蔬菜、茶葉中克百威酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

何方洋+馮才偉+杜美紅+王建霞+桑旭升+馮靜

摘要：為建立快速檢測蔬菜、茶葉中克百威殘留的酶聯(lián)免疫方法，合成克百威半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)合成人工抗原，然后免疫制備其單克隆抗體，在篩選克百威單克隆抗體的基礎(chǔ)上，建立酶聯(lián)免疫檢測方法。結(jié)果表明，Logit/Log擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-2.054x+0.667 3，相關(guān)系數(shù)（r）為0.998 5，半數(shù)抑制濃度（IC50）為2.3 μg/L，對蔬菜、茶葉樣本的檢測限分別為10、5 μg/kg，加標(biāo)回收率為79.2%～102.7%，樣本重復(fù)檢測的變異系數(shù)為5.5%～11.5%。結(jié)果表明，建立的酶聯(lián)免疫檢測方法具有較好的特異性、準(zhǔn)確性和重復(fù)穩(wěn)定性，可用于蔬菜、茶葉中克百威殘留的檢測。

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫法；克百威；蔬菜；茶葉；載體蛋白；單克隆抗體；半數(shù)抑制濃度；加標(biāo)回收率殘留；檢測

中圖分類號： TS207.5+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0213-03

克百威商品名呋喃丹，是一種廣譜、高效、藥效殘留期長的內(nèi)吸性殺蟲、殺螨、殺線蟲劑，廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果和糧食作物等的害蟲防治中[1]。因克百威對人和動物有很高的毒性，并且不易降解，容易造成環(huán)境污染，我國已規(guī)定食品中克百威的最大殘留限量，但違規(guī)使用現(xiàn)象仍然較多，因此加強(qiáng)對克百威農(nóng)藥殘留的檢測十分必要[2-5]。

目前，克百威殘留分析一般使用氣相色譜法（簡稱GC）[6]、高效液相色譜法（簡稱HPLC）[7-8]及色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[9-12]，這些方法靈敏、準(zhǔn)確，可以同時測定多種藥物，但樣品前處理復(fù)雜、繁瑣費時，且需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作人員，檢測成本高，難以滿足樣品現(xiàn)場、批量、快速檢測的需要。因此，開發(fā)一種簡單快速、適用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場監(jiān)控的分析方法具有重要意義。本研究基于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，建立了一種快速、靈敏的檢測蔬菜、茶葉中克百威殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌性Balb/c小鼠（6～8周齡），清潔級，由北京勤邦生物技術(shù)有限公司實驗動物室提供；呋喃酚、碳酰氯、克百威（純度≥99%）、牛血清白蛋白（簡稱BSA）、卵清蛋白（簡稱OVA）均購自Sigma公司；其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純；樣本提取劑：稱取4.40 g十二水合磷酸氫二鈉和13.68 g二水合磷酸二氫鈉，加入500 mL去離子水，溶解混勻。

1.2 儀器與設(shè)備

8010S勻漿機(jī)（上海斯伯明儀器設(shè)備有限公司）；2000SBL電子天平（美國Setra公司）；KS-Ⅱ振蕩器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；QL-901漩渦混合器（江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Anke TDL-40B低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）；微量移液器（單道20～200、100～1 000 μL，多道20～300 μL，美國Thermo公司）；DHP-600生化培養(yǎng)箱（天津市中環(huán)實驗電爐有限公司）；MK3酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 克百威半抗原的合成 合成路線見圖1。取呋喃酚1.0 g，加30 mL二氯甲烷溶解，加入碳酰氯，0～5 ℃反應(yīng)4 h，加入90 mL石油醚，靜置，底部有油狀物析出，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，分去上層有機(jī)相，油狀物加四氫呋喃溶解，然后加入2 mL含有甲胺的四氫呋喃溶液，0～5 ℃反應(yīng)2 h。停止反應(yīng)，旋蒸，除去四氫呋喃，得到紅色油狀物，上硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯（20 ∶ 1，體積分?jǐn)?shù)）洗脫分離，得到產(chǎn)物Ⅰ。取鋅粉 1.2 g，加蒸餾水和0.5 mL冰乙酸，80 ℃加熱活化30 min，加入含有產(chǎn)物Ⅰ的乙醇30 mL，60 ℃反應(yīng)4 h，TCL監(jiān)測，反應(yīng)已完全，停止反應(yīng)，過濾，除去鋅粉。乙醇水溶液蒸干，加水-乙酸乙酯萃取分離，分出有機(jī)相水洗干燥，石油醚-乙酸乙酯（30 ∶ 1，體積分?jǐn)?shù)）重結(jié)晶，即得到克百威半抗原產(chǎn)物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)用核磁共振鑒定。

