高效液相色譜法測定金絲桃屬兩種藥用植物中金絲桃苷的含量※

胡蕊艷 王曉桐 李 潔 孟令鍇

高效液相色譜法測定金絲桃屬兩種藥用植物中金絲桃苷的含量※

胡蕊艷1王曉桐1李 潔2孟令鍇3

目的建立測定兩種金絲桃屬藥用植物烏腺金絲桃、長柱金絲桃中金絲桃苷的高效液相色譜分析方法。方法采用高效液相色譜法，色譜柱為ZorbaxSB-C18柱，流動相為甲醇:乙腈:0.025 mol/L磷酸（10:20:70），流速1.0 ml/min，檢測波長 358 nm，柱溫 30 ℃。結(jié)果金絲桃苷在 0.0062～0.0622 mg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與色譜峰面積呈良好線性關(guān)系（r=0.9991）；平均回收率為96.41%，RSD=1.27%。結(jié)論該法操作簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性及重復(fù)性好，可用于對長柱金絲桃和烏腺金絲桃中金絲桃苷的含量測定。

長柱金絲桃；烏腺金絲桃；金絲桃苷；高效液相色譜法；含量測定

金絲桃屬（Hypericum.L.）植物全世界約有400余種，我國有55種，8亞種。黑龍江省分布的金絲桃屬植物有兩種，分別為烏腺金絲桃（H.attenuatumChoisy.）和長柱金絲桃（Hypericum.ascyron L.）。近年來，研究表明該屬植物的一些種類含有黃酮類、雙蒽酮衍生物等化合物，具有抗病毒、抗抑郁的活性[1-2]，其含有的金絲桃素對禽流感病毒（H9亞型）有抑制作用，目前已得到醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注[3]。該屬植物含有的黃酮醇、黃烷醇類化合物，尤其金絲桃苷也是該屬植物的主要活性成分之一。本實驗采用高效液相色譜法（HPLC）對黑龍江省野生金絲桃屬長柱金絲桃、烏腺金絲桃藥材中金絲桃苷成分進(jìn)行含量測定并比較分析，為合理開發(fā)黑龍江省金絲桃屬藥用資源提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器高效液相色譜儀（Agilent1100）；超聲波清洗器（TCQ-250）；紫外-可見分光光度計（UV7501）；電子天平（BP211D）。

1.2 試藥金絲桃苷對照品（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：111521-200305）；乙腈、甲醇為色譜純，實驗用水為自制雙蒸水，其余實驗試劑為分析純。烏腺金絲桃、長柱金絲桃采收于2016年4—10月，采收地及采收期見表 1，經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院吳兆華教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 對最大吸收波長的選擇取實驗用金絲桃苷對照品溶液進(jìn)行光譜掃描，實驗表明對照品溶液在358 nm波長處有最大吸收，分離效果良好，干擾少，因此，選擇檢測波長為358 nm。

表1 實驗樣品的采收地及采收期

2.2 流動相的選擇試用多種溶劑系統(tǒng)，最終確定以甲醇:乙腈:0.025 mol/L磷酸（10:20:70）為流動相時金絲桃苷分離效果好，保留時間適宜。

2.3 色譜條件色譜柱：Zorbax SB-C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），流動相：甲醇:乙腈:0.025 mol/L磷酸（10:20:70），流速1.0 ml/min，檢測波長為363 nm，柱溫：30 ℃。在此條件下，金絲桃苷能與其他成分很好分開，金絲桃苷的保留時間為5.5 min。色譜圖見1-3。

圖1 對照品高效液相色譜圖(1為金絲桃苷)

圖2 烏腺金絲桃樣品高效液相色譜圖(1為金絲桃苷)

圖3 長柱金絲桃樣品高效液相色譜圖(1為金絲桃苷)

2.4 實驗藥材中金絲桃苷的提取方法選擇取烏腺金絲桃花期藥材4份，每份約0.5 g。分別采用甲醇、乙醇兩種溶劑，采用超聲提取法進(jìn)行試驗比較，確定提取方法。結(jié)果見表2。

表2 提取方法對比結(jié)果

2.5 金絲桃苷的HPLC測定

2.5.1 對照品溶液的制備精密稱取金絲桃苷對照品適量，加甲醇溶解于10 ml容量瓶中，制成0.0622 mg/ml的對照品儲備液。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取上述儲備液1.0、2.5、5.0、6.0、7.5、10.0 ml于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋，進(jìn)樣，按2.3項下色譜條件測定，以對照品濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：Y=228 38x+66.812，r=0.9991，表明金絲桃苷在0.0062～0.0622 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 方法學(xué)考察

2.5.3.1 精密度實驗精密吸取對照品儲備液10 μl，進(jìn)樣6次，金絲桃苷峰面積RSD=0.54%。結(jié)果見表3。

表3 精密度實驗結(jié)果

2.5.3.2 穩(wěn)定性實驗取對照品溶液（0.0497 mg/ml）10 μl，分別于0、1、2、4、8 h各進(jìn)樣1次，測得金絲桃苷峰面積值RSD=0.94%，表明對照品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表4。

