谷氨酸棒桿菌天冬氨酸激酶G359D突變解除賴氨酸與蘇氨酸協(xié)同抑制的研究

徐德雨 鄭小梅 趙晶 鄭平 趙樹欣

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308）

谷氨酸棒桿菌天冬氨酸激酶G359D突變解除賴氨酸與蘇氨酸協(xié)同抑制的研究

徐德雨1，2鄭小梅2趙晶2鄭平2趙樹欣1

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308）

天冬氨酸激酶（Aspartate Kinase，AK）是賴氨酸合成途徑中關(guān)鍵酶，其受到代謝產(chǎn)物賴氨酸與蘇氨酸的協(xié)同抑制，旨在發(fā)現(xiàn)其解除協(xié)同抑制的新突變體并解析其機理。通過對賴氨酸高產(chǎn)菌Corynebacterium glutamicum ZL5與野生型C. glutamicum ATCC 13032的天冬氨酸激酶氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)在高產(chǎn)菌的天冬氨酸激酶中存在G359D突變。通過體外天冬氨酸激酶野生型和G359D突變體酶活檢測，發(fā)現(xiàn)該G359D突變體在10 mmol/L賴氨酸和蘇氨酸同時存在時仍保留了76.94%±1.61%的酶活，而野生酶的酶活僅殘留4.38%±1.28%。這一結(jié)果在賴氨酸高產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌的回復(fù)突變中也可得到驗證，其回復(fù)突變后使賴氨酸產(chǎn)量下降15.57%。通過同源建模和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，與野生酶相比，G359D突變體結(jié)合賴氨酸后，其位于活性中心附近的Arg151與Glu74之間無法形成離子鍵，允許底物分子的結(jié)合而具有較高活性。發(fā)現(xiàn)天冬氨酸激酶G359D突變體可阻斷賴氨酸引起的別構(gòu)效應(yīng)，從而有效解除賴氨酸與蘇氨酸的協(xié)同抑制。

谷氨酸棒桿菌；天冬氨酸激酶；賴氨酸；蘇氨酸；協(xié)同抑制

賴氨酸是人和動物體內(nèi)的必需氨基酸之一［1-2］，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品與飼料工業(yè)［3-5］。目前，賴氨酸的主要生產(chǎn)方法是發(fā)酵法，其中谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）是賴氨酸的重要生產(chǎn)菌株，年產(chǎn)量達到220萬噸以上［6-7］。在賴氨酸合成途徑中，天冬氨酸激酶（Aspartate kinase，AK，EC 2.7.2.4）是非常重要的限速酶，可利用ATP將天冬氨酸磷酸化成天冬氨酰-P［6，8］。谷氨酸棒桿菌的天冬氨酸激酶（CgAK）由于受到賴氨酸與蘇氨酸的反饋別構(gòu)調(diào)控而成為研究熱點。

CgAK屬于II類型天冬氨酸激酶，為α2β2型異源四聚體［9-10］，即具有2個α亞基和2個β亞基，且均由lysC基因編碼（圖1）。CgAK催化結(jié)構(gòu)域位于α亞基的N-末端，其別構(gòu)調(diào)控結(jié)構(gòu)域由α亞基的C-末端區(qū)域和β亞基組成，在α亞基與β亞基上分別含有兩個參與別構(gòu)調(diào)控結(jié)合的ACT區(qū)（AK（A），chorismate mutase（C）and prep-Henate dehydrogenase（T，for TyrA））， 即 ACT1 和 ACT2［11-12］。 一 個 αβ調(diào)節(jié)區(qū)的ACT結(jié)構(gòu)域中含有兩個蘇氨酸結(jié)合位點和兩個賴氨酸結(jié)合位點，但在CgAK中有一個賴氨酸結(jié)合位點是空置的，因此只結(jié)合兩個蘇氨酸和一個賴氨酸［12］。α亞基的ACT1（253-342）與β亞基的ACT2（1-13，94-160）構(gòu)成蘇氨酸的結(jié)合位點，β亞基的ACT1（14-93）與α亞基的ACT2（250-262，343-409）構(gòu)成蘇氨酸的另一個結(jié)合位點［12］。另外，β亞基的ACT1與α亞基ACT2也可構(gòu)成賴氨酸的結(jié)合位點，Ile44（β）-N、Val360（α）-N、Thr361（α）-N和Thr361（α）-Oγ1分別與賴氨酸的羧基形成氫鍵相連，且Gly359-N和Ile42-O也有利于穩(wěn)定賴氨酸的結(jié)合［12］。