1.3.2 人工抗原的制備 采用碳二亞胺法[13]，將克百威半抗原與牛血清白蛋白和卵清蛋白分別偶聯(lián)，作為免疫原和包被原。采用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）法[14-15]測定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比。

1.3.3 單克隆抗體的制備 按照常規(guī)方法免疫Balb/c小鼠制備腹水抗體，用飽和硫酸銨法純化后備用[13]。

1.3.4 間接競爭ELISA方法的建立 將包被原包被在96孔酶標(biāo)板上，100 μL/孔，37 ℃溫育2 h；倒去板中溶液，經(jīng)PBST洗滌3次，加入封閉液200 μL/孔，37 ℃溫育2 h；洗滌3次，加入系列濃度的克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL/孔和單克隆抗體溶液50 μL/孔，25 ℃避光反應(yīng)30 min；洗滌4～5次后，加入酶標(biāo)二抗100 μL/孔，25 ℃避光反應(yīng)30 min； 洗滌4～5次后加入底物液A液（過氧化脲）和B液（四甲基聯(lián)苯胺）各 50 μL/孔，25 ℃顯色15 min，加入2 mol/L H2SO4終止液 50 μL/孔，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處測定每孔吸光度。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用間接競爭ELISA方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別選擇克百威標(biāo)準(zhǔn)品濃度0.0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L，以濃度為0.0 μg/L時的吸光度為D0值，相應(yīng)克百威濃度的吸光度為D值，以百分吸光度（D/D0）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 樣本前處理方法的建立

1.3.6.1 蔬菜前處理方法 稱?。?.00±0.05）g均質(zhì)后的蔬菜樣品至10 mL聚苯乙烯離心管中，加入5 mL樣本提取劑，用振蕩器振蕩5 min，混勻，4 000 r/min室溫離心5 min；移取 200 μL 上清液至2 mL聚苯乙烯離心管中，加入600 μL樣本復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動2 min，充分混勻；取50 μL用于分析。endprint

1.3.6.2 茶葉前處理方法 稱取1 g茶葉樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入10 mL乙腈，用渦旋儀渦動1 min，混勻，4 000 r/min室溫離心5 min；移取1 mL上層有機(jī)相至 10 mL 潔凈干燥的玻璃管中，于20～30 ℃水浴氮氣流下吹干；加入1 mL樣本復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動2 min，充分混勻；取50 μL用于分析。

1.3.7 ELISA方法技術(shù)性能的評價

1.3.7.1 敏感性試驗 用IC50和檢測限來評價方法的靈敏度。測定20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50，統(tǒng)計其平均值和浮動范圍；測定20個空白樣本，求出其D/D0在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)濃度的平均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），方法檢測限MDL=x+3s。

1.3.7.2 準(zhǔn)確性和重復(fù)性試驗 用回收率和變異系數(shù)分別評價ELISA方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。以3個不同濃度的克百威標(biāo)準(zhǔn)品分別對空白馬鈴薯、黃瓜、白菜、茶葉樣本進(jìn)行添加回收試驗，計算回收率和變異系數(shù)。

1.3.7.3 特異性試驗 選擇與克百威具有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的其他農(nóng)藥進(jìn)行交叉反應(yīng)性檢測。按下式計算交叉反應(yīng)率：交叉反應(yīng)率=x/y×100%，式中x為引起50%抑制的克百威濃度，y為引起50%抑制的其他農(nóng)藥濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的核磁共振氫譜鑒定

取半抗原產(chǎn)物經(jīng)核磁共振（nuclear magnetic resonance，簡稱NMR）得圖2。從圖2可得，1H-NMR（CDCl3，300 MHz）δ：8.0（s，1H，—NH—），6.27（s，2H，—NH2），6.19（s，1H，ArH），6.31（s，1H，ArH），2.89（s，2H，—CH2—），2.58（s，3H，—CH3），1.46（s，6H，—CH3）。圖譜中δ=6.27的苯環(huán)上芳香胺特征吸收峰的存在，結(jié)合其他共振吸收峰的特征，證明克百威半抗原結(jié)構(gòu)正確。

