寶藿苷I減輕急性神經(jīng)炎癥所致的大鼠海馬神經(jīng)元損傷

鄧媛媛，高 虎，石琬嵐，李 菲

(遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

寶藿苷I減輕急性神經(jīng)炎癥所致的大鼠海馬神經(jīng)元損傷

鄧媛媛，高 虎，石琬嵐，李 菲

(遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

目的考察寶藿苷I(BHG I)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠急性神經(jīng)炎癥的作用及機制。方法雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)對照組、模型組、BHG I給藥組。給藥組灌胃給予BHG 130 mg/(kg·d)，其余兩組灌胃給予等體積的生理鹽水。預(yù)防性給藥5天后，模型組及給藥組左側(cè)腦室注射5 μL脂多糖(1 μg/μL)制備急性神經(jīng)炎癥大鼠模型，假手術(shù)對照組同法注射等體積生理鹽水。造模后24h取材，HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及形態(tài)，透射電鏡觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，Real time RT-PCR測定大鼠海馬組織中的環(huán)氧合酶-2(COX-2)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表達(dá)水平，Western blot實驗檢測炎癥相關(guān)蛋白腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1β的表達(dá)。結(jié)果BHG I預(yù)防性給藥可減輕側(cè)腦室注射LPS引起的神經(jīng)元排列紊亂、CA1區(qū)嗜酸性神經(jīng)元變性、核固縮以及神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)損傷；降低炎癥因子COX-2、IL-1β、iNOS的mRNA 及TNF-β、IL-1β的蛋白過度表達(dá)。結(jié)論預(yù)防性給予BHG I能拮抗LPS誘導(dǎo)急性神經(jīng)炎癥從而減少神經(jīng)元損傷，其機制與抑制海馬組織中炎癥因子的mRNA和蛋白過度表達(dá)有關(guān)。

寶藿苷I；脂多糖；炎癥；大鼠

中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥是神經(jīng)退行性變的關(guān)鍵因素之一。在諸如帕金森氏病、阿爾茨海默病、多發(fā)硬化癥、血管性癡呆等多種中樞神經(jīng)退行性疾病中均已證實神經(jīng)炎癥扮演了關(guān)鍵角色[1-3]。神經(jīng)炎癥發(fā)生過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被大量激活，釋放炎癥介質(zhì)，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性反應(yīng)，引起自由基形成、氧化應(yīng)激反應(yīng)及神經(jīng)元損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元退行性變、凋亡及最終死亡[4]。

寶藿苷I(Baohuoside I,BHG I)，又名淫羊藿次苷Ⅱ(icariside Ⅱ)，是中藥淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim)的有效成分之一，分子式C27H30O10，相對分子質(zhì)量為514.53。BHG I藥理作用廣泛，包括抗神經(jīng)元損傷、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、改善心血管功能、提高性功能等[5-7]。此外，藥動學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，BHG I是淫羊藿另一有效成分淫羊藿苷在腦內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物[8-10]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷對多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有積極作用，可對抗長期染鋁或海馬內(nèi)注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所誘導(dǎo)的大鼠癡呆，以及對自然衰老性癡呆模型的保護(hù)作用等[11-12]。然而，BHG I是否通過改善神經(jīng)炎癥而緩解中樞退行性疾病，尚不清楚。因此，本研究擬通過大鼠側(cè)腦室注射LPS誘導(dǎo)急性神經(jīng)炎癥模型，考察BHG I預(yù)防性給藥是否對急性神經(jīng)炎癥有拮抗作用，并探索其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠60只，體重250～350 g，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2013-0005。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 主要藥品和試劑 BHG I(經(jīng)HPLC檢測，純度gt;98%)購自南京澤郎醫(yī)藥有限公司；脂多糖購自美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑購自寶生物工程有限公司；COX-2、IL-1β、iNOS及GADPH基因的引物序列從GenBank查詢并由上海生工生物工程有限公司合成，相關(guān)基因的引物序列(見表1)。

表1各基因的引物序列

基因基因庫入口上游引物下游引物COX-2NM_017232.3AACACGGACTTGCTCACTTTGTTGAATGGAGGCCTTTGCCACTGIL-1βNM_031512.2GCTGTGGCAGCTACCTATGTCTTGAGGTCGTCATCATCCCACGAGINOSNM_012611.3CTCACTGTGGCTGTGGTCACCTAGGGTCTTCGGGCTTCAGGTTAGAPDHNM_017008CAGTGCCAGCCTCGTCTCATAACCAGGCGTCCGATACG