在天冬氨酸激酶中，參與賴氨酸與蘇氨酸結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸在其協(xié)同抑制中起重要作用。其突變將打破賴氨酸與蘇氨酸與天冬氨酸激酶之間的非共價結(jié)合，從而解除賴氨酸與蘇氨酸對天冬氨酸激酶的協(xié)同抑制。Yoshida等［13］利用定點突變與結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)位于蘇氨酸結(jié)合位點的G277A與位于調(diào)節(jié)域αβ二聚體界面的V360A、T361A、E363A的突變體可完全解除協(xié)同抑制，在10 mmol/L賴氨酸和蘇氨酸的條件下突變體的殘留酶活為110%、100%、100%與110%。他們同時發(fā)現(xiàn)將CgAK中Gly359突變?yōu)楸彼釙r卻完全不能解除協(xié)同抑制。但在北京棒桿菌（Corynebacterium Pekinense）中的天冬氨酸激酶［14］中將與CgAK的Gly359對應(yīng)的Gly377位點突變?yōu)楸奖彼釙r部分解除了協(xié)同抑制，在10 mmol/L賴氨酸和蘇氨酸的條件下其酶活可保留24.81%。由此可見，Gly359突變?yōu)椴煌被釙r解除協(xié)同抑制的程度不同，那么突變何種氨基酸能有效解除協(xié)同抑制以及突變后解除抑制的具體機理還需深入研究。

針對上述問題，本研究首先利用野生型C. glutamicum ATCC 13032與賴氨酸高產(chǎn)菌C.glutamicum ZL5的AK的蛋白比對，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)菌株中的AK存在G359D的突變。體外酶活檢測發(fā)現(xiàn)其高效解除賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同抑制。后續(xù)進一步通過對賴氨酸高產(chǎn)菌C. glutamicum ZL5中的突變位點進行回復(fù)突變，體內(nèi)驗證該突變位點回復(fù)突變后對賴氨酸產(chǎn)量的影響。最后，以CgAK的蛋白結(jié)構(gòu)3AAW和3AB4為模板，利用同源建模來重建突變體的蛋白三維結(jié)構(gòu)，再通過蛋白結(jié)構(gòu)與成鍵分析來解析突變體解除協(xié)同抑制的機理。

圖 1 谷氨酸棒桿菌天冬氨酸激酶的α2β2型晶體結(jié)構(gòu)圖（PDB ID ：3AAW）［12］

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒（表1）。

1.1.2 主要試劑和儀器 谷氨酸棒桿菌基因組提取試劑盒為Biomiga公司Promega基因組提取試劑盒；質(zhì)粒提取試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司EasyPure Plasmid MiniPrep Kit；膠回收試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司EasyPure Quick Gel Extraction Kit；克隆載體的一步重組試劑盒為南京諾唯贊生物科技有限公司ClonExpress?II One StepCloning Kit；蛋白定量試劑盒為Pierce?BCA Protein Assay Kit。所有分子生物學(xué)工具酶均購自Thermo公司；Ni2+-樹脂親和層析柱購自GE公司；羥胺、天冬氨酸、ATP均購自Sigma公司；其余生化藥品為進口或國產(chǎn)分析純試劑；使用的主要儀器有凝膠成像儀、酶標(biāo)儀、電轉(zhuǎn)儀、PCR 基因擴增儀、蛋白電泳槽、臺式高速冷凍離心機、紫外分光光度計、SBA-40D 生物傳感分析儀。

