寬皮柑橘種質(zhì)資源表型多樣性分析及綜合評(píng)價(jià)

孫珍珠，李秋月，王小柯，趙婉彤,2，薛楊,2，馮錦英,2，劉小豐,2，劉夢(mèng)雨，江東,2

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寬皮柑橘種質(zhì)資源表型多樣性分析及綜合評(píng)價(jià)

孫珍珠1，李秋月1，王小柯1，趙婉彤1,2，薛楊1,2，馮錦英1,2，劉小豐1,2，劉夢(mèng)雨1，江東1,2

（1西南大學(xué)柑桔研究所，重慶400712；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶400712）

分析寬皮柑橘的表型多樣性和遺傳變異規(guī)律，探討柑橘種質(zhì)資源的綜合評(píng)價(jià)方法。本研究利用變異系數(shù)、Shannon-Weaver多樣性指數(shù)及方差分析對(duì)239份寬皮柑橘的18種表型性狀進(jìn)行多樣性分析和性狀差異分析，用SPSS進(jìn)行聚類分析，通過主成分、相關(guān)性以及回歸分析對(duì)寬皮柑橘種質(zhì)資源進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)和評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選。對(duì)239份寬皮柑橘表型多樣性分析，變異系數(shù)結(jié)果表明種子數(shù)、固酸比、可滴定酸含量及單果重的性狀變異比較豐富，果形指數(shù)、囊瓣數(shù)及可溶性固形物含量的遺傳特性相對(duì)穩(wěn)定。遺傳多樣性指數(shù)結(jié)果表明，單果重、橫徑、縱徑、囊瓣數(shù)、葉柄長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉寬、還原糖含量及轉(zhuǎn)化糖含量在每一級(jí)分布比較均勻，果皮光滑度、種子數(shù)及固酸比分級(jí)較少，且在每個(gè)表現(xiàn)型上的分布不均勻。對(duì)5個(gè)不同地理來源的寬皮柑橘資源進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示來源于美國(guó)的寬皮柑橘品種可溶性固形物和轉(zhuǎn)化糖的含量平均值高于其他地理來源；來源于日本的寬皮柑橘單果重、橫徑和縱徑大于其他地理來源，種子數(shù)顯著少于其他地理來源；來源于長(zhǎng)江流域的寬皮柑橘品種的果型、可溶性固形物、轉(zhuǎn)化糖及還原糖含量大于珠江流域，但固酸比顯著低于珠江流域。對(duì)野生品種、地方品種、選育品種3種不同類型的寬皮柑橘性狀作方差分析，選育品種呈現(xiàn)果型大、果皮光滑、種子少、酸度低、糖度高等特點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹和主成分分析圖均表明不同地理來源、不同類型的寬皮柑橘在遺傳水平上存在明顯差異，中國(guó)小果資源可作為一個(gè)獨(dú)立類群，青皮蜜橘是一份獨(dú)特的柑橘資源。主成分分析發(fā)現(xiàn)，前9個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)81.94%，表明這9個(gè)主成分包含了寬皮柑橘表型性狀的大部分信息。表型性狀的綜合評(píng)價(jià)分析表明，239份寬皮柑橘綜合評(píng)價(jià)值均值為0.480，來源于日本的愛媛21號(hào)的值最高（0.664），來源于日本的扁橘值最低（0.211）。18個(gè)表型性狀與綜合值的相關(guān)性分析結(jié)果表明，除了果皮光滑度外的17個(gè)表型性狀數(shù)據(jù)均與值呈極顯著相關(guān)。采用逐步回歸分析方法，篩選出9個(gè)表型性狀：縱徑、果形指數(shù)、果皮光滑度、囊瓣數(shù)、葉柄長(zhǎng)、葉寬、可溶性固形物含量、可滴定酸含量以及還原糖含量。寬皮柑橘種質(zhì)資源具有較高的表型多樣性，不同地理來源、不同類型的寬皮柑橘性狀存在差異，篩選出的9個(gè)表型性狀可作為寬皮柑橘的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。

寬皮柑橘；表型多樣性；不同地理來源；綜合評(píng)價(jià)

