可溶性甘露聚糖受體sMR在膿毒癥中的表達(dá)水平及差異性研究

張文彬 常曉悅

可溶性甘露聚糖受體sMR在膿毒癥中的表達(dá)水平及差異性研究

張文彬1常曉悅2

目的探討可溶性甘露糖受體(Soluble Mannose Receptor，sMR)在膿毒癥(Sepsis)患者血清的表達(dá)水平，分析其在sepsis的診斷及病情嚴(yán)重程度判斷的價(jià)值。方法收集膿毒癥患者66例(膿毒癥40例，膿毒癥休克26例)及對(duì)照組18例，采集所有入組患者24小時(shí)內(nèi)的靜脈血，離心后保存上層血清于-80℃冰箱待測(cè)，采用ELISA法檢測(cè)血清中的sMR的水平。同時(shí)收集化驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果，入院的SOFA評(píng)分和APACHE II評(píng)分。所有數(shù)據(jù)和圖表均用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 17.0計(jì)算及處理。結(jié)果對(duì)照組、膿毒癥組、膿毒癥休克組血清sMR水平在三組的表達(dá)比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。膿毒癥組的PCT、sMR水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，感染指標(biāo)經(jīng)受試者工作特征曲線(The Receiver Operating Characteristic Curve，ROC)分析，ROC曲線下面積分別為：0.881/0.954。Sepsis、septic shock間比較，PCT在兩組間表達(dá)水平均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，而sMR的表達(dá)水平在兩組間具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。SOFA評(píng)分和APACHE II評(píng)分在sepsis和sepsis shock間差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，繪制診斷septic shock的ROC曲線，ROC曲線下面積分別為：0.910/0.972。Spearman秩相關(guān)分析顯示，在膿毒癥患者中sMR同PCT呈弱正相關(guān)性(0.2lt;rlt;0.4，Plt;0.05)，與APACHE II評(píng)分呈中等強(qiáng)度正相關(guān)性(0.4lt;rlt;0.6，Plt;0.05)，與SOFA評(píng)分呈強(qiáng)正相關(guān)性(0.6lt;rlt;0.8，Plt;0.05)。結(jié)論血清sMR水平在膿毒癥患者有應(yīng)用價(jià)值，可早期診斷膿毒癥，診斷效能優(yōu)于PCT，可鑒別膿毒癥的嚴(yán)重程度。

可溶性甘露糖受體；膿毒癥；降鈣素原；序貫器官衰竭估計(jì)評(píng)分；急性生理與慢性健康評(píng)分

膿毒癥(sepsis)是宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)，并產(chǎn)生危及生命的器官功能損害[1]。是危害公眾健康的重大問(wèn)題，也是國(guó)際醫(yī)療界的公認(rèn)難題。是危重病人的首要死亡原因，占醫(yī)院報(bào)告死亡率的30%-50%[2]。

由于其進(jìn)展快，早期診斷和早期治療變得尤為重要。但膿毒癥缺乏特異的臨床表現(xiàn),血培養(yǎng)是檢測(cè)血液感染的當(dāng)前黃金標(biāo)準(zhǔn)。然而由于培養(yǎng)周期長(zhǎng)，只有大約30%的患者血培養(yǎng)陽(yáng)性，血培養(yǎng)在膿毒癥早期診斷的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值有限[3]。

生物標(biāo)記物(Biomarkers)近年來(lái)是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)[4]，臨床應(yīng)用較成熟的兩個(gè)感染指標(biāo)，C-反應(yīng)蛋白(C-Reactive protein,CRP)和降鈣素原(PCT)，兩者均被用于2001年和2012年膿毒癥定義的炎癥感染指標(biāo)。其中PCT在2012年被納入國(guó)際膿毒癥和膿毒性休克治療指南用于膿毒癥的早期診斷[5]，然而其靈敏度和特異性低，臨床仍急需一個(gè)靈敏度和特異性均高的生物標(biāo)記物[6]。