表1 試驗所用的菌株、質(zhì)粒與引物

1.1.3 谷氨酸棒桿菌賴氨酸搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏10 g/L，麥芽糖提取物5 g/L，pH7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜50 mL/L，玉米漿30 mL/L，硫酸銨36 g/L，硫酸鎂0.27 g/L，磷酸（85%）0.225 mL/L，葡萄糖88 g/L，七水硫酸亞鐵0.11 g/L，檸檬酸9.98×10-2g/L，維生素H 2.10×10-3g/L，維生素B1 3.50×10-3g/L，泛酸（維生素B5）1.40×10-2g/L，煙酰胺（維生素B3）4.20×10-2g/L，pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 不同谷氨酸棒桿菌的天冬氨酸激酶氨基酸序列比對 本實驗室前期利用第二代基因組測序技術(shù)對賴氨酸高產(chǎn)菌C. glutamicum ZL5進行了全基因組測序與拼接。利用NCBI的Genebank數(shù)據(jù)庫中的C.glutamicum ATCC 13032天冬氨酸激酶序列（登錄號為1021294）對C. glutamicum ZL5中的天冬氨酸激酶編碼基因進行注釋。利用Clone Manager軟件將兩個菌株的天冬氨酸激酶氨基酸序列進行比對。

1.2.2 天冬氨酸激酶編碼基因克隆與重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 首先，采用oligo 7軟件根據(jù)天冬氨酸激酶編碼基因序列設(shè)計引物1和引物2（表1），以C.glutamicum ATCC 13032和C. glutamicum ZL5的基因組為模板，擴增兩個菌株中的天冬氨酸激酶編碼基因，借助引物序列在基因的上下游分別引入可用于與表達質(zhì)粒pET21a（+）進行重組的同源臂序列。PCR條件為：預(yù)變性95℃ 10 min；95℃ 20 s；60℃30 s；72℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化。用Nde I和Xho I限制性內(nèi)切酶酶切pET21a（+）質(zhì)粒，按ClonExpress? II One Step Cloning Kit說明書將PCR產(chǎn)物與線性化的pET21a（+）載體片段進行重組，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)，陽性克隆培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒并測序驗證。將正確重組的質(zhì)粒分別命名為pSXL1和pSXL2，以用于C. glutamicum ATCC 13032和C. glutamicum ZL5天冬氨酸激酶的表達。

1.2.3 天冬氨酸激酶的表達與純化 將驗證正確的重組質(zhì)粒pSXL1和pSXL2分別轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)。將轉(zhuǎn)化菌株過夜活化后，以1%的接種量接種于100 mL含有50 μg/mL Kan的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD為0.6左右，加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基 -β-D-半乳糖苷（IPTG），20℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h誘導(dǎo)蛋白表達。將100 mL菌液高速離心收集菌體，用8 mL緩沖液A（組成：20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，10%（V/V）甘油）重懸細胞，在冰浴條件下用超聲波破碎細胞，然后4℃ 12 000 r/min離心15 min，上清即可溶性的酶液。

重組蛋白的純化利用His標(biāo)簽采用Ni2+-樹脂親和層析進行。首先，用600 μL緩沖液A平衡Ni2+-樹脂親和層析柱，然后加入含有酶液的上清，再分別用600 μL 20 mmol/L與500 mmol/L咪唑 Tris-HCl緩沖液（pH7.5）洗脫雜蛋白和目的蛋白，收集洗脫液。高濃度的咪唑洗脫液在10 kD超濾管中超濾3次，超濾液為緩沖液B（組成：100 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，20%（V/V）甘油），超濾條件為4℃條件下7 500 × g離心30 min，除去洗脫液中的咪唑。對純化后的蛋白進行濃度為12% SDS-PAGE 電泳分析。用 Pierce?BCA Protein Assay Kit對蛋白進行定量［15］。

