喹烯酮分子毒性機(jī)制研究進(jìn)展

李道穩(wěn) ， 林南昌 ， 王福云 ， 李 斌 ， 肖希龍 ， 湯樹(shù)生

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.福建省安溪縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 福建 安溪 362400)

喹烯酮分子毒性機(jī)制研究進(jìn)展

李道穩(wěn)1， 林南昌2， 王福云1， 李 斌1， 肖希龍1， 湯樹(shù)生1

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.福建省安溪縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 福建 安溪 362400)

喹烯酮是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧獸藥研究所最新研制的抗菌、促生長(zhǎng)藥物，其化學(xué)名稱(chēng)為3-甲基-2-苯乙烯酮基-喹噁啉-1,4 -二氧化物，分子式為C18H14N2O3，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。淡黃色或黃綠色粉末，不溶于水，略溶于部分有機(jī)溶劑，對(duì)光敏感[1]。近些年，有關(guān)學(xué)者重新對(duì)喹烯酮的毒性作用進(jìn)行了研究與評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)喹烯酮在體內(nèi)外均表現(xiàn)出潛在的遺傳毒性，能造成遺傳物質(zhì)的損傷。彗星試驗(yàn)和體外胞質(zhì)分裂阻斷微核試驗(yàn)檢測(cè)喹烯酮對(duì)Vero細(xì)胞及HepG2細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的作用，發(fā)現(xiàn)喹烯酮能夠引起細(xì)胞DNA和染色體的損傷[2]。最新的研究證明，喹烯酮對(duì)BALB/c小鼠也具有遺傳毒性，且與藥物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[3]。劉鳳英證明喹烯酮能誘導(dǎo)細(xì)胞S期阻滯，引起和染色體損傷[4]。張朝明證實(shí)了喹烯酮能引起肝癌細(xì)胞HepG2發(fā)生凋亡[1]。本文從喹烯酮誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、周期阻滯、腎上腺毒性等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)闡述其可能的分子機(jī)制，以期為喹烯酮對(duì)動(dòng)物和人的安全性研究及評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 喹烯酮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡涉及TNFR1/TNF-α和線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)通路

喹烯酮能破壞細(xì)胞的氧化還原平衡，促使細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高，過(guò)量的ROS攻擊細(xì)胞內(nèi)的DNA，產(chǎn)生氧化性損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷標(biāo)志物8-OHdG含量增加。線(xiàn)粒體和受體介導(dǎo)的凋亡途徑參與喹烯酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。喹烯酮促使細(xì)胞內(nèi)p38磷酸化水平升高，誘發(fā)TNF-α的合成增加，進(jìn)而作用于細(xì)胞表面高表達(dá)的TNFR1受體，通過(guò)招募FADD和Caspae-8形成DISC而活化Caspase-8。活化的Caspase-8剪切Bid蛋白生成tBid，tBid與其他Bcl-2家族蛋白Bax和Bcl-2等共同作用于線(xiàn)粒體，致使線(xiàn)粒體膜通透性增加，引起線(xiàn)粒體膜電位的下降，線(xiàn)粒體功能受損。線(xiàn)粒體膜通透性升高促使線(xiàn)粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放于胞質(zhì)，與Caspase-9等共同作用剪切Caspase-3使其活化?；罨腃aspase-3作用于細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)底物，或作用于PARP酶原使其發(fā)生剪切，失去修復(fù)DNA損傷的能力，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase-3的活化也可能是活化的Caspase-8直接作用的結(jié)果。JNK信號(hào)通路可能參與傳遞和放大受體途徑的凋亡信號(hào)。受體途徑中可能也有Fas蛋白的參與。p53可能通過(guò)調(diào)節(jié)p21和Bax等蛋白的表達(dá)對(duì)喹烯酮所致周期阻滯和細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)[5]，其作用機(jī)制如圖2。

圖1 喹烯酮化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 ML-7加強(qiáng)喹烯酮誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡通過(guò)AKT和MAPK介導(dǎo)的凋亡

ML-7是一種抗癌藥，通過(guò)對(duì)MLCK活性的抑制使得激動(dòng)蛋白活力降低，從而阻滯了多種癌細(xì)胞的增值和遷移。ML-7加強(qiáng)了喹烯酮引起的細(xì)胞毒性、內(nèi)源性和外源性凋亡；ML-7抑制了喹烯酮引起的Akt通路，激發(fā)了喹烯酮引起的MAPK家族通路，其中Akt、ERK、JNK起到促生存抑凋亡的作用，而p38 MAPK起到了促凋亡的作用?？偟膩?lái)說(shuō)，二者間的相互作用將細(xì)胞推向了死亡的方向[6]，其作用機(jī)制如圖3。

3 喹烯酮通過(guò)ATF6/DAPK1調(diào)節(jié)mAtg9a運(yùn)輸引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬

喹烯酮能夠引起HepG2細(xì)胞中以未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)為代表的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并且通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)自噬水平升高。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中UPR的重要分支ATF6被激活，受ATF6轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白DAPK1也同時(shí)受到激活。受DAPK1調(diào)控的mAtg9的轉(zhuǎn)運(yùn)也加強(qiáng)。但當(dāng)ATF6或DAPK受到抑制時(shí)，喹烯酮引起的自噬減少。因此，喹烯酮引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激了自噬，并且反應(yīng)由ATF6和DAPK1介導(dǎo)，并通過(guò)mAtg9調(diào)控自噬小體的生成[7]，其機(jī)制見(jiàn)圖4。