甘露糖受體(MR)是先天免疫系統(tǒng)中重要的模式識(shí)別受體和內(nèi)吞受體,在維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)、識(shí)別病原、誘導(dǎo)細(xì)胞因子、抗原遞呈等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。MR可識(shí)別細(xì)胞或病原體表面多種糖分子和可溶性糖蛋白,可特異性識(shí)別以甘露糖、N-乙酞葡糖胺或巖藻糖為末端的配體[8]。這些糖類經(jīng)常出現(xiàn)于微生物的表面,通過(guò)識(shí)別、結(jié)合這些糖類以介導(dǎo)吞噬病原微生物。可溶形式的MR(sMR)，由內(nèi)源性細(xì)胞金屬蛋白酶對(duì)膜結(jié)合形式的蛋白水解切割釋放，sMR保留了MR的結(jié)合特性，且在外周血清中也有表達(dá)[9]，然而其釋放過(guò)程仍待研究。

來(lái)自于Sidsel Rodgaard-Hansen[10]等研究結(jié)果顯示血清sMR在膿毒癥患者的表達(dá)水平顯著升高，且其表達(dá)水平與感染指標(biāo)指標(biāo)正相關(guān)，是很有前景的生物標(biāo)記物。本研究通過(guò)對(duì)sMR在膿毒癥的表達(dá)水平及其差異的分析，探討其在膿毒癥患者的診斷、膿毒癥嚴(yán)重程度的鑒別和預(yù)后評(píng)估臨床應(yīng)用的價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集所有2015.12至2016.11包頭市中心醫(yī)院呼吸重癥監(jiān)護(hù)病房(RICU)、及重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)滿足膿毒癥診斷的病例。根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度不同分為sepsis、septic shock，并選取感染非膿毒癥組患者18例作為對(duì)照組。所有入組患者嚴(yán)格按照入選的標(biāo)準(zhǔn)選取，剔除符合排除標(biāo)準(zhǔn)的病例。膿毒癥納入標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2016年國(guó)際膿毒癥定義Sepsis3.0，對(duì)照組為感染+SOFAlt;2分。排除符合以下任一條件者：①年齡lt;18歲；②懷孕或哺乳期女性；③一年內(nèi)放、化療患者；④HCTlt;0.25；⑤大劑量糖皮質(zhì)激素應(yīng)用患者；⑥嚴(yán)重肝臟基礎(chǔ)疾病患者；⑦不同意參加本研究者。

二、研究方法

抽取患者入院24小時(shí)內(nèi)外周血3mL，置于EDTA管中，室溫靜置1-2小時(shí),然后置于離心機(jī)內(nèi) 以3000rpm離心20分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至EP管中并作好標(biāo)記，置于-80℃冰箱中保存待測(cè)?；颊叩囊话闩R床資料，記錄患者入組24小時(shí)內(nèi)的體溫、心率、血壓、呼吸頻率、吸氧濃度、動(dòng)脈血?dú)狻⒛蛩氐?、血清肌酐、總膽紅素、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞壓積、凝血功能、血小板計(jì)數(shù)、降鈣素原、序貫器官衰竭估計(jì)(Sequential Organ Failure Assessment，SOFA)評(píng)分和急性生理與慢性健康評(píng)分(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II，APACHEII)。

應(yīng)用ELISA法測(cè)定標(biāo)本中人可溶性甘露糖受體(sMR)水平，用純化的人可溶性甘露糖受體(sMR)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入可溶性甘露糖受體(sMR)，再與 HRP 標(biāo)記的可溶性甘露糖受體(sMR)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的可溶性甘露糖受體(sMR)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值)，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人可溶性甘露糖受體(sMR)濃度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)資料應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和圖的繪制，對(duì)正態(tài)分布的變量，采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean+SD)quot;的表示方式；非正態(tài)分布的變量采用“中位數(shù)+四分位數(shù)區(qū)間(Median,IQR)quot;表示。正態(tài)分布變量?jī)山M數(shù)值差異性比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)值差異比較采用單因素方差分析(ANOVA)。非正態(tài)分布的兩組數(shù)值變量差異性比較采用非參數(shù)的Mann-Whitney檢驗(yàn)；非正態(tài)分布多組數(shù)值變量差異性比較采用非參數(shù)的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；分類變量組間比較采用卡方檢驗(yàn)(Chi-square test，χ2test)；繪制ROC曲線來(lái)作為候選指標(biāo)在膿毒癥、膿毒癥休克的診斷和患者預(yù)后判斷效能指標(biāo)。指標(biāo)之間相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析(Spearman’s rank correlation)。以Plt;0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水準(zhǔn)。