1.2.4 不同抑制劑對天冬氨酸激酶酶活影響 AK酶活檢測方法參照文獻［8，16］。標(biāo)準反應(yīng)體系為1 mL混合液中包含200 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），10 mmol/L MgSO4·6H2O，10 mmol/L Aspa-rtate，10 mmol/L ATP，160 mmol/L NH2OH·HCl（用KOH中和），以及適量的酶。30℃下反應(yīng)25 min后，在反應(yīng)體系中加入等體積的5%（W/V）FeCl3溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀540 nm檢測反應(yīng)體系中生成的天冬氨酸異羥肟酸的吸光值。一個單位天冬氨酸激酶活力定義為：30℃反應(yīng)條件下，反應(yīng)體系中每分鐘生成1 μmol天冬氨酸異羥肟酸所需的酶量。在30℃，pH7.5條件下，在反應(yīng)體系中加入不同濃度的賴氨酸或/和蘇氨酸，檢測殘留的酶活力，從而檢測酶活的抑制情況。不同抑制劑母液先用KOH調(diào)pH到7.5。

1.2.5 賴氨酸高產(chǎn)菌中的天冬氨酸激酶基因回復(fù)突變菌株的構(gòu)建 用于C. glutamicum ZL5菌株基因組上對其天冬氨酸激酶編碼基因回復(fù)突變的質(zhì)粒構(gòu)建過程如圖2-A所示。首先，以C. glutamicum ATCC 13032基因組為模板，用引物3和引物4（表1）擴增包含天冬氨酸激酶編碼基因及其上下游各1 000 bp的DNA片段，按上述相同的方法將含有C.glutamicum ATCC 13032天冬氨酸激酶編碼基因的打靶片段重組至谷氨酸棒桿菌自殺質(zhì)粒pK18mobsacB中，以構(gòu)建用于在C. glutamicum ZL5菌株基因組上對其天冬氨酸激酶基因進行回復(fù)突變的打靶質(zhì)粒，測序正確后的質(zhì)粒命名為pSXL3。

C. glutamicum ZL5感受態(tài)的制備參考余秉琦等的方法［17-19］。電擊轉(zhuǎn)化條件為2 500 V，2 mm電擊杯，電擊兩次。用電轉(zhuǎn)儀將pSXL3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ZL5菌株感受態(tài)后，經(jīng)過兩次同源臂重組，分別在Kan抗性平板及15%蔗糖平板上進行兩次篩選（圖2-B），PCR擴增包含突變位點的DNA片段并測序驗證，成功回復(fù)突變的菌株命名為SXCgL1。

1.2.6 賴氨酸高產(chǎn)菌株與回復(fù)突變菌株的賴氨酸搖瓶發(fā)酵檢測 將C. glutamicum ZL5菌株和回復(fù)突變菌株SXCgL1甘油菌在LBG固體平板上劃線活化，30℃培養(yǎng)約36 h；將挑取適量菌種轉(zhuǎn)接種到裝有20 mL液體LBG培養(yǎng)基的100 mL搖瓶中，30℃，220 r/min培養(yǎng)10-12 h；將活化的菌株按初始OD為0.1接到裝有10 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30℃，220 r/min培養(yǎng)12 h；將種子液按5%接種量分別接到裝有28.5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，每個菌株3個平行，30℃，220 r/min培養(yǎng)60 h。每隔一段時間測發(fā)酵液的pH，用50%的尿素調(diào)節(jié)pH在7.0左右。發(fā)酵結(jié)束后，取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，取50 μL發(fā)酵液稀釋20倍，用山東省科學(xué)院生產(chǎn)的SBA-40D 生物傳感分析儀檢測發(fā)酵液中殘?zhí)呛唾嚢彼岷?。發(fā)酵液稀釋50倍，用紫外分光光度計檢測菌體OD值。