0 引言

【研究意義】由于寬皮柑橘與柑橘屬其他種易發(fā)生種間雜交，且在長(zhǎng)期栽培和選育過程中產(chǎn)生了許多變異類型和實(shí)生后代，加上從其他國(guó)家引進(jìn)了大量品種，大大豐富了中國(guó)的寬皮柑橘資源[1]。因此，寬皮柑橘的遺傳多樣性較為豐富，對(duì)寬皮柑橘遺傳多樣性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，明晰寬皮柑橘資源的表型多樣性及其表型性狀的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)顯得非常重要，不僅可以發(fā)掘出具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的特異資源，對(duì)寬皮柑橘種質(zhì)資源的創(chuàng)新研究也具有積極促進(jìn)作用，同時(shí)也便于加強(qiáng)對(duì)寬皮柑資源的高效利用和基因資源的挖掘[2-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】王小柯等[4]利用GBS技術(shù)對(duì)240份寬皮柑橘進(jìn)行分類，與用植物形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果相吻合，表明寬皮柑橘按照傳統(tǒng)的植物學(xué)特征進(jìn)行分類劃分具有一定的合理性。開展柑橘遺傳多樣性的方法有很多，除了形態(tài)學(xué)鑒定[5]、孢粉學(xué)[6]、細(xì)胞學(xué)[7]、同工酶[8]、數(shù)值分類學(xué)[9]等常規(guī)方法外，還有已廣泛采用的分子標(biāo)記方法[10-19]等。CAMPOS等[20]利用形態(tài)鑒定和AFLP分子標(biāo)記的方法，對(duì)不同地理來源的63份寬皮柑橘種質(zhì)進(jìn)行多樣性研究，兩種方法的結(jié)果均表現(xiàn)為顯著的遺傳多樣性；劉勇等[9]對(duì)柚類33個(gè)品種65個(gè)形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行了品種數(shù)值分類研究，利用主成分分析選出影響力較大的18個(gè)性狀。李映志[21]采用SSR、RAPD等分子標(biāo)記對(duì)33份寬皮柑橘地方品種和19份野生柑橘品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，表明寬皮柑橘野生資源的遺傳多樣性都要高于地方品種。【本研究切入點(diǎn)】利用分子標(biāo)記技術(shù)可以更準(zhǔn)確地了解植物遺傳多樣性，但最終仍要跟表型性狀結(jié)合起來[22-23]，形態(tài)學(xué)方法是植物遺傳多樣性研究最直觀、最基礎(chǔ)的方法，通過形態(tài)學(xué)性狀遺傳多樣性研究，能從整體了解資源的豐富程度[23-24]，為全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）[25-27]提供可靠的表型數(shù)據(jù)，有利于挖掘重要的農(nóng)藝性狀基因。目前關(guān)于種質(zhì)資源多樣性和綜合評(píng)價(jià)研究的報(bào)道很多[28-30]，但對(duì)大樣本寬皮柑橘的表型多樣性研究和綜合評(píng)價(jià)國(guó)內(nèi)尚未報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對(duì)239份不同地理來源的寬皮柑橘地方品種、野生資源及國(guó)內(nèi)外選育品種表型性狀進(jìn)行多樣性分析，以揭示寬皮柑橘資源表型變異規(guī)律并篩選相對(duì)合理的表型評(píng)價(jià)指標(biāo)，為寬皮柑橘遺傳育種、發(fā)掘有利基因提供相應(yīng)的參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所有試材均來自于國(guó)家果樹種質(zhì)重慶柑橘資源圃，該圃位于重慶市北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn)，屬于中亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū)，年平均溫度18℃，年降水量1 100—1 300 mm。試驗(yàn)選取的239份寬皮柑橘來自17個(gè)國(guó)家、13個(gè)省（市）的239個(gè)寬皮柑橘品種為材料（具體材料名單見電子附表1），其中包括起源于中國(guó)南方地區(qū)的野生寬皮柑橘15份，地方品種77份，選育品種147份。為進(jìn)行不同地理起源材料的多態(tài)性分析，根據(jù)239份寬皮柑橘資源的地理起源將其劃分為5個(gè)生態(tài)區(qū)域類型：珠江流域（22份）、長(zhǎng)江流域（116份）、美國(guó)（14份）、日本（61份）以及其他國(guó)家（26份）。

1.2 數(shù)據(jù)收集

在2015、2016年連續(xù)兩年對(duì)239份寬皮柑橘的果實(shí)和葉片進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，選取樹勢(shì)中等、樹體健康的植株進(jìn)行采樣。葉片采樣定在春梢停止生長(zhǎng)期，隨機(jī)選取樹冠外圍春梢中部具有代表性的老熟葉片10片，果實(shí)從樹體各個(gè)方位隨機(jī)采取10個(gè)成熟果用于分析，對(duì)果實(shí)的單果重、橫徑、縱徑、果形指數(shù)、果皮光滑度、果皮厚度、囊瓣數(shù)、種子數(shù)、可溶性固形物、可滴定酸、抗壞血酸含量、固酸比、還原糖及轉(zhuǎn)化糖含量，對(duì)葉片采集葉柄長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉寬及葉形指數(shù)共18個(gè)農(nóng)藝性狀（反映果實(shí)、葉片表型及果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)）進(jìn)行測(cè)定。數(shù)據(jù)采集和整理方法參照《柑橘種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[31]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 多樣性分析 根據(jù)各性狀的平均觀測(cè)值（`x）與標(biāo)準(zhǔn)差（）進(jìn)行性狀等級(jí)的劃分，按照`x±（其中=0、0.5、1、1.5、2）將各個(gè)性狀（除果皮光滑度外）的觀測(cè)值劃分為1—10級(jí)，果皮光滑度分成6級(jí)，分別用1、2、3、4、5、6予以附值。

分布頻率：p=n/n，式中，p表示第個(gè)性狀第個(gè)變異的分布頻率，n表示第個(gè)性狀處于第個(gè)變異的材料個(gè)數(shù)，表示材料的總數(shù)。

利用變異系數(shù)（coefficient of variation，）表示某一性狀的離散程度。公式：=/（為標(biāo)準(zhǔn)差，為平均值）

利用Shannon-Weaver遺傳多樣性指數(shù)（index of genetic diversity，）表示任一組中某一性狀的多樣性程度。公式：

用SPSS19.0進(jìn)行方差分析，并采用平方歐式距離的方法進(jìn)行聚類分析。

1.3.2 根據(jù)品質(zhì)性狀對(duì)寬皮柑橘進(jìn)行綜合評(píng)價(jià) 用模糊隸屬函數(shù)計(jì)算出各個(gè)表型性狀的隸屬函數(shù)值，將各個(gè)性狀定義在[0，1]閉區(qū)間。模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)值計(jì)算公式為：U=（X-X）/（X-X）。其中，U表示第個(gè)品種第個(gè)變異的隸屬函數(shù)值；X表示第個(gè)品種第個(gè)變異的測(cè)定值；X和X分別表示各品種第個(gè)變異的最大和最小值。