1.1.3 主要儀器 RNA逆轉(zhuǎn)錄儀(Eppend of Mastercycler Gradient PCR)購于德國Eppendorf公司；PCR熱循環(huán)儀(iCycler iQ)購置于美國Bio-Rad公司；電子分析天平(BS-110S)購置于北京賽多利斯天平有限公司；大鼠腦立體定位儀(SR-6N)購置于日本東京Setagaya.ku公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥 隨機法分為3組，分別為假手術(shù)對照組(sham，n=20)，模型組(LPS，n=20)，治療組(LPS+BHG I，n=20)。分組后次日開始給藥，治療組灌胃BHG I 30 mg/kg/d，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積的生理鹽水(normal saline,NS)。

1.2.2 造模 預(yù)防性給藥5 d后進(jìn)行手術(shù)造模。大鼠經(jīng)7%水合氯醛麻醉后，固定在腦立體定位儀上，剪毛、消毒，沿頭部正中切口(1.0 cm)，暴露前囟及正中線。側(cè)腦室進(jìn)針坐標(biāo)為：AP-0.8 mm(前囟后)、ML-1.5 mm(中線左側(cè))、H-3.8 mm(腦膜下深度)。定位后鉆開顱骨，微量注射器垂直進(jìn)針，模型組、治療組注射5 μl濃度為1 μg/μL的LPS溶液。假手術(shù)組同法注射等體積NS。術(shù)后傷口外用紅霉素軟膏涂抹預(yù)防感染。

1.2.3 海馬組織形態(tài)學(xué)觀察 每組隨機取5只大鼠，經(jīng)7%水合氯醛麻醉后，仰臥固定，4%多聚甲醛(PBS稀釋)透灌，斷頭取腦，固定后常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片為厚度5 μm 腦片，參考課題組既往報導(dǎo)行HE染色法染色[13]。每組另取5只大鼠用于透射電鏡觀察，同前法透灌后斷頭取腦，分離海馬，用刀片將其切成勻稱的小塊后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的戊二醛電鏡固定液中。固定，丙酮梯度脫水，包埋，超薄切片(50～70 nm)；醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色后用透射電鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 Real time RT-PCR檢測COX-2、IL-1β和iNOS的mRNA表達(dá) 各組剩余大鼠麻醉后，斷頭取腦并快速分離海馬，將左側(cè)海馬組織置于盛有總RNA抽提試劑(Trizol)的EP管中，提取海馬總RNA，測定濃度。逆轉(zhuǎn)錄體系為10 μL，依次為5×Primescript buffer 2 μL、Prime RT Enzyme Mix 0.5 μL、Oligod T Primre 0.5 μL、Random 6 mers 0.5 μL、Total RNA 0.5 μg/CRNA、DEPC 水 6.5 - 0.5 μg / CRNA。經(jīng)RNA逆轉(zhuǎn)錄儀逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，按10 μL RT-PCR 體系配置后進(jìn)行擴(kuò)增，SYBR green 5 μL、上下游引物 0.5 μL、DEPC 水 2.5 μL、cDNA 2 μL。反應(yīng)步驟為第一步：95 ℃×8.5 min， 第二步：95 ℃ ×15 s，58 ℃×1 min，循環(huán)45 次。目的基因表達(dá)水平的相對定量法同課題組既往報導(dǎo)[14]，即① Ct average=(Ct1+Ct2)/2 (復(fù)孔)；②dCt值=Ct average-中間值；③目的基因的表達(dá)=2-dCt；④相對基因的表達(dá)=目的基因的表達(dá)/內(nèi)參基因的表達(dá)(對照設(shè)為100)。

1.2.5 Western blot實驗 提取右側(cè)海馬總蛋白并計算蛋白濃度。將樣品制備后上樣至8% SDS-PAGE 凝膠梳孔，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗、二抗孵育后，ECL發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)和Quantity One定量分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 BHG I對大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響 HE染色觀察大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)，結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常、排列整齊；模型組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)元嗜酸性變性，核固縮。與模型組比較，BHG I預(yù)防性給藥組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列較為規(guī)整，僅見少量變性(見圖1)。