1.2.7 天冬氨酸激酶突變體同源建模與成鍵分析 以C. glutamicum ATCC 13032來源的天冬氨酸激酶的兩種晶體結(jié)構(gòu)為模板，具體模板為無活性的CgAK晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：3AAW）和有活性的CgAK晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：3AB4），利用YASARA軟件分別對天冬氨酸激酶野生型和突變體進行同源建模。然后利用PyMOL軟件將天冬氨酸激酶突變體G359D的三維結(jié)構(gòu)與C. glutamicum ATCC 13032的天冬氨酸激酶的結(jié)構(gòu)進行擬合與成鍵分析。

圖2 質(zhì)粒pSXL3構(gòu)建過程與回復(fù)突變菌株SXCgL1菌株構(gòu)建示意圖

2 結(jié)果

2.1 天冬氨酸激酶氨基酸突變位點的發(fā)現(xiàn)

本實驗室前期對一系列野生型與賴氨酸生產(chǎn)谷氨酸棒桿菌進行了二代基因組測序與比較基因組分析。這些菌株中包括從上海市工業(yè)微生物研究所菌種保藏中心購買的賴氨酸低產(chǎn)菌C. glutamicum A12和經(jīng)誘變篩選獲得的賴氨酸高產(chǎn)菌C. glutamicum ZL5。由于野生型C. glutamicum ATCC 13032的基因組通常作為參考基因組用于比較基因組分析，因此本研究也從NCBI中提取野生型C. glutamicum ATCC 13032的天冬氨酸激酶編碼基因進行分析。通過多序列比對發(fā)現(xiàn)C. glutamicum ZL5的天冬氨酸激酶編碼氨基酸序列與另外兩個來源于野生型C. glutamicum ATCC 13032與C. glutamicum A12天冬氨酸激酶氨基酸序列的一致性為99.3%，僅在359位點存在差異，即賴氨酸高產(chǎn)菌C. glutamicum ZL5中的天冬氨酸激酶存在G359D的單點突變，而C. glutamicum ATCC 13032和C. glutamicum A12的天冬氨酸激酶氨基酸序列完全相同，如圖3所示。為方便下文的論述，將C. glutamicum ATCC 13032的天冬氨酸激酶命名為AK-WT，將C. glutamicum ZL5的天冬氨酸激酶命名為AK-G359D。

2.2 天冬氨酸激酶在大腸桿菌中的重組表達與蛋白純化

為研究G359D點突變的功能，將AK-WT與AK-G359D在大腸桿菌中進行重組表達。首先，利用PCR擴增天冬氨酸激酶AK-WT與AK-G359D編碼基因，DNA片段長度1 300 bp左右（圖4-A），條帶大小與預(yù)期相符。然后用ClonExpress? II試劑盒成功將各基因分別重組至表達質(zhì)粒pET21a（+），構(gòu)建各重組表達質(zhì)粒pSXL1和pSXL2。將蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli BL21（DE3）中IPTG誘導(dǎo)表達與蛋白親和純化。如圖4-B所示，在大腸桿菌中，成功表達并純化了AK-WT與AK-G359D，其α亞基和β亞基分子質(zhì)量分別為45.55 kD和19.33 kD，與理論值相符。

圖4 天冬氨酸激酶編碼基因的PCR（A）與純化蛋白的SDS-PAGE（B）電泳圖

2.3 賴氨酸與蘇氨酸對重組天冬氨酸激酶酶活的影響

為研究G359D的突變對天冬氨酸激酶酶活的影響，檢測了不同蘇氨酸或/和賴氨酸濃度下AK-WT與AK-G359D酶活。結(jié)果（圖5）顯示，AK-WT受蘇氨酸與賴氨酸的協(xié)同抑制，而AK-G359D則可有效解除蘇氨酸與賴氨酸的協(xié)同抑制。具體而言，在僅存在蘇氨酸時，AK-WT的酶活不受顯著抑制，蘇氨酸濃度從2 mmol/L提高到10 mmol/L，其酶活維持在92.63%±1.55%與96.22%±2.18%之間；而AK-G359D酶活隨著蘇氨酸濃度的提高有所下降，由2 mmol/L時的86.10%±3.55%下降到10 mmol/L時的76.46%±3.70%。而僅存在賴氨酸時，AK-WT與AK-G359D酶活受抑制影響情況一致，隨著賴氨酸濃度提高酶活都有所下降，10 mmol/L時剩余酶活分別為58.13%±2.60%和59.46%±5.17%。但在蘇氨酸與賴氨酸同時存在時，AK-WT與AK-G359D酶活表現(xiàn)出明顯差異，AK-WT在兩者同時存在時酶活顯著下降，2 mmol/L時其酶活僅剩余4.77%±0.81%，10 mmol/L時為4.38%±1.28%，而AK-G359D的酶活則維持在較高的水平，在兩者濃度為2 mmol/L時其酶活仍保留了87.23%±0.94%，甚至在兩者濃度高達10 mmol/L時其酶活仍剩余76.94%±1.61%。實驗結(jié)果說明了G359D的突變使天冬氨酸激酶有效解除了蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同抑制。