綜合評(píng)價(jià)方法：（1）將標(biāo)準(zhǔn)化表型性狀數(shù)據(jù)代入每個(gè)主成分中，計(jì)算各個(gè)主成分的得分，根據(jù)各個(gè)主成分因子的重要程度，確定權(quán)重系數(shù)[32]，最后計(jì)算各份材料的的綜合得分（值），進(jìn)而篩選出優(yōu)異的種質(zhì)資源，再結(jié)合逐步回歸分析篩選綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。

以上數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析使用Excel和SPSS19.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 寬皮柑橘表型性狀遺傳多樣性

2.1.1 239份寬皮柑橘表型性狀的變化及分布特征 對(duì)239份寬皮柑橘的18個(gè)表型性狀進(jìn)行描述性分析，由表1可知，18個(gè)性狀的變異系數(shù)值介于9.51%—72.01%，平均值為30.59%，其中變異系數(shù)較大的為種子數(shù)、固酸比、可滴定酸含量和單果重，表明以上4個(gè)性狀變異幅度大，而變異系數(shù)較小的為果形指數(shù)、囊瓣數(shù)、可溶性固形物含量，表明這3個(gè)性狀變異幅度小，遺傳特性較為穩(wěn)定。遺傳多樣性指數(shù)值在1.40—2.06變化，均值為1.88，單果重、橫徑、縱徑、囊瓣數(shù)、葉柄長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉寬、還原糖及轉(zhuǎn)化糖含量的遺傳多樣性指數(shù)較大，表明這些性狀在每一級(jí)中的分布比較均勻；果皮光滑度、種子數(shù)及固酸比遺傳多樣性指數(shù)較小，表明這幾個(gè)性狀表現(xiàn)型較少，且在每個(gè)表現(xiàn)型上分布不均勻。

2.1.2 不同地理來源的寬皮柑橘的表型性狀差異 根據(jù)239份寬皮柑橘的地理起源，將其劃分為5個(gè)不同的生態(tài)區(qū)域類型，其中源于珠江流域占9.21%、長(zhǎng)江流域占48.54%、美國(guó)占5.86%、日本占25.52%，其他國(guó)家占10.88%，采用方差分析對(duì)不同區(qū)域?qū)捚じ涕俚谋硇托誀钸M(jìn)行比較。

由表2可以看出，除果形指數(shù)、果皮厚度、可滴定酸和抗壞血酸含量性狀差異不顯著外，其余14個(gè)性狀均存在顯著差異。其中源于日本的寬皮柑橘種質(zhì)，在單果重、橫徑、縱徑、葉柄長(zhǎng)、葉長(zhǎng)和葉寬上顯著大于其他地理來源的相應(yīng)性狀，而種子數(shù)顯著低于其他地理來源的種質(zhì)；來源于美國(guó)的寬皮柑橘種質(zhì)，可溶性固形物和轉(zhuǎn)化糖的平均含量高于其他地理來源的種質(zhì)。對(duì)比來源于珠江流域和長(zhǎng)江流域的寬皮柑橘可以看出，來源于長(zhǎng)江流域的寬皮柑橘單果重、橫經(jīng)、縱徑、可溶性固形物、轉(zhuǎn)化糖、還原糖含量均大于珠江流域的種質(zhì)，而固酸比顯著低于珠江流域的種質(zhì)。

表1 239份寬皮柑橘種質(zhì)資源18個(gè)性狀變化及分布特征

表2 不同地理來源的寬皮柑橘表型性狀的比較

同性狀間的不同字母表示在＜0.05水平下差異顯著。下同

Different letters indicate significant difference at＜0.05. The same as below

2.1.3 不同類型寬皮柑橘種質(zhì)的表型性狀比較 239份寬皮柑橘根據(jù)資源類型被分為野生資源（15份）、地方品種（77份）、選育品種（147份）3種類型。3種不同類型的寬皮柑橘的方差分析結(jié)果表明（表3），除果皮厚度、囊瓣數(shù)及葉長(zhǎng)差異不顯著外，其余性狀均存在顯著差異。單果重、橫徑、縱徑等幾個(gè)與果型大小相關(guān)的性狀不同類型之間存在顯著差異，且按野生品種、地方品種、選育品種的順序依次增大；野生資源的果皮光滑度、果形指數(shù)比其他兩種類型要小，說明野生資源的果皮比較粗糙，果形一般為扁圓型，而地方品種、選育品種果皮相對(duì)比較光滑，果形一般為高扁圓型；野生資源的葉形指數(shù)較大，葉片呈長(zhǎng)橢圓形，而地方品種、選育品種一般為橢圓形；選育品種的種子數(shù)顯著低于野生資源和地方品種。在果實(shí)的內(nèi)在品質(zhì)性狀方面，野生品種的可滴定酸含量顯著高于地方品種和選育品種，選育品種的可溶性固形物、還原糖、轉(zhuǎn)化糖等幾個(gè)與含糖量相關(guān)的性狀均最大。

表3 不同類型的寬皮柑橘表型性狀的比較

2.1.4 基于239份寬皮柑橘表型數(shù)據(jù)的聚類分析 根據(jù)表型數(shù)據(jù)對(duì)239份寬皮柑橘進(jìn)行聚類，結(jié)果見圖1，在歐式距離為10時(shí)，239份寬皮柑橘可以分為7個(gè)類群，類群Ⅰ（僅含有一份資源材料為青皮蜜橘，該種質(zhì)可滴定酸含量極低）；類群Ⅱ（大部分為可溶性固形物較高的品種，包括湘慈43號(hào)、費(fèi)爾柴爾德及一些優(yōu)異的雜交新品種）；類群Ⅲ是最大的類群（主要是橘橙類，還有少量的栽培種和溫州蜜柑，包括默科特橘、艾倫達(dá)爾、克里曼丁、砂糖橘及大浦溫州蜜柑等）；群體Ⅳ（包含大部分的溫州蜜柑以及少量的橘橙類品種，如久能溫州、杉山溫州、米澤溫州，明尼奧拉等）；群體Ⅴ（主要是大果型品種，包括不知火、春見、瀨戶見等）；類群Ⅵ（小果酸橘類型，包括印度酸橘、岑溪酸橘及廣西紅皮酸橘等）；類群Ⅶ（主要為小果類型的栽培種和野生種，包括本地早橘、南豐蜜橘、莽山野橘及道縣野橘等）。