A、D:假手術(shù)組；B、E:模型組；C、F:BHG I治療組。圖1 HE染色觀察BHG I對大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響

2.2 BHG I對炎癥相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響 Real time RT-PCR檢測炎癥相關(guān)基因IL-1β、COX-2、iNOS的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬的IL-1β、COX-2、iNOS的mRNA表達(dá)水平明顯增高(Plt;0.05)，其均值分別為假手術(shù)對照組的9.4、2.2、13.7倍；而與模型組比較，BHG I治療組大鼠海馬的上述基因mRNA表達(dá)顯著下降(Plt;0.05)(見圖2)。

2.3 BHG I對大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響 使用透射電子顯微鏡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示：假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞核形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻(如圖3A箭頭所示)，線粒體及內(nèi)

*表示與假手術(shù)組比較，Plt;0.05；#表示與模型組比較，Plt;0.05。 圖2 BHG I對大鼠海馬的IL-1β、COX-2、iNOS mRNA表達(dá)水平的影響

質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)受損，異染色質(zhì)聚集(圖3B箭頭所示)，核周間隙明顯增寬，線粒體出現(xiàn)腫脹(圖3E中箭頭所示)；與模型組比較，治療組CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰。

A、D:假手術(shù)組；B、C:模型組；C、F:BHG I治療組。(A、B、C圖箭頭所指為胞核內(nèi)染色質(zhì)及核周間隙，D、F箭頭所指為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，E圖箭頭所指分別為線粒體和胞核內(nèi)異染色質(zhì))。圖3 透射電鏡觀察BHG I對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響

2.4 BHG I對炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 通過Western blot實驗檢測大鼠海馬組織中IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見圖4)，模型組海馬組織中IL-1β和TNF-α的蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高(Plt;0.01)，而預(yù)防性給予BHG I后，大鼠海馬的IL-1β和TNF-α表達(dá)較模型組顯著下降(Plt;0.05)。

*表示與假手術(shù)組比較，Plt;0.05；#表示與模型組比較，Plt;0.05。圖4 BHG I對大鼠海馬的IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

中樞炎癥反應(yīng)在神經(jīng)退行性疾病中起到重要作用。神經(jīng)炎癥發(fā)生時小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，伴隨大量促炎癥因子如細(xì)胞因子、粘附因子等的釋放，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、變性死亡[15-16]。LPS作為一種細(xì)菌內(nèi)毒素，經(jīng)側(cè)腦室注射后，可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等炎癥細(xì)胞被大量激活，釋放IL-1β、COX-2等炎癥反應(yīng)介質(zhì)，在24 h內(nèi)使炎癥反應(yīng)達(dá)到峰值，常被用于誘導(dǎo)急性炎癥動物模型[17-19]。因此本研究采用BHG I預(yù)防性給藥5 d后，LPS側(cè)腦室注射誘導(dǎo)急性神經(jīng)炎癥模型觀察BHG I對模型大鼠的作用及機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射LPS 24 h后，大鼠的海馬結(jié)構(gòu)被破壞，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元嗜酸性變性，且神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)明顯受損，炎癥因子IL-1β、COX-2、iNOS的mRNA表達(dá)水平及IL-1β和TNF-α的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，表明側(cè)腦室注射LPS誘導(dǎo)了大鼠急性神經(jīng)炎癥模型。

BHG I為貴州省道地中藥材淫羊藿的主要成分，本課題組長期致力于淫羊藿藥理活性的研究。在寶藿苷I對鏈脲佐菌素所致的大鼠學(xué)習(xí)記憶減退模型中我們發(fā)現(xiàn)，寶藿苷I 3 mg/kg和10 mg/kg連續(xù)給藥21 d，僅10 mg/kg 寶藿苷I對模型大鼠顯示出治療作用[20]；在寶藿苷I對腦缺血再灌注損傷大鼠的作用研究中，我們則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)預(yù)防性給予寶藿苷I 30 mg/kg，其療效明顯優(yōu)于寶藿苷I 10 mg/kg劑量[21]。因此，在本實驗中，采用30 mg/(kg·d)這一最佳給藥劑量，觀察BHG I對急性神經(jīng)炎癥的保護(hù)作用。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)BHG I預(yù)防性給藥明顯減輕了LPS導(dǎo)致的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，變性以及超微結(jié)構(gòu)的改變，緩解LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。

