杜仲葉部?jī)?nèi)生真菌的抗氧化活性測(cè)定以及菌株鑒定

劉 洋,張弘弛

(山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009)

杜仲葉部?jī)?nèi)生真菌的抗氧化活性測(cè)定以及菌株鑒定

劉 洋,張弘弛

(山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009)

本研究利用體外清除DPPH自由基的方法，測(cè)定了5株杜仲葉部?jī)?nèi)生真菌的抗氧化活性。通過(guò)插片培養(yǎng)，性狀觀察，顯微攝影和分子鑒定對(duì)抗氧化活性高的杜仲內(nèi)生真菌進(jìn)行了分類研究。研究表明，這些杜仲內(nèi)生真菌對(duì)DPPH清除率具有劑量依賴性，其抗氧化能力隨樣品濃度的增加呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。在濃度為0.5 g/mL時(shí)，其中對(duì)DPPH自由基清除率在95 %以上的菌株有1株(EL05)，經(jīng)鑒定屬于曲霉屬。

杜仲；內(nèi)生真菌；抗氧化活性；顯微攝影；ITS序列

杜仲Eucommia ulmoides 是杜仲科杜仲屬植物，為我國(guó)特有的珍貴樹種，其樹皮經(jīng)過(guò)干燥可入藥，是名貴的滋補(bǔ)藥材[1]。杜仲含有多種天然藥物化學(xué)成分，包括木質(zhì)素、苯丙素、黃酮、多糖、脂肪酸等[2]。研究表明內(nèi)生真菌幾乎存在于所有的植物體[3]，其受到植物組織的良好保護(hù)，與寄主植物協(xié)同進(jìn)化，內(nèi)生真菌可從宿主植物中吸收營(yíng)養(yǎng)，也可通過(guò)自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用對(duì)植物產(chǎn)生積極影響[4]。

本論文研究的目的是從杜仲內(nèi)生真菌中尋找可以產(chǎn)生抗氧化活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌，為天然抗氧化劑的來(lái)源提供另一生物資源，為緩解中藥資源日益減少與藥用植物資源需求量的不斷增加之間的矛盾提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DPH-600電熱恒溫培養(yǎng)箱，金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；JA5003B千分之一電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；Boxun超凈工作臺(tái)，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Mult I skan FC酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司；LS-7SHD型立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海晶壇儀器制造有限公司。

甲醇，無(wú)水乙醇，乙酸乙酯，DPPH(0.2 mmoloL-1，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，別名1,1-二苯基-2-苦肼基)，1 %的水溶性苯胺藍(lán)，苯酚，甘油，所有試劑均為分析純。

1.2 材料和培養(yǎng)基

前期實(shí)驗(yàn)篩選出的5株源自杜仲葉部的產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌(EL01-EL05)，保存于山西大同大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)研究所。

察氏(固體)培養(yǎng)基：NaNO31 g，K2HPO40.5 g，KCl 0.25 g，MgSO40.25 g，F(xiàn)eSO40.005 g，葡萄糖15 g，(瓊脂10 g)，蒸餾水1000 mL，121 ℃，滅菌25 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 內(nèi)生真菌的發(fā)酵和產(chǎn)物提取

杜仲葉部?jī)?nèi)生真菌經(jīng)平板活化后，接種于含100 mL察氏液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中(10瓶)，28 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)15 d，發(fā)酵濾液減壓濃縮至100 mL以下，然后用乙酸乙酯萃取3次，濃縮后得粗提物配置成1 g·mL-1的樣品。

1.3.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定[5]

96孔板稀釋：取樣品100 μL置于96孔板的各排的第一孔中，其余11孔中均加入90 μL甲醇，將第一孔中取10 μL加入第二孔中，依次將樣品以10-1倍進(jìn)行稀釋，最后一孔取10 μL棄掉。然后在每孔中加入90 μL DPPH構(gòu)成180 μL測(cè)定體系，測(cè)得的數(shù)據(jù)取平均值為(Ai)。

同樣方法，96孔板每排的第一孔中加入各樣品100 μL，然后在每排的其余各孔中均加入90 μL甲醇，從第一孔取10 μL樣品加入第二孔，以10-1倍進(jìn)行稀釋，但不加DPPH，此為樣品對(duì)照，記錄數(shù)據(jù)為(Aj)。