2.2 寬皮柑橘表型性狀的綜合評(píng)價(jià)

2.2.1 表型性狀間的相關(guān)性分析 對(duì)239份寬皮柑橘的18性狀進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果見表4。18個(gè)表型性狀間存在不同程度的相關(guān)性。其中單果重這一性狀，除了與種子數(shù)、葉形指數(shù)、可溶性固形物、抗壞血酸及轉(zhuǎn)化糖含量之間相關(guān)性不顯著外，與其余性狀均有顯著或極顯著的相關(guān)性；葉柄長(zhǎng)與果形指數(shù)、葉形指數(shù)、可溶性固形物含量、固酸比及轉(zhuǎn)化糖含量之間的相關(guān)性不顯著，與其余性狀均存在一定的顯著相關(guān)性；果實(shí)的橫徑、縱徑及葉柄長(zhǎng)與單果重存在極顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.585、0.555和0.517，葉長(zhǎng)與葉寬存在極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.656，葉長(zhǎng)、葉寬與葉柄長(zhǎng)存在極顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.515、0.494；轉(zhuǎn)化糖、還原糖與可溶性固形物含量極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.646和0.536。

圖1 239份寬皮柑橘基于18個(gè)性狀的聚類圖

附表1 85 份谷子材料及其來源

Supplementary Table 1 The names and origins of 85 foxtail millet accessions

2.2.2 表型性狀的主成分分析 對(duì)18個(gè)表型性狀進(jìn)行主成分分析（表5），結(jié)果顯示前9個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)81.94%，表明前9個(gè)主成分代表了寬皮柑橘表型性狀的大部分信息。將每個(gè)主成分向量特征值除以其對(duì)應(yīng)成分的初始特征值的平方根，得到各個(gè)成分每個(gè)指標(biāo)的特征向量值，不同成分各個(gè)性狀特征向量值、特征值、累計(jì)貢獻(xiàn)率如表5所示。

第一主成分貢獻(xiàn)率最大，為18.49%，特征向量值較大的為縱徑、橫徑及單果重，說明第一主成分主要是與果實(shí)大小相關(guān)的性狀；第二主成分的貢獻(xiàn)率為12.43%，特征向量較大的為可溶性固形物、轉(zhuǎn)化糖及還原糖，說明第二主成分主要是與含糖量相關(guān)的性狀；第三主成分貢獻(xiàn)率為10.12%，其中抗壞血酸、固酸比及可滴定酸的特征向量值大于其他性狀，說明在第三主成分中上述3種性狀是主要性狀；第四主成分貢獻(xiàn)率為8.32%，葉寬的特征向量值最高；第五主成分貢獻(xiàn)率為8.23%，囊瓣數(shù)的特征向量值最高，其次是葉形指數(shù)，表明在第五主成分中囊瓣數(shù)、葉形指數(shù)為主要的性狀決定因子；第六主成分的貢獻(xiàn)率為6.81%，特征向量值最大的為葉長(zhǎng)；第七主成分貢獻(xiàn)率為6.15%，果形指數(shù)、種子數(shù)的特征向量值較大；第八主成分的貢獻(xiàn)率為5.78%，果皮光滑度的特征向量值最大；第九主成分的貢獻(xiàn)率5.66%，囊瓣數(shù)的特征向量值最大，表明第九主成分中的主要決定因子為囊瓣數(shù)。

表5 18個(gè)表型性狀前9個(gè)主成分的特征向量、特征值、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率

以第一主成分（果型大?。闄M坐標(biāo)、第二主成分（含糖量）為縱坐標(biāo)作主成分散點(diǎn)圖（圖2），將239份寬皮柑橘劃分為4個(gè)類群，類群Ⅰ（小果類型的酸橘和野生資源，包括廣西紅皮酸橘、粗皮狗屎柑、江津酸桔及聶都野桔等）；類群Ⅱ（其余寬皮柑橘及其雜種品種，包括椪柑、橘橙、溫州蜜柑、清見雜種后代等）；類群Ⅲ（只有一份材料為青皮蜜橘，屬于酸度極低的品種）；類群Ⅳ（包括1-2、1-14，兩份資源均為愛媛的雜種后代，是含糖量較高的資源）。

圖2 239份寬皮柑橘的主成分分析圖

2.2.3 寬皮柑橘表型性狀的綜合評(píng)價(jià) 為對(duì)寬皮柑橘進(jìn)行性狀的綜合評(píng)價(jià)，根據(jù)特征向量矩陣及標(biāo)準(zhǔn)化的表型數(shù)據(jù)得到主成分得分計(jì)算公式，第一主成分得分線性方程如下所示：