為進(jìn)一步探索BHG I改善LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的作用機制，考察了BHG I對大鼠海馬組織中炎癥因子的mRNA及蛋白表達(dá)的影響。COX-2是炎癥級聯(lián)反應(yīng)中的主要介質(zhì)，可生成具有高效促炎介質(zhì)的前列腺素,激活小膠質(zhì)細(xì)胞形成炎癥環(huán)路[22-23]。IL-1β是一種促炎細(xì)胞因子，主要以以分泌形式發(fā)揮活性，其分泌型表達(dá)升高時，會抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用，加重炎癥反應(yīng)[24]。TNF-α是一種涉及到系統(tǒng)性炎癥的細(xì)胞因子，存在無活性前體和分泌型兩種形式，其活性形式通常由巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生，作為一種內(nèi)源性致熱源，能夠誘發(fā)并加重炎癥反應(yīng)。iNOS是催化一氧化氮產(chǎn)生的反應(yīng)酶，其產(chǎn)物一氧化氮作為自由基產(chǎn)生神經(jīng)毒性的同時也參與炎癥反應(yīng)過程[25]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射LPS后，大鼠海馬組織中的COX-2、IL-1β、iNOS的mRNA表達(dá)水平明顯增高，同時，我們檢測了分泌型活性IL-1β和TNF-α片段，發(fā)現(xiàn)IL-1β和TNF-α的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而BHG I能明顯降低上述基因和蛋白的表達(dá)。提示BHG I預(yù)防性給藥可抑制海馬組織中炎癥因子的mRNA和蛋白過度表達(dá)。

綜上所述，本實驗證實BHG I可改善LPS誘導(dǎo)的急性神經(jīng)炎性反應(yīng)，緩解神經(jīng)元損傷變性，其潛在機制與降低海馬組織中COX-2、IL-1β、iNOS的mRNA表達(dá)及IL-1β和TNF-α的蛋白表達(dá)有關(guān)。同時，在下一步的工作中，我們將進(jìn)一步采用免疫組化，Western blot 等方法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志物及相關(guān)信號通路的變化，深入研究BHG I的作用機制，以期為BHG I的應(yīng)用提供更全面的藥理學(xué)依據(jù)。

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[收稿2017-06-24;修回2017-08-17]

(編輯：譚秀榮)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

BaohuosideIattenuateshippocampalneuronaldamageinducedbyacuteneuroinflammationinrats

DengYuanyuan,GaoHu,ShiWanlan,LiFei

(Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo explore the effects of Baohuoside I (BHG I) on lipopolysaccharide (LPS)-induced acute neuroinflammation in rats and its possible mechanisms.MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group (sham),model group and BHG I treated group.The treatment group was administered BHG I by gavage at the dose of 30 mg/kg once per day,sham group and model group was given an equal volume of saline.Five days after pretreatment with BHG I or saline,rats were anesthetized with chloral hydrate and secured in a stereotaxic apparatus.LPS (5 μg in 5 μL steriled in saline) was injected into left intracerebroventricular into the model and BHG I treated groups.The sham group underwent all surgical steps,with the exception that saline was administered rather than LPS.Animals were sacrificed 24 hours after the surgery,brain tissues were collected quickly for HE staining,transmission electron microscopy,real time RT-PCR analysis and western blot assay.ResultsBHG I administration significantly attenuated LPS-induced neuron disorders,CA1 region eosinophilic neuronal degeneration,karyopycnosis neurons and ultrastructural damage.meanwhile,BHG I reduced the over-expression of COX-2,IL-1β,iNOS mRNA and TNF-α,IL-1β protein in the hippocampus.ConclusionBHG I has a protective effect on LPS-induced acute neuroinflammation in rats.The mechanisms are due to the inhibition of the mRNA and protein expression of inflammatory factors.

Baohuoside I; lipopolysaccharide; inflammation; rat

貴州省科技廳聯(lián)合資金項目(NO：黔科合LH字[2015]7533)；貴州省衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)基金項目(NO：gzwjkj2014-1-069)；遵義市科技局遵義醫(yī)學(xué)院聯(lián)合資金項目(NO：遵市科合社字[2016]29)。

李菲，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail:lifei@zmc.edu.cn。

R965

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1000-2715(2017)05-0516-06