結(jié) 果

一、本研究共收錄66例膿毒癥患者和18例非膿毒癥患者作為對(duì)照組，入組患者的一般資料和檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果及其統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表1)。對(duì)照組、sepsis、septic shock間年齡比較采用非參數(shù)的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，H值為0.006，P值0.997gt;0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。sepsis、septic shock間年齡差異比較非參數(shù)的Mann-Whitney檢驗(yàn)，Z值為-0.059，P值0.953gt;0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組和膿毒癥組間年齡差異性比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，Z值為-1.489，P值0.136gt;0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組、sepsis、septic shock三組間性別差異χ2值為1.328，P值為0.515gt;0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，sepsis、septic shock兩組間性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，對(duì)照組和膿毒癥組間性別差異性比較采用卡方檢驗(yàn)方差分析，其結(jié)果為χ2值為0.329，P值為0.556gt;0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PCT在三組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在sepsis、septic shock間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而sMR在三組間和sepsis、septic shock間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SOFA評(píng)分和APACHE II 評(píng)分在sepsis、septic shock間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體分析如下。

表1 入組患者的分布和部分檢驗(yàn)指標(biāo)

注：Plt;0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；p1為三組差異性比較；p2為sepsis、septic shock差異性比較。

二、感染指標(biāo)在三組間比較

入組患者入院時(shí)均收集臨床常用感染指標(biāo)白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞比率、降鈣素原，再加上本課題研究的血液標(biāo)記物可溶性甘露糖受體(sMR)。分別記錄其在各組的表達(dá)水平，探討其差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。sMR、PCT、中性粒細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞比率在三組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，而白細(xì)胞數(shù)在三組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)(見(jiàn)表1、圖1)。

三、感染指標(biāo)在對(duì)照組和膿毒癥組的比較

對(duì)照組和膿毒癥組間年齡和性別比較均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，兩組間年齡和性別對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)沒(méi)有影響。白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比率、降鈣素原PCT和sMR在對(duì)照組和膿毒癥組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，(見(jiàn)表2)。

表2 對(duì)照組與膿毒癥患者的比較

圖1 PCT、sMR在三組間的表達(dá)水平分布

四、感染指標(biāo)在膿毒癥的診斷價(jià)值

根據(jù)前面的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，膿毒癥組的白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞比率、PCT、sMR水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，各感染指標(biāo)ROC曲線下面積分別為：0.669(95%置信區(qū)間[confidence interval，cI]，0.542-0.796)、0.696(95%CI，0.575-0.817)，0.769(95%CI，0.659-0.879)，0.881(95%CI，0.799-0.963)，0.954(95%CI，0.903-1.000)，sMR的AUC高于其他感染指標(biāo)，選擇靈敏度和特異度之和最大的截?cái)帱c(diǎn)43.02pg/mL為介值時(shí)，其靈敏度為0.909，特異度為0.833，Youden指數(shù)為0.742，具有較高的診斷價(jià)值。sMR較PCT顯示出較好的早期診斷膿毒癥的效能。

五、sMR、SOFA、APACHE II在septic shock的診斷價(jià)值

sMR、SOFA和APACHE II在sepsis和septic shock間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，繪制septic shock的ROC曲線。sMR、APACHE II和SOFA的AUC分別為0.883、0.910、0.972，SOFA的診斷準(zhǔn)確度高于APACHE II。(見(jiàn)表1、圖3)。