取90 μL甲醇，90 μL的DPPH，作為空白對(duì)照測(cè)定吸光度。在96孔板的每塊板上，取3個(gè)孔加入上述試劑，記錄數(shù)據(jù)取均值為(Ac)。維生素C(Vc)為陽(yáng)性對(duì)照。按公式：清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%，計(jì)算清除率。

1.3.3 顯微攝影的實(shí)驗(yàn)方法[6]

插片培養(yǎng)：將4 ℃冰箱保藏的5株杜仲葉部?jī)?nèi)生真菌菌株用接種環(huán)挑取少量孢子(菌絲)，在平板培養(yǎng)基上以“Z字”劃線接種，然后以無(wú)菌接種于平板中，并在平板中插入無(wú)菌蓋玻片(以30°-40°角插入，深度約為蓋玻片的1/3長(zhǎng)度)。28℃，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

性狀觀察：每隔一段時(shí)間(12h或者24h)觀察。

制片檢查：將蓋玻片用鑷子取出，滴一滴1%的水溶性苯胺藍(lán)在合適的插片上靜置15min，并以乳酚油為浮載劑。

1.3.4 分子鑒定[7]

活性內(nèi)生真菌接種于察氏固體平板上，培養(yǎng)時(shí)間12 d，無(wú)菌低溫(液氮)研磨菌絲和孢子至粉末，CTAB法提取真菌DNA，然后以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增該菌株DNA序列。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送三聯(lián)兄弟生物醫(yī)藥研究(北京)有限公司測(cè)序，序列結(jié)果通過(guò)Blast比對(duì)分析，構(gòu)建聚類分析圖。

2 結(jié)果與討論

3.1 杜仲葉部?jī)?nèi)生真菌對(duì)DPPH 的清除效果

抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，杜仲葉部?jī)?nèi)生真菌的清除DPPH的能力隨樣品濃度的增加呈增長(zhǎng)趨勢(shì)(圖1)。在樣品質(zhì)量濃度為0.5 ×10-4g·mL-1以下，各內(nèi)生真菌的抗氧化活性差異性不明顯；樣品濃度在0.5×10-3g·mL-1至0.5 g·mL-1之間，EL04的抗氧化活性增長(zhǎng)緩慢，其他菌種出現(xiàn)快速增長(zhǎng)；在樣品質(zhì)量濃度為0.5 g·mL-1時(shí)，有2株菌株(EL03和EL05)表現(xiàn)出極高的清除DPPH自由基的能力，清除率在90%以上，表明這2株菌株在質(zhì)量濃度為0.5 g·mL-1時(shí)，DPPH已大致上被清除掉了；對(duì)DPPH自由基清除率在80%～90%的菌株有1株(EL01)；清除率在70%～80%的有1株(EL02)；清除率小于70%的有1株(EL04)；其中(EL05)的清除效果最佳，高達(dá)95.2%，而(EL04)的清除效果最弱僅為68.5%。

圖1 不同質(zhì)量濃度下對(duì)DPPH自由基的清除率

Fig.1 DPPH free radical at different concentrations

3.2 高抗氧化活性杜仲內(nèi)生真菌的菌落特征及菌種鑒定

圖2 EL05菌落形態(tài)及菌絲(×10)和孢子形態(tài)(×40)Fig.2 The colonial morphology of the strain EL05

圖3 菌株EL05菌落形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 The polymeric analysis of strain EL05

EL05的菌落特征：菌落菌落為乳白色，其上生有褐色隔膜，便于小顆粒孢子團(tuán)附著，菌絲有爬壁現(xiàn)象，培養(yǎng)基質(zhì)呈淺褐色。菌絲表面有有色物質(zhì)、有隔膜，分生孢子梗直立，頂端膨大成球形，上生1-2層放射狀分布的瓶狀小梗，分生孢子梗較長(zhǎng)，有隔膜，頂端有分枝，其上著生的串生分生孢子為球形(圖2)。PCR 擴(kuò)增后的ITS序列長(zhǎng)604bp，聚類分析圖(圖3)分析該菌株與多株Aspergillus sp.聚合在一起，因而EL05與Aspergillus sp.具有同源性，結(jié)合形態(tài)學(xué)分析(菌落觀測(cè)和顯微觀察)和ITS序列分析，EL05被鑒定為Aspergillus sp.。