2.5.3.3 重現(xiàn)性實驗取同時期烏腺金絲桃樣品平行5份（0.4970 g、0.4959 g、0.4975 g、0.4911 g、0.4991 g），照樣品測定方法測定，結(jié)果藥材含量分別為0.8491%、0.8457%、0.8501%、0.8910%、0.8540%。RSD=2.18%。結(jié)果見表5。

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

表5 重現(xiàn)性實驗結(jié)果

2.5.3.4 加樣回收率實驗精密稱取烏腺金絲桃藥材（含量已測知），分別精密加入金絲桃苷對照品溶液，按照2.5.4項下樣品制備與測定方法，進(jìn)行平行實驗 6組。得到金絲桃苷回收率為 96.41%，RSD=1.27%。結(jié)果見表6。

表6 金絲桃苷回收率測定結(jié)果

2.5.4 藥材含量測定取藥材0.5 g，置于量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min后，放冷，稀釋至刻度，搖均，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μl，注入色譜儀，記錄峰面積，計算含量。測定結(jié)果見表7。

表7 不同產(chǎn)地、不同采收期藥材中的金絲桃苷含量(n=6)

3 討論

本實驗樣品分別在甲醇、乙醇中分別超聲提取30 min、60 min，含量測定結(jié)果表明，甲醇超聲提取60 min時金絲桃苷含量最高，與其他提取條件下金絲桃苷含量相差不大，金絲桃苷可在30 min內(nèi)較好地溶解，且發(fā)現(xiàn)甲醇為溶劑的供試品溶液峰形較好，重現(xiàn)性高，故實驗采用甲醇為提取溶劑，超聲30 min提?。稽S酮苷類成分在高效液相測定時易拖尾，流動相加入酸時可抑制拖尾[4]。曾選用流動相為甲醇:0.025 mol/L磷酸（70:30）、甲醇:0.025 mol/L磷酸（50:50）、甲醇:0.025 mol/L磷酸（40:60），峰形對稱性不好，峰較寬，分離度低，而后經(jīng)過反復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)，加入一定量的乙腈后，有了改善峰形，提高了分離度，最終確定流動相為甲醇:乙腈:0.025 mol/L磷酸（10:20:70），經(jīng)多次、多批樣品的測定，系統(tǒng)具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

在本實驗過程中同時進(jìn)行了長柱金絲桃的實驗方法考察，因其方法與烏腺金絲桃一致，故只在文中表述了一種，在此條件下可以提取完全，對其他共存成分無影響。根據(jù)文獻(xiàn)報道，長柱金絲桃中金絲桃苷含量最高的時期為花期[5]，因而選取花期為特征性指標(biāo)進(jìn)行含量測定。

4 結(jié)論

通過對不同采收地的長柱金絲桃、烏腺金絲桃樣品中金絲桃苷的含量測定結(jié)果表明：伊春地區(qū)烏腺金絲桃樣品中金絲桃苷的含量高于牡丹江地區(qū)、高于佳木斯地區(qū)。伊春地區(qū)長柱金絲桃樣品中金絲桃苷的含量高于佳木斯地區(qū)。由此可以初步推斷，野生金絲桃屬植物生長環(huán)境的不同，其金絲桃苷的含量存在一定的差異。因此，在人工栽培金絲桃屬植物時應(yīng)考慮其生長環(huán)境如溫度、土壤等因素，選擇適合的栽培區(qū)域。同時，通過對不同采收時期的烏腺金絲桃樣品中金絲桃苷含量測定，表明花期烏腺金絲桃樣品中金絲桃苷的含量高于花前期、高于果期、高于幼苗期，由此可以建議烏腺金絲桃的最佳采收期為花期。

[1] 宋馨,祝建,呂洪飛.金絲桃屬植物研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報,2005,25(4):844-849.

[2] Linfang Huang,Shilin Chen.Hypericin in hypericum: chemistry,botanical sources and biological activities[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,2012,21(5):388-400.

[3] 韋蘭萍,陳建新,何子華,等.金絲桃素體外抗H9N2亞型禽流感病毒活性研究[J].動物醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展,2010,31(12):68-72.

[4] 黃琪,賈鵬暉,肖曦晨,等.HPLC 法分析比較亳州知母須根和主根中芒果苷和知母皂苷B-Ⅱ的含量[J].中醫(yī)藥臨床雜志,2016,28(12):1773-1776.

[5] 毛晶磊,王文凱.不同采收期及藥用部位的長柱金絲桃中有效成分的含量變化[J].中南藥學(xué),2012,10(8):594-597.

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.11.008

1牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院2013級，黑龍江牡丹江 157011

2牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院血液科，黑龍江牡丹江 157011

3牡丹江醫(yī)學(xué)院天然藥物化學(xué)與生藥學(xué)教研室，黑龍江牡丹江 157011

黑龍江省黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（編號：201610229052）；牡丹江醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研項目（編號：201641）

作者簡歷：胡蕊艷（1994-），本科學(xué)歷。E-mail：1442874067@qq.com

孟令鍇（1980-），碩士學(xué)位，講師。主要研究方向為生藥鑒定及品質(zhì)評價。E-mail：mlk720@163.com