圖5 不同抑制劑存在時天冬氨酸激酶野生型與突變體的酶活檢測結(jié)果

2.4 天冬氨酸激酶突變體G359D的回復(fù)突變對賴氨酸發(fā)酵的影響

為在谷氨酸棒桿菌體內(nèi)進一步驗證G359D的作用，在賴氨酸高產(chǎn)菌C. glutamicum ZL5的基因組上利用同源重組對AK-G359D編碼基因進行了回復(fù)突變。首先，以C. glutamicum ATCC 13032基因組為模板，擴增了天冬氨酸激酶AK-G359D編碼基因回復(fù)突變的打靶片段，其理論長度約3 300 bp，如圖6-A所示，其條帶大小與預(yù)期相符。然后重組至自殺性質(zhì)粒pK18mobsacB中，成功獲得回復(fù)突變的打靶質(zhì)粒pSXL3。將該質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至賴氨酸高產(chǎn)菌C.glutamicum ZL5中，經(jīng)過兩次同源臂交換后，隨機選取4個轉(zhuǎn)化子提取基因組。利用基因組驗證引物5與引物6（表1）進行基因組的PCR驗證，結(jié)果擴增得到600 bp的目的片段，條帶大小與預(yù)期相符，如圖6-B所示。將擴增出的基因片段進行測序發(fā)現(xiàn)，lysC-1與lysC-3成功發(fā)生回復(fù)突變（圖6-C），即由天冬氨酸激酶AK-G359D編碼基因回復(fù)成天冬氨酸激酶AK-WT編碼基因。選擇將轉(zhuǎn)化子lysC-1命名為SXCgL1，進行后續(xù)的賴氨酸發(fā)酵驗證。發(fā)酵結(jié)果（圖7）所示，賴氨酸高產(chǎn)菌C. glutamicum ZL5與回復(fù)突變菌株SXCgL1在生長上沒有差異，但在賴氨酸的產(chǎn)量上具有顯著差異。具體而言，在搖瓶發(fā)酵60 h后，高產(chǎn)菌C. glutamicum ZL5與回復(fù)突變菌株SXCgL1的OD分別為31.43±1.35與31.35±0.21，但賴氨酸產(chǎn)量分別為13.16±0.29 g/L與11.11±0.13 g/L，即天冬氨酸激酶AK-G359編碼基因的回復(fù)突變導(dǎo)致賴氨酸的產(chǎn)量下降15.57%。

由于C. glutamicum A12的天冬氨酸激酶基因與C.glutamicum ZL5天冬氨酸激酶基因僅存在1個堿基的突變，即導(dǎo)致G359D的突變，無其它堿基的突變。而C.glutamicum ATCC13032的天冬氨酸激酶基因與C. glutamicum ZL5天冬氨酸激酶基因存在15個堿基的突變，除導(dǎo)致G359D的突變，還存在其他14個位點的同義突變。因此，本研究進一步以C. glutamicum A12基因組為模板，擴增了其基因序列（圖6-A），并對C. glutamicum ZL5天冬氨酸激酶基因進行替換，以進行回復(fù)突變。經(jīng)基因組PCR驗證與測序可見，成功獲得僅對G359D相對應(yīng)的1076堿基進行了回復(fù)突變，由A突變?yōu)镚，而其他位點并未發(fā)生突變（圖6-D）。將單點回復(fù)突變的轉(zhuǎn)化子lysC*-2命名為SXCgL2，并進行后續(xù)賴氨酸發(fā)酵驗證。發(fā)酵結(jié)果如圖7所示，回復(fù)突變菌株SXCgL2的驗證結(jié)果與SXCgL1無明顯差異。在搖瓶發(fā)酵60 h后，其OD為30.77±0.99，賴氨酸產(chǎn)量為11.33±0.12 g/L，與SXCgL1的生長與賴氨酸產(chǎn)量相差不大。