F=0.391+0.3920.4130.2340.1650.276+0.147-0.098+0.329+0.2210+0.2711-0.1612-0.0113-0.1914+0.0615+0.0616+0.2017+0.0818

將9個(gè)主成分得分用隸屬函數(shù)規(guī)一化處理，并根據(jù)各個(gè)主成分在該評(píng)價(jià)中的重要程度，人為確定各個(gè)主成分權(quán)重系數(shù)（0.35、0.25、0.02、0.05、0.10、0.05、0.03、0.05、0.10），最后得出每份種質(zhì)材料的綜合得分值（電子附表1），值越高表型綜合性越好，進(jìn)而對(duì)239份寬皮柑橘進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，239份寬皮柑橘平均值為0.480，其中來自日本的雜柑—愛媛21號(hào)，綜合得分值（值）最高（0.664），表明愛媛21號(hào)的性狀綜合表現(xiàn)最好；來源于日本的酸橘品種—扁柑，綜合得分（值）最低（0.211），表明扁柑的綜合表現(xiàn)最差。

將18個(gè)表型性狀與綜合值做相關(guān)性分析（表6），結(jié)果表明，除了果皮光滑度外，17個(gè)表型性狀數(shù)據(jù)均與值呈極顯著相關(guān)，其中種子數(shù)、葉形指數(shù)和可滴定酸與值呈極顯著負(fù)相關(guān)，其余13個(gè)性狀呈極顯著正相關(guān)。

表6 18個(gè)表型性狀與表型綜合值（F）間的相關(guān)系數(shù)

2.2.4 寬皮柑橘表型性狀綜合指標(biāo)的篩選 用得到的綜合值與表型性狀構(gòu)建回歸方程，進(jìn)一步篩選寬皮柑橘綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，構(gòu)建最優(yōu)回歸方程為：

=0.109+0.1163+0.0564+0.0555+0.1147+0.0899+0.09011+0.1113-0.04414+0.11617

其中3、4、5、7、9、11、13、14、17等分別代表縱徑、果形指數(shù)、果皮光滑度、囊瓣數(shù)、葉柄長(zhǎng)、葉寬、可溶性固形物、可滴定酸和還原糖含量9個(gè)性狀，其直接通徑系數(shù)分別為0.280、0.144、0.159、0.255、0.233、0.170、0.263、-0.072、0.218，方程相關(guān)系數(shù)和決定系數(shù)2分別為0.985**和0.971，表明9個(gè)表型性狀可決定總變異的97.1%。值為852.335，回歸方程達(dá)到極顯著水平，表明以上9個(gè)表型性狀可作為寬皮柑橘綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3 討論

3.1 寬皮柑橘的表型多樣性分析

本研究采用的239份試驗(yàn)材料涵蓋了寬皮柑橘的大部分類型，包含的種質(zhì)資源信息十分豐富，目前國(guó)內(nèi)還沒有對(duì)大樣本寬皮柑橘進(jìn)行表型多樣性分析的相關(guān)報(bào)道。關(guān)于寬皮柑橘多樣性分析的報(bào)道，高恒錦等[33]利用SSR、InDel及來源于lncRNA的分子標(biāo)記對(duì)中國(guó)不同地理區(qū)域的45份野生、半野生及地方寬皮柑橘資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，表明寬皮柑橘中的一些育成品種及雜柑資源具有較豐富的遺傳多樣性；KOEHLERSANTOS[16]利用表型鑒定和分子標(biāo)記結(jié)合的方法對(duì)來源于巴西南部的37份寬皮柑橘進(jìn)行多樣性研究，表型聚類和分子標(biāo)記聚類結(jié)果存在差異；DORJI等[34]對(duì)39份寬皮柑橘進(jìn)行表型多樣性分析，結(jié)果表明不同品種間的葉片和果實(shí)存在顯著差異，這和本研究的結(jié)果是一致的，本研究中主成分分析結(jié)果表明果實(shí)重量、果實(shí)大小和葉寬、葉長(zhǎng)性狀對(duì)不同寬皮柑橘資源表型差異具有較大貢獻(xiàn)。

不同地理來源的寬皮柑橘品種有其獨(dú)有的特性，來源于美國(guó)的品種，可溶性固形物和轉(zhuǎn)化糖高于其他地理來源品種，這與美國(guó)地區(qū)常用甜橙作親本進(jìn)行雜交育種有關(guān)，并且這類品種常具有晚熟的特性[4]。來源于日本的柑橘種子數(shù)顯著低于其他地理來源的品種，因?yàn)槿毡居N工作者偏好用溫州蜜柑、清見等少核品種作為親本，雜種后代也一般表現(xiàn)出少核的性狀。對(duì)不同類型的寬皮柑橘進(jìn)行比較可以看出，與野生品種、地方品種相比，選育品種呈現(xiàn)果型大、果皮光滑、種子少、酸度低、糖度高等特點(diǎn)，這與人們育種的目標(biāo)和方向是一致的。

系統(tǒng)進(jìn)化樹和主成分分析圖可以看出青皮蜜橘和中國(guó)的小果寬皮柑橘是較為獨(dú)特的兩個(gè)類群，其中青皮蜜橘是一份獨(dú)特的寬皮柑橘品種，其可滴定酸含量較低，而中國(guó)小果寬皮柑橘包含了較多的野生寬皮柑橘和酸橘類型資源，該結(jié)果與王小柯等[4]采用GBS進(jìn)行的分析結(jié)果是吻合的。同時(shí)也可以看出不同地理來源、不同類型的寬皮柑橘在遺傳水平上存在明顯差異，說明地理隔離是增加寬皮柑橘多樣性的一個(gè)重要因素，另外育種工作者在選擇雜交親本材料時(shí)，既要考慮材料的地理來源也要考慮類群的歸屬[35]。主成分分析圖篩選出了兩份含糖量較高的資源（愛媛的雜種后代1-2、1-14），一份酸度極低的資源（青皮蜜橘），這3份特異資源可以作為雜交育種的親本材料。

