫的指標(biāo)物質(zhì)。游離的脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)具有水溶性，能在細(xì)胞內(nèi)無毒性積累，保持滲透平衡，其含量越多，保護性能越強[20]。本實驗結(jié)果表明，程序降溫造成了脯氨酸含量的提高，其中快速降溫比慢速降溫含量提高的多，印證了快速降溫處理后發(fā)芽率更高的結(jié)果，表明抗寒性更強，并且其抗寒性與外源IAA濃度呈正比，暗示生長素通路調(diào)控內(nèi)源脯氨酸的積累，這與Kuraishi S等[21]的研究結(jié)果相一致。但是生長素調(diào)控脯氨酸的具體的作用機制還有待研究。

SOD能消除植物低溫脅迫產(chǎn)生的大量活性氧，從而使植物在低溫下存活[22]。由本實驗結(jié)果可知，程序降溫能導(dǎo)致SOD活性顯著增加。這可能是種子受到低溫傷害的結(jié)果。對種子以IAA進行預(yù)處理然后進行程序降溫，則 IAA預(yù)處理濃度越高，SOD活性越低。在快速降溫過程中，這種抑制作用更加明顯。SOD活性的高低顯示了種子受到冷凍傷害的程度。IAA可能通過降低種子的冷凍傷害程度，從而抑制了表觀SOD活性。慢速降溫過程，施加200μmol/L IAA后SOD活性降到最低，與該濃度發(fā)芽率顯著提高，也驗證了這一點。

對IAA與冷相關(guān)基因ICE 1、HOS 1相對表達量的關(guān)系進行研究，發(fā)現(xiàn)ICE 1基因在快速降溫中表達量的相對下調(diào)，而慢速降溫其表達量的相對上調(diào)?？傮w來說，慢速降溫過程中，IAA抑制ICE 1的表達，而快速降溫過程中IAA促進ICE 1的表達，這與IAA明顯地促進快速降溫條件下的種子耐凍性一致。與快速降溫不同，慢速降溫過程中，IAA表現(xiàn)出對ICE 1的抑制作用，這可能與不同降溫速率處理造成了不同的抗冷機制有關(guān)，還需要進一步研究。程序降溫和IAA處理后，HOS 1也表現(xiàn)出與ICE 1相同的表達變化趨勢，暗示兩者之間的直接調(diào)控關(guān)系。

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The Effect of IAA in Lettuce Seed on Cold Resistance Under Low Temperature Stress During Programmed Cooling

ZHANGChenxue,HANYingying,LIWeijie,LIUBaolin,SHENMengqi,ZHOUQiang

(School of Medical Instrument and Food Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China)

Seed is an important survival strategy for hibernating,and seed cryopreservation is the main way for germplasm resources conservation.In this paper,choosing lettuce seed as the object,and using programmed cooling apparatus to create different cooling rates(3 ℃/h and 60 ℃/h),study the mechanism of IAA responding to low temperature stress.The results showed that compared with fast cooling(60 ℃/h),slow cooling (3 ℃/h) is beneficial to the increasing of IAA;using IAA can reduce frozen hurt of the lettuce seed during the program cooling process,especially in 200μm IAA in slow cooling;regardless of cooling rate,SOD activity and proline content will increased significantly,and SOD activity was directly proportional to the IAA concentration,while proline content was having exactly the opposite effect;different cooling rates,and the concentrations of IAA can also influence to cold relative genes:ICE 1,HOS 1.

IAA； lettuce seed； cold hardiness； low temperature stress

2016-11-27

國家留學(xué)基金委出國留學(xué)項目資助(201308310174)。

張晨雪(1991—)，女，山東淄博人；碩士研究生，主要從事植物生物化學(xué)、分子生物學(xué)研究；E-mail:409096575@qq.com。

通迅作者：韓穎穎(1977—)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：yyhan2007@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.04.001

S 636.2

A

1001-4705(2017)04-0001-06