2.2 半抗原與載體蛋白偶聯(lián)比的測定

由圖3得曲線公式為y=5.174 2x3-1.554 5x2+0.621 8x-0.004 8，根據(jù)公式得BSA抗原（免疫原）的偶聯(lián)比=335×（y2-y1），OVA抗原（包被原）的偶聯(lián)比=225×（y2-y1）。式中：y2為載體蛋白的氨基濃度，y1為偶聯(lián)抗原的氨基濃度。

結(jié)果顯示，BSA抗原（免疫原）測定出的吸光度為0.149，BSA測定出的吸光度為0.205，根據(jù)公式計算出y1=0.070 452 735，y2=0.101 917 517，偶聯(lián)比為335×（y2-y1）=335×（0.101 917 517-0.070 452 735）=10.54；OVA抗原（包被原）測定出的吸光度為0.121，OVA測定出的吸光度為 0.184，根據(jù)公式計算出y1=0.056 844 776，y2=0.089 214 748，偶聯(lián)比為225×（y2-y1）=225×（0.089 214 748-0.056 844 776）=7.28。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以百分吸光度（D/D0）為縱坐標(biāo)（y）、標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖4。以Logit（D/D0）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，將圖4轉(zhuǎn)換成圖5后可知，在 0.5～40.5 μg/L濃度范圍內(nèi)，Logit（D/D0）與克百威濃度對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，建立擬合回歸直線方程為 y=-2.054 0x+0.667 3，相關(guān)系數(shù)r為0.998 5，半數(shù)抑制濃度（IC50）為2.3 μg/L。

2.4 敏感性試驗

統(tǒng)計20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50平均值為2.2 μg/L，浮動范圍為1.5～3.0 μg/L；20個空白樣本的D/D0在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)濃度的平均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）見表1。綜合考慮幾種樣本的檢測限數(shù)據(jù)，本方法對蔬菜樣本的檢測限確定為5 μg/kg，對茶葉樣本的檢測限確定為10 μg/kg。

2.5 準(zhǔn)確性和重復(fù)性試驗

取空白馬鈴薯、黃瓜、白菜、茶葉樣本，按表2所述的克百威添加濃度對其進(jìn)行添加回收試驗，每個濃度做5個平行，用3個批次的試劑測定，分別計算回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)，結(jié)果見表2。由表2可知，以3個不同濃度的克百威標(biāo)準(zhǔn)品對空白馬鈴薯、黃瓜、白菜、茶葉樣本進(jìn)行添加，其添加回收率為79.2%～102.7%，批內(nèi)變異系數(shù)為5.5%～8.1%，批間變異系數(shù)為7.7%～11.5%，均小于15%，說明用該ELISA方法測定蔬菜、茶葉中克百威的殘留具有準(zhǔn)確性和重復(fù)性，可用于蔬菜、茶葉中克百威的殘留測定。

2.6 特異性試驗

選擇氨基甲酸酯類農(nóng)藥（丁硫克百威、甲萘威、異丙威、速滅威、滅多威、仲丁威）與有機(jī)磷類農(nóng)藥（甲胺磷、久效磷、敵敵畏）進(jìn)行交叉反應(yīng)性檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 選用的克百威單克隆抗體與丁硫克百威有一定的交叉反應(yīng)（11.8%），這可能是因為克百威作為丁硫克百威的代謝產(chǎn)物，有類似的結(jié)構(gòu)，而對其他農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率均較低（<1%），表明本方法具有良好的特異性。

3 結(jié)論與討論

酶聯(lián)免疫法因靈敏度高、特異性好、操作簡便、檢測成本低、一次性檢測樣本量大等特點，能夠更好地滿足我國食品企業(yè)、政府監(jiān)管部門等開展檢測工作。本研究初步建立了蔬菜、茶葉中克百威殘留檢測的酶聯(lián)免疫吸附法。該方法的IC50浮動范圍為1.5～3.0 μg/L，對蔬菜樣本的檢測限為5 μg/kg，對茶葉樣本的檢測限為10 μg/kg；樣本添加回收率為 79.2%～102.7%，重復(fù)檢測的變異系數(shù)為5.5%～11.5%，并且樣本前處理簡單、儀器設(shè)備投資少、檢測成本低，適用于大批量樣本中克百威殘留的快速篩選。

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