3.2 基于表型性狀對(duì)寬皮柑橘的綜合評(píng)價(jià)

本研究基于寬皮柑橘的表型性狀，采用隸屬函數(shù)、相關(guān)性和主成分分析結(jié)合的方法，對(duì)寬皮柑橘進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，此評(píng)價(jià)方法已在植物表型綜合評(píng)價(jià)[28-30]、耐酸堿砧木的綜合評(píng)價(jià)[36]等方面得到應(yīng)用。根據(jù)各個(gè)主成分在該評(píng)價(jià)體系的重要程度，人為給出各個(gè)主成分相應(yīng)的權(quán)重系數(shù)，對(duì)比按貢獻(xiàn)率確定權(quán)重系數(shù)的方法而言，此方法確定權(quán)重得到的結(jié)果更為可靠。通過比較綜合值值的大小篩選出的優(yōu)異種質(zhì)資源，可以做為雜交育種親本材料或優(yōu)異種質(zhì)在育種和生產(chǎn)中利用。

由于寬皮柑橘表型性狀較多，且彼此間存在一定相關(guān)性，對(duì)評(píng)價(jià)和利用寬皮柑橘資源產(chǎn)生一定的影響。本研究通過主成分分析、確定權(quán)重系數(shù)和逐步回歸分析的方法，篩選出9個(gè)性狀。上述性狀可作為寬皮柑橘的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，有利于種質(zhì)資源評(píng)價(jià)工作的開展以及種質(zhì)資源的高效利用，因此，在今后的柑橘評(píng)價(jià)工作中，這些表型性狀應(yīng)得到特別關(guān)注。

4 結(jié)論

利用表型鑒定對(duì)239份寬皮柑橘的18個(gè)表型性狀統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明寬皮柑橘有較高的表型多樣性，不同地理來源的寬皮柑橘種質(zhì)有其獨(dú)有的特性。日本地區(qū)的種質(zhì)表現(xiàn)為果型大、種子少的特點(diǎn)；沿長(zhǎng)江流域傳播的寬皮柑橘果型、可溶性固形物、轉(zhuǎn)化糖、還原糖含量均大于珠江流域，但固酸比顯著低于珠江流域。和野生品種、地方品種相比，選育品種的綜合表現(xiàn)和人們的育種目標(biāo)是一致的。群體進(jìn)化樹和主成分分析圖表明青皮蜜橘是一份獨(dú)特的柑橘資源，中國(guó)小果資源可作為一個(gè)獨(dú)立的類群。篩選出縱徑、果形指數(shù)、果皮光滑度、囊瓣數(shù)、葉柄長(zhǎng)、葉寬、可溶性固形物含量、可滴定酸含量及還原糖含量等9個(gè)性狀可作為鑒定寬皮柑橘的重要指標(biāo)。

[1] 鄧秀新. 中國(guó)柑橘品種. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2008.

DENG X X.. Beijing: China Agriculture Press, 2008. (in Chinese)

[2] 王洪新, 胡志昂. 植物的繁育系統(tǒng)、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性保護(hù). 生物多樣性, 1996, 4(2): 92-96.

WANG H X, HU Z A. Plant breeding system, genetic structure and conservation of genetic diversity., 1996, 4(2): 92-96. (in Chinese)

[3] 王永康, 吳國(guó)良, 趙愛玲. 棗種質(zhì)資源的表型遺傳多樣性. 林業(yè)科學(xué), 2014, 50(10): 33-41.

WANG Y K, WU G L, ZHAO A L. Phenotypic genetic diversity of jujube germplasm resources., 2014, 50(10): 33-41. (in Chinese)

[4] 王小柯, 江東, 孫珍珠. 利用 GBS 技術(shù)研究 240 份寬皮柑橘的系統(tǒng)演化. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(9): 1666-1673.

WANG X K, JIANG D, SUN Z Z. Study on phylogeny of 240 mandarin accessions with genotyping-by-sequencing technology., 2017, 50(9): 1666-1673. (in Chinese)

[5] 曾勉. 對(duì)柑橘分類的認(rèn)識(shí)體會(huì)和整理的意見. 中國(guó)果樹, 1962(2): 31-37.

ZENG M. The understanding and opinion of the citrus classification., 1962(2): 31-37. (in Chinese)

[6] 張映南, 李潤(rùn)唐, 蔣開軍. 幾種柑橘屬植物花粉外壁超微結(jié)構(gòu)比較研究. 果樹學(xué)報(bào), 2003, 20(3): 165-168.

ZHANG Y N, LI R T, JIANG K J. A comparative study on pollen exine ultrastructure of several citrIls., 2003, 20(3): 165-168. (in Chinese)

[7] 粱國(guó)魯. 柑桔類的細(xì)胞分類學(xué)研究. 武漢植物學(xué)研究, 1990, 8(1): l-7.

LIANG G L. Studies on the cytotaxonomy of citrus., 1990, 8(1): l-7. (in Chinese)

[8] 方德秋, 章文才, 蕭順元. 溫州蜜柑起源新探—同工酶證據(jù). 果樹學(xué)報(bào), 1995, 12(1): 16-20.

FANG D Q, ZHANG W C, XIAO S Y. Satsuma mandarin new origin of evidence – isoenzyme., 1995, 12(1): 16-20. (in Chinese)

[9] 劉勇, 孫中海, 劉德春, 吳波, 江東. 部分柚類品種數(shù)值分類研究. 果樹學(xué)報(bào), 2006, 23(1): 35-40.