圖2 sepsis的ROC曲線

圖3 septic shock的ROC曲線

六、血清sMR與PCT、SOFA、APACHEII評(píng)分、WBC的相關(guān)性分析

膿毒癥患者的sMR與PCT、SOFA評(píng)分、APACHE II評(píng)分、WBC進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，sMR同SOFA評(píng)分具有強(qiáng)正相關(guān)性(0.6lt;rslt;0.8，Plt;0.05)，同APACHE II評(píng)分具有中等強(qiáng)度正相關(guān)性(0.4lt;rslt;0.6，Plt;0.05)，同PCT具有弱正相關(guān)性(0.2lt;rslt;0.4，P=0.056)，同WBC基本不具備相關(guān)性(rslt;0，P=0.461)。(見(jiàn)表3)。

表3 sMR與PCT、SOFA、APACHEII評(píng)分、WBC的相關(guān)性分析

討 論

膿毒癥治療花費(fèi)高，醫(yī)療資源消耗大，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量，并可能隨著人口老齡化[11]大幅增加，已經(jīng)對(duì)人類健康造成巨大威脅。因此，2001年歐洲重癥學(xué)會(huì)、美國(guó)重癥學(xué)會(huì)和國(guó)際膿毒癥論壇發(fā)起“拯救膿毒癥運(yùn)動(dòng)”(surviving sepsis campain，SSC)[12]，SSC指南于2003年第一次制定，后于2008、2012年再次修訂。盡管應(yīng)用新的指南指導(dǎo)治療更加規(guī)范、及時(shí)，sepsis的發(fā)病率和死亡率仍居高不下。

MR介導(dǎo)了病原體的識(shí)別、吞噬與清除,參與了機(jī)體的先天與后天免疫。巨噬細(xì)胞在先天免疫系統(tǒng)中有重要地位，不僅是效應(yīng)細(xì)胞，也參與對(duì)病原體的免疫應(yīng)答，其表面受體標(biāo)記物在sepsis患者有研究?jī)r(jià)值。且其在血清中存放穩(wěn)定，在-20℃即可存放12個(gè)月，sMR的檢測(cè)應(yīng)用ELISA方法，檢測(cè)方便，具有良好的臨床研究及臨床應(yīng)用價(jià)值。

作為同位于單核巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表面的受體CD163，其可溶性形式sCD163作為感染的生物標(biāo)記物研究已顯示出其優(yōu)越性，然而sMR的具體分子生物學(xué)及生物學(xué)功能還未知，sCD163與sMR在巨噬細(xì)胞激活后有相似表達(dá)過(guò)程，具有相關(guān)性[13]。多項(xiàng)研究表明，sMR的水平升高與巨噬細(xì)胞活化、吞噬活動(dòng)增強(qiáng)相關(guān)[13-14]。林馮[15]及其團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果表面血清sCDl63水平可早期診斷膿毒癥及鑒別嚴(yán)重膿毒癥，其診斷價(jià)值優(yōu)于PCT、CRP。Anders G.等人[16]通過(guò)初步研究發(fā)現(xiàn)sMR對(duì)膿毒癥的診斷價(jià)值高于sCD163、CRP，R?dgaard-Hansen S[17]等人研究表明sMR在肺炎球菌導(dǎo)致的sepsis患者預(yù)后有意義，且其AUC高于sCD163、CRP，是一種新的很有前景的膿毒癥標(biāo)記物。

sMR與PCT同為感染性疾病生物標(biāo)記物，PCT已經(jīng)相對(duì)應(yīng)用成熟，且在臨床廣泛應(yīng)用。但其在膿毒癥的預(yù)后方面無(wú)應(yīng)用價(jià)值，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)降鈣素原水平對(duì)患者的早期抗生素治療或生存率無(wú)明顯改善[18]。其在鑒別細(xì)菌感染中有臨床應(yīng)用價(jià)值，然而其不能區(qū)分病毒、真菌等其他感染。本研究PCT、sMR水平在膿毒癥組均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，PCT的AUC為：0.881，靈敏度為0.833，特異度為0.833，sMR的AUC為0.954，其靈敏度為0.909，特異度為0.833。與Anders G等人研究結(jié)果相符，sMR可應(yīng)用于膿毒癥的診斷，且診斷效能優(yōu)于PCT，有臨床應(yīng)用價(jià)值。