圖6 C. glutamicum ZL5菌株天冬氨酸激酶回復(fù)突變菌株構(gòu)建構(gòu)建過程中電泳驗證與測序結(jié)果

2.5 天冬氨酸激酶突變體G359D的結(jié)構(gòu)分析

圖7 C. glutamicum ZL5和回復(fù)突變菌株SXCgL1菌株賴氨酸搖瓶發(fā)酵結(jié)果

為進一步揭示AK-G359D解除賴氨酸和蘇氨酸協(xié)同抑制的機制，首先以C. glutamicum ATCC 13032來源的天冬氨酸激酶的晶體結(jié)構(gòu)3AAW與3AB4為模板，模擬構(gòu)建了AK-G359D與賴氨酸和蘇氨酸結(jié)合狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu)，如圖8-A中品紅色結(jié)構(gòu)所示。然后，將該結(jié)構(gòu)與AK-WT的結(jié)構(gòu)（如圖8-A中藍綠色結(jié)構(gòu)所示）進行了擬合分析，結(jié)果表明，雖然兩個酶均可結(jié)合賴氨酸和蘇氨酸，但其在活性位點附近的β-折疊的組成和構(gòu)象存在顯著差異。具體而言，在AK-WT中，賴氨酸的結(jié)合使來源于α亞基的一個β-折疊（β5（α），其C末端有Arg151）靠近活性中心，導(dǎo)致Arg151與底物結(jié)合位點Glu74之間形成雙配位基離子鍵，阻止了底物進入，使酶處于非活性狀態(tài)，如圖8-B與圖9-A所示。而在AK-G359D中，該區(qū)域存在兩個β-折疊，且偏離活性中心的位置，其Arg151與Glu74之間無法形成離子鍵，使酶處于開放狀態(tài)，允許底物分子的結(jié)合，如圖8-B與圖9-B所示。

3 討論

天冬氨酸激酶是天冬氨酸家族氨基酸合成中非常關(guān)鍵的限速酶，但其往往受到代謝產(chǎn)物的反饋抑制。天冬氨酸激酶解除抑制的突變改造與機制解析對提升相關(guān)氨基酸的合成具有重要的指導(dǎo)意義。在前期研究中，Yoshida等［12］通過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)Ile44（β）、Val360（α）、Thr361（α）、Thr361（α）、Gly359（α）和Ile42（β）直接或間接參與了賴氨酸的結(jié)合，這些位點的突變可能有效解除抑制。但當(dāng)Yoshida等［13］將CgAK中Gly359突變?yōu)楸彼?，發(fā)現(xiàn)該突變體卻未能解除蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同抑制，其原因可能在于丙氨酸與甘氨酸結(jié)構(gòu)較為相近，其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的改變對解除抑制的貢獻較小。而朱運明等［14］將來自于北京棒桿菌CpAK中與CgAK的Gly359對應(yīng)的Gly377位點進行突變后，發(fā)現(xiàn)CpAK-G377F突變體解除蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同抑制，但在高濃度下其解除效果不太理想，至10 mmol/L時其酶活僅殘留24.81%。針對上述問題，本文通過對來自野生型C. glutamicum ATCC 13032和賴氨酸高產(chǎn)菌C.glutamicum ZL5的AK蛋白比較發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)菌株AK中存在G359D的單點突變。體外重組酶的酶活檢測發(fā)現(xiàn)，該G359D突變體可有效解除蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同抑制，即使高濃度至10 mmol/L時，其酶活可保留至76.94%。對比可見，本研究發(fā)現(xiàn)的突變體解除蘇氨酸和賴氨酸協(xié)同抑制的能力顯著高于目前已報道的水平，即Gly359突變?yōu)樗嵝园被釙r可高效解除協(xié)同抑制。