LIU Y, SUN Z H, LIU D C, WU B, JIANG D. Study on numerical taxonomy of pomelo cultivars., 2006, 23(1): 35-40. (in Chinese)

[10] LI Y Z, CHENG Y J, YI H L, DENG X X. Genetic diversity in mandarin landraces and wild mandarins from China based on nuclear and chloroplast simple sequence repeat markers., 2006, 81(3): 371-378.

[11] KACAR Y, UZUN A, POLAT I, YESILOGLU T, YILMAZ B, GULSEN O, TUZCU O, KAMILOGLU M, KURT S, SEDAY U. Molecular characterization and genetic diversity analysis of mandarin genotypes by SSR and SRAP markers., 2013, 11(11): 516-521.

[12] BARKLEY N A, ROOSE M L, KRUEGER R R, FEDERICI C T. Assessing genetic diversity and population structure in a citrus germplasm collection utilizing simple sequence repeat markers (SSRs)., 2006, 112(8): 1519-1531.

[13] GARCIA-LOR A, LURO F, OLLITRAULT P. Genetic diversity and population structure analysis of mandarin germplasm by nuclear, chloroplastic and mitochondrial markers., 2015, 11(6): 1-15.

[14] FILHO H D C, MACHADO M A, TARGON M L P N, MOREIRA M C P Q D G. Analysis of the genetic diversity among mandarins (spp.) using RAPD markers., 1998, 102(1): 133-139.

[15] GULSEN O, ROOSE M L. Lemons: diversity and relationships with selected citrus genotypes as measured with nuclear genome markers., 2001, 126(3): 309-317.

[16] KOEHLERSANTOS, PATR CIADORNELLES, CUNHAFREITAS A L, DE L B O. Characterization of mandarin citrus germplasm from Southern Brazil by morphological and molecular analyses., 2003, 38(7): 797-806.

[17] ABKENAR A A, ISSHIKI S. Molecular characterization and genetic diversity among Japanese acid citrus (spp.) based on RAPD markers., 2003, 78(1): 108-112.

[18] PANG X M, HU C G, DENG X X. Phylogenetic relationships within Citrus and its related genera as inferred from AFLP markers., 2007, 54(2): 429-436.

[19] SIRAGUSA M, DE PASQUALE F, ABBATE L, TUSA N. Identification of sour orange accessions and evaluation of their genetic variability by molecular marker analyses., 2006, 41(1): 84-89.

[20] CAMPOS E T, WARBURTON M L, VARELA A S, MONTER A V. Characterization of madarin (spp.) using morphological and aflp markers., 2005, 206(5): 923-926.

[21] 李映志. 寬皮柑橘(Blanco)的遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

LI Y Z. Research on the genetic diversity and phylogenetic relationship of loose skin mandarins (Blanco) [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2006. (in Chinese)

[22] 陳巍, 王力榮, 朱更瑞. 基于SSR標(biāo)記和生物學(xué)性狀進(jìn)行桃遺傳多樣性的比較分析. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2009, 10(1): 86-90.

CHEN W, WANG L R, ZHU G R. Comparison of genetic diversity among peach cultivars based on biological traits and SSR markers., 2009, 10(1): 86-90. (in Chinese)

[23] 潘存祥, 許勇, 紀(jì)海波. 西瓜種質(zhì)資源表型多樣性及聚類分析. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2015, 16(1): 59-63.

PAN C X, XU Y, JI H B. Phenotypic diversity and clustering analysis of watermelon germplasm., 2015, 16(1): 59-63. (in Chinese)

[24] 田稼, 鄭殿升. 中國(guó)作物遺傳資源. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1994.

TIAN J, ZHENG D S.. Beijing: China Agriculture Press, 1994. (in Chinese)

[25] SONAH H, O'DONOUGHUE L, COBER E, RAJCAN I, BELZILE F. Identification of loci governing eight agronomic traits using a GBS-GWAS approach and validation by QTL mapping in soya bean., 2014, 13(2): 1-11.

[26] TIEMAN D, ZHU G, JR R M, LIN T, NGUYEN C, BIES D, RAMBLA J L, BELTRAN K S, TAYLOR M, ZHANG B. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor., 2017, 355(6323): 391-394.

[27] MORRIS G P, RAMU P, DESHPANDE S P, HASH C T, SHAH T, UPADHYAYA H D, RIERA-LIZARAZU O, BROWN P J, ACHARYA C B, MITCHELL S E. Population genomic and genome-wide association studies of agroclimatic traits in sorghum., 2013, 110(2): 453-458.

[28] 胡標(biāo)林, 萬勇, 李霞, 雷建國(guó), 羅向東, 嚴(yán)文貴, 謝建坤. 水稻核心種質(zhì)表型性狀遺傳多樣性分析及綜合評(píng)價(jià). 作物學(xué)報(bào), 2012, 38(5): 829-839.

HU B L, WAN Y, LI X, LEI J G, LUO X D, YAN W G, XIE J K. Analysis on genetic diversity of phenotypic traits in rice () core collection and its comprehensive assessment., 2012, 38(5): 829-839. (in Chinese)

[29] 王海崗, 賈冠清, 智慧. 谷子核心種質(zhì)表型遺傳多樣性分析及綜合評(píng)價(jià). 作物學(xué)報(bào), 2016, 42(1): 19-30.

WANG H G, JIA G Q, ZHI H. Phenotypic diversity evaluations of foxtail millet core collections., 2016, 42(1): 19-30. (in Chinese)

[30] 代攀虹, 孫君靈, 何守樸. 陸地棉核心種質(zhì)表型性狀遺傳多樣性分析及綜合評(píng)價(jià). 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(19): 3694-3708.