此外危重評(píng)分系統(tǒng)由于應(yīng)用簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)，在sepsis的評(píng)估及預(yù)后判斷顯示出良好的應(yīng)用價(jià)值。APACHE II評(píng)分和SOFA評(píng)分是ICU應(yīng)用廣泛、操作簡(jiǎn)單，臨床應(yīng)用價(jià)值高的評(píng)分系統(tǒng)。SOFA評(píng)分更是被納入在Sepsis3.0的定義，SOFA評(píng)分的升高與死亡率正相關(guān)。sMR與APACHE II評(píng)分、SOFA評(píng)分在sepsis、septic shock組間和存活、死亡組間均有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，且sMR同SOFA評(píng)分具有強(qiáng)正相關(guān)性(0.6lt;rslt;0.8，Plt;0.05)，同APACHE II評(píng)分具有中等強(qiáng)度正相關(guān)性(0.4lt;rslt;0.6，Plt;0.05)，可聯(lián)合用于膿毒癥的診斷、預(yù)后的評(píng)估。

綜上所述血清sMR水平的檢測(cè)在膿毒癥患者的診斷有研究?jī)r(jià)值，具有較高的敏感度和特異度，值得深入研究。然而本課題為單中心研究，病例組沒(méi)有動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)sMR、PCT的水平變化。且樣本量偏少，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Researchontheexpressionlevelanddifferenceofsolublemannosereceptor(sMR)insepsispatients

ZHANGWen-bin,CHANGXiao-yue
BaotouMedicalCollege,Baotou014000,China

ObjectiveTo estimate the value of soluble scavenger receptor (sMR) on diagnosing sepsis and evaluating the severity of sepsis, and to compare the sensitivity/specificity between sMR and other infection index on the values of evaluating sepsis which are commonly used in clinics.MethodsThe study selected 66 sepsis patients (40 sepsis cases and 26 septic shock cases) and 18 control cases. Their serum were collected on the first days. The level of sMR in serum was detected by ELISA, and they were given Sequential Organ Failure Assessment (SOFA) score and Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II (APACHEII) score. Data calculation and processing were carried out by SPSS 17.0.ResultsThe concentration of sMR in serum among the control group, the sepsis and septic shock group was statistically significant (Plt;0.05). The levels of PCT and sMR in the sepsis group were higher than those in the control group. The area under the receiver operating characteristic curve (AUROC) for the prediction of sepsis were 0.881/0.954 for PCT and sMR respectively. The level of PCT showed no difference in the septic shock group and the sepsis group (Pgt;0.05), but it showed significant differences in sMR, APACHE II and SOFA between the two groups (Plt;0.05). The AUC for detection of septic shock were 0.883/0.910/0.972 for sMR, APACHEII and SOFA. sMR could distinguish septic shock from sepsis (Plt;0.05). Spearman rank correlation analysis showed sMR had a weak positive correlation with PCT (0.2lt;rlt;0.4,Plt;0.05), a middle positive correlation with APACHE II score (0.4lt;rlt;0.6,Plt;0.05), and a strong positive correlation with SOFA (0.6lt;rlt;0.8,Plt;0.05).ConclusionsMR may be a useful serum marker on early diagnosing sepsis, evaluating the severity, prognosis of sepsis and it is better than PCT.

sMR; sepsis; PCT; SOFA; APACHE II

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.12.006

1.014000 內(nèi)蒙古 包頭，包頭醫(yī)學(xué)院 2.014000 內(nèi)蒙古 包頭，包頭市中心醫(yī)院

常曉悅，Email:btchangxiaoyue@163.com

2017-03-10]