4 姜黃素降低喹烯酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)通過(guò)激活Nrf2/HO-1通路和抑制NF-kB信號(hào)通路

姜黃素(Curcumin)是從姜黃科植物提取的有效成分，抗癌譜廣，毒副作用小，價(jià)格低廉，還具有抗炎，抗氧化，抗癌等作用。姜黃素預(yù)處理能有效增加喹烯酮誘導(dǎo)L02細(xì)胞存活率和降低乳酸脫氫酶的活性，降低喹烯酮誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、線(xiàn)粒體功能失調(diào)和凋亡。姜黃素預(yù)處理顯著減少誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)和一氧化氮(NO)合成，下調(diào)NF-kB和iNOS mRNA水平，上調(diào)Nrf2和HO-1 mRNA水平。HO-1抑制劑(Zinc protoporphyrin IX)顯著降低姜黃素的保護(hù)作用通過(guò)降低Caspase激活和NF-kB mRNA水平。所以，姜黃素可以有效抑制喹烯酮誘導(dǎo)的凋亡，通過(guò)激活Nrf2/HO-1通路，抑制NF-kB通路[8]，其機(jī)制如圖5。

5 喹烯酮誘導(dǎo)線(xiàn)粒體凋亡通過(guò)ROS依賴(lài)性促進(jìn)VDAC1多聚化和抑制Wnt1/β-catenin通路信號(hào)

VDAC1是一個(gè)位于線(xiàn)粒體外膜上的蛋白，它在調(diào)節(jié)能量代謝和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。VDAC1抑制劑可以有效增加喹烯酮誘導(dǎo)的細(xì)胞活性和線(xiàn)粒體凋亡，通過(guò)減少VDAC1多聚化，降低細(xì)胞色素C的釋放和減少Caspase-3、Caspase-9和PARP的剪切。同時(shí)，高表達(dá)VDAC1增加喹烯酮誘導(dǎo)的VDAC1多聚化和細(xì)胞色素C的釋放。此外，Wnt1/β-catenin通路激活劑(LiCl)，顯著降低喹烯酮誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體凋亡，通過(guò)恢復(fù)Wnt1和β-catenin的表達(dá)水平。ROS清除劑(NAC)能阻斷喹烯酮誘導(dǎo)的VDAC1的多聚化和抑制Wnt1/β-catenin通路[9], 其機(jī)制如圖6。

6 喹烯酮誘導(dǎo)腎上腺毒性機(jī)制

喹烯酮(QCT)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，激活Keap1/Nrf2/ARE, JNK, p38 and ERK1/2通路，增加CYP17A1的表達(dá)，降低CYP11B2的表達(dá)。喹烯酮通過(guò)調(diào)控PKC和ERK通路來(lái)抑制FOS，結(jié)果使CYP17和CYP21活性增加，使CYP11B2和NR4A2活性降低，隨后降低了醛固酮的產(chǎn)生。喹烯酮誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起JNK和p38 MAPK介導(dǎo)的凋亡，導(dǎo)致BCL2的上調(diào)和醛固酮的降低。喹烯酮產(chǎn)生的氧化應(yīng)激使其下游的Keap1/Nrf2/ARE通路蛋白發(fā)生變化，比如下調(diào)HMOX1、NQO1、G6PD、SRXN1和TXNRD1。此外，喹烯酮誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS通過(guò)下調(diào)PFKP、NME1、ECH1、ALDH2、G6PD、TPI1、ENO2和上調(diào)NOX1來(lái)調(diào)控Keap1/Nrf2/ARE通路[10]，其機(jī)制如圖7。

總結(jié)與展望

喹烯酮作為一種新型獸藥，因其良好的抗菌活性和促生長(zhǎng)效應(yīng)被廣泛使用。從喹烯酮無(wú)毒副作用，在動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，喹烯酮具有潛在的毒性，對(duì)喹烯酮毒性的認(rèn)識(shí)是一個(gè)循序漸進(jìn)的過(guò)程。以上綜述的研究表明，喹烯酮可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、線(xiàn)粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、周期阻滯、腎上腺毒性等多種毒性反應(yīng)，涉及TNFR1/TNF-α、AKT/MAPK、ATF6/DAPK1、AKT/TSC2/p70S6K、Nrf2/HO-1/NF-kB、Wnt1/β-catenin和Keap1/Nrf2/ARE等多條信號(hào)通路，各信號(hào)通路之間既相互關(guān)聯(lián)又相互制約。但喹烯酮作用的靶器官、靶細(xì)胞毒性機(jī)制的研究尚不明確。近年來(lái)研究表明，N→O鍵的斷裂是喹噁啉類(lèi)藥物的主要代謝途徑，它產(chǎn)生的自由基包括ROS是導(dǎo)致其毒性的主要原因。但喹烯酮的毒性機(jī)制及分子作用機(jī)理仍有待完善，喹烯酮的毒性不容忽視，其作為飼料添加劑的安全性還有待更多實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)判。

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S816.7

A

0529-6005(2017)10-0077-02

2017-05-25

國(guó)家自然科學(xué)基金(31372486)

李道穩(wěn)(1990-)，男，博士生，從事獸醫(yī)藥理及毒理學(xué)研究，E-mail：lidaowen@cau.edu.cn

湯樹(shù)生，E-mail：tssfj@cau.edu.cn