DAI P H, SUN J L, HE S P. Comprehensive evaluation and genetic diversity analysis of phenotypic traits of core collection in upland cotton., 2016, 49(19): 3694-3708. (in Chinese)

[31] 江東. 柑橘種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn). 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2006.

JIANG D.(spp). Beijing: China Agriculture Press, 2006. (in Chinese)

[32] 張海英, 韓濤, 王有年, 李麗萍. 桃果實(shí)品質(zhì)評(píng)價(jià)因子的選擇. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2006, 22(8): 235-239.

ZHANG H Y, HAN T , WANG Y N , LI L P. Selection of factors for evaluating peach () fruit quality., 2006, 22(8): 235-239. (in Chinese)

[33] 高恒錦, 儲(chǔ)春榮, 王小柯, 陳紹彬, 江東. 45份寬皮柑桔野生和地方資源遺傳多樣性分析. 中國(guó)南方果樹, 2016, 45(2): 1-9.

GAO H J, CHU C R, WANG X K, CHEN S B, JIANG D. The genetic diversity of landrace mandarin germplasms., 2016, 45(2): 1-9. (in Chinese)

[34] DORJI K, YAPWATTANAPHUN C. Assessment of morphological diversity for local mandarin (Blanco.) accessions in Bhutan., 2011, 7(2): 485-495.

[35] 萬述偉, 宋鳳景, 郝俊杰. 271份豌豆種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀遺傳多樣性分析. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2017,18(1): 10-18.

WAN S W, SONG F J, HAO J J. Genetic diversity of agronomic traits in 271 pea germplasm resources., 2017, 18(1): 10-18. (in Chinese)

[36] 王海崗, 陳凌, 王君杰, 曹曉寧, 董俊麗, 王綸, 楊天育, 喬治軍. 20份山西糜子種質(zhì)資源抗旱性綜合評(píng)價(jià). 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2014, 16(36): 1916-1920.

WANG H G, CHEN L, WANG J J, CAO X N, DONG J L, WANG L, YANG T Y, QIAO Z J. Comprehensive assessment of drought resistance of 20 proso millet germplasm resources in whole growth period., 2014, 16(36): 1916-1920. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Comprehensive Evaluation and Phenotypic Diversity Analysis of Germplasm Resources in Mandarin

SUN ZhenZhu1, LI QiuYue1, WANG XiaoKe1, Zhao WanTong1,2, XUE Yang1,2, FENG JinYing1,2, LIU XiaoFeng1,2, LIU MengYu1, JIANG Dong1,2

(1Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712;2Citrus Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712)

The objective of this study is to evaluate some major phenotypic characteristics diversity of mandarin germplasms and explore the comprehensive method for screening important mandarin germplasm resources.The diversity evaluation of 18 phenotypic traits in 239 mandarin accessions were carried out. Variation coefficients, Shannon-Weaver Information index cluster analysis, principal component analysis, correlation and regression analysis were comprehensively used to evaluate the relationship of characteristics and select important characteristics.Based on the variation coefficient of 239 mandarins, large variations were found in the traits of seed numbers per fruit (SNF), the ratio of soluble solids to titratable acidity (TSS/TA), the contents of titratable acid (TA), fruit weight (FW), while genetic characteristics of fruit shape index(FSI), segment numbers per fruit (SNPF), the contents of total soluble solids (TSS) kept relatively stable. Shannon-Weaver Information index showed that the diversity level of FW, fruit diameter (FD), fruit length (FL), SNPF, petiole length (PL), leaf lamina length (LLL), leaf lamina width (LLW), the contents of reducing sugar (RS) and invert sugar (IS) were high, while fruit surface texture(FST), SNF, TSS/TA had low diversity level. The variance analysis was conducted to evaluate the trait difference of 239 mandarin accessions, which divided into five different geographical origins. The result showed that mandarin accessions from America have higher average contents of TSS and IS; the mandarin accessions from Japan have larger FW, FD and FL and lower SNF. Mandarin accessions from the Yangtze River Basin were larger fruit size, higher contents of the TSS, RS and IS than the Pearl River Basin, but lower TSS/TA. Variance analysis for wild germplasms, landraces and bred varieties showed that bred accessions have larger fruits, smoother peels, fewer seeds, lower contents of TA and higher contents of sugar content. Both the cluster analysis and PCA suggested genetic variations were presented in different geographical origins. Small fruit type accession from China should be thought as an unique subgroup, Green Peel Mi Ju is an unique citrus accession. Principal component analysis showed that the variation cumulative contribution rate of the first nine principal components was accounted for 81.94%. The averagevalue from the comprehensive evaluation of phenotypic traits of 239 mandarins was 0.480. The highestvalue (0.664) was given to Ehime Kashi No.21 from Japan. The lowestvalue (0.211) was Shikuwasha. The correlation analysis between the phenotypic traits andvalue showed that the phenotypic traits except FST were significantly correlated with thevalue. Nine phenotypic traits, including fruit length (FL), FSI, FST, SNPF, PL, LLW, the contents of TSS, TA and RS, were selected out as evaluation indexes by stepwise regression analysis.Mandarin accessions presented large phenotypic diversity. The traits difference of the accessions from different geographical origins or germplasm types are great. Nine phenotypic traits could be used as important evaluation charaterisitics for screening unique mandarin.

mandarin; phenotypic diversity; different geographical origins; comprehensive evaluation

2017-05-27；

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃（2013BAD01B04）、重慶市科委重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc2016shms-ztzx80004）

接受日期：2017-08-24

聯(lián)系方式：孫珍珠，Tel：18375735360；E-mail：sunzhenzhu417@163.com。通信作者江東，Tel：13983194771；E-mail：jiangdong@cric.cn