3 結(jié)論

目前的抗氧化劑大多從植物中提取，從植物內(nèi)生真菌中提取抗氧化劑并不多[8-9]。本文對(duì)5株杜仲葉部?jī)?nèi)生真菌的抗氧化活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其在體外表現(xiàn)出較佳的對(duì)DPPH自由基的清除能力。尤其是菌株EL05，清除率高達(dá)95.2%，這為我們以后的實(shí)驗(yàn)研究提供了理論依據(jù)。此外還發(fā)現(xiàn)杜仲葉部?jī)?nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除率具有劑量依賴性。由于濃度的變化其清除DPPH的能力也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，而且是遞增的。此外，對(duì)活性菌株的鑒定結(jié)果表明，抗氧化能力在95%以上的菌株EL05屬于曲霉屬。

因此，通過(guò)此次對(duì)杜仲內(nèi)生真菌抗氧化活性的研究，發(fā)現(xiàn)其在天然抗氧化劑開發(fā)方面具有一定的潛力，為天然抗氧化劑的來(lái)源提供新思路。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(上冊(cè))[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1986:2090．

[2] 管淑玉,蘇薇薇.杜仲化學(xué)成分與藥理研究進(jìn)展[J].中藥材,2003,26(2):124-129．

[3] 郭良棟.內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J].菌物系統(tǒng),2001,20(1):148-152．

[4] Huang W Y, Cai Y Z, Xing J, et al. A potential antioxidant resource: endophytic fungus from medicinal plants [J]. Economic Botany, 2007, 61(1): 14-30.

[5] Kusari S, Lamshoft M, Zuhlke S, et al. An endophytic fungus from Hypericum perforatum that produces hypericin[J]. Journal of Natural Products, 2008, 71(2): 159-162.

[6] 劉 瑞,張弘弛,李 慧,等.一株恒山產(chǎn)蒙古黃芪內(nèi)生真菌Penicillium griseofulvum次生代謝產(chǎn)物的分離和菌種鑒定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2016,22 (16):25-29.

[7] 張弘弛,劉 瑞,李 慧,等.恒山黃芪內(nèi)生真菌Rhizopus sp.次生代謝產(chǎn)物的分離和鑒定[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2017,23(4):68-72.

[8] 錢 龍,楊明飛,冉雪琴,等.銀杏產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的分離與鑒定[J].山地農(nóng)業(yè)生物報(bào),2007,26(4):305-310.

[9] 朱欣婷,劉 云,李常春.粉背雷公藤內(nèi)生真菌抗氧化活性的初步研究[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥,2012,21(18):46-47.

(本文文獻(xiàn)格式：劉洋,張弘弛.杜仲葉部?jī)?nèi)生真菌的抗氧化活性測(cè)定以及菌株鑒定[J].山東化工，2017，46(20)：80-81，84.)

AntioxidantActivityofEndophyticFungithatProduceFlavonoidsfromEucommiaUlmoidesandIdentificationofStrains

LiuYang,ZhangHongchi

(College of Life Science, Shanxi Datong University, Datong 037009)

Using clearing DPPH free radicals in vitro, this experiment mainly determine antioxidant activity of 5 endophytic fungi from Eucommia ulmoides. The result showed that the endophytic fungi have a dose-dependent manner and their ability of clearing DPPH radicals has a growing trend with the increase of sample concentration. When the concentration is 0.5 g/mL, there are 1 strain which DPPH radical scavenging are more than 95 %. According to their morphology, cultural characteristics and ITS sequences, the strain EL05 was indentified as Aspergillus sp.

eucommia ulmoides;endophytic fungi;antioxidant activity;photographic photography;ITS sequences

2017-08-11

劉 洋(1995— )，在讀大學(xué)生；通訊作者：張弘弛(1980—)，博士，副教授，主要從事應(yīng)用微生物的研究。

Q939.9

A

1008-021X(2017)20-0080-02