A：AK-WT與AK-G359D的三維結(jié)構(gòu)擬合圖（藍綠色的為AK-WT的三維結(jié)構(gòu)，品紅色的為AK-G359D的三維結(jié)構(gòu)，紅圈圈出的為AK的活性中心）；B：天冬氨酸激酶活性中心放大效果圖（大的虛線紅圈及紅色弧形箭頭標(biāo)明了AK-WT與AK-G359D的α亞基中β5（含Arg151）所在loop的變化，小的虛線紅圈及紅色弧形箭頭標(biāo)明了AK-WT與AK-G359D的α亞基中Arg151側(cè)鏈方向的變化；紅色箭頭指向的是AK-WT中α亞基上Arg151與Glu74之間形成的雙配位基離子鍵）

圖8 天冬氨酸激酶野生型和突變體的三維結(jié)構(gòu)比對結(jié)果

為什么G359D突變體能有效解除賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同抑制呢？Yoshida等［12］通過對CgAKs幾種晶體結(jié)構(gòu)的解析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CgAK不與抑制劑結(jié)合時，其結(jié)構(gòu)比較松弛（CgAK-R），處于有活性狀態(tài)；而當(dāng)在蘇氨酸和賴氨酸同時存在時，將發(fā)生明顯的別構(gòu)而處于緊張狀態(tài)（CgAK-T），處于無活性構(gòu)象。具體機制為蘇氨酸的結(jié)合后引起α亞基的調(diào)節(jié)區(qū)域和β亞基的相互作用，然后賴氨酸的結(jié)合將進一步導(dǎo)致β-折疊構(gòu)象的改變，使β5（α）C末端的Arg151與底物結(jié)合位點Glu74之間形成雙配位基離子鍵，最終導(dǎo)致酶變?yōu)镃gAK-T狀態(tài)。Arg151與Glu74之間的離子鍵既阻止了底物天冬氨酸的結(jié)合，又穩(wěn)定了CgAK-T的非活性狀態(tài)。本實驗室在野生酶的研究基礎(chǔ)上，重建了AK-G359D突變體與賴氨酸和蘇氨酸結(jié)合狀態(tài)時的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了AK-G359D突變體解除協(xié)同抑制的分子機理。雖然G359D的突變并沒有解除其與賴氨酸之間的非共價鍵結(jié)合，但是與野生型酶相比，其活性中心附近的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。比如，β5（α）處于遠離活性中心的位置從而使位于β5（α）C末端的Arg151無法與底物結(jié)合位點Glu74之間離子鍵，因此有效阻斷了賴氨酸與蘇氨酸結(jié)合引起催化中心的別構(gòu)變化而解除其協(xié)同抑制。

為什么AK-G359D沒有解除賴氨酸單獨存在時的抑制，但能有效解除賴氨酸與蘇氨酸的協(xié)同抑制？類似情況也在Chen等［9］通過協(xié)同共進化發(fā)現(xiàn)的E328A突變體出現(xiàn)。結(jié)合酶活測定結(jié)果與蛋白結(jié)構(gòu)的比對分析發(fā)現(xiàn)，野生型CgAK是α2β2異源四聚體［12］，α亞基的N-末端為催化域，β亞基與α亞基的C-末端構(gòu)成了調(diào)節(jié)域。當(dāng)賴氨酸單獨存在時，賴氨酸會與α亞基的C-末端結(jié)合并使其發(fā)生別構(gòu)效應(yīng)，而與催化域之間形成了弱結(jié)合，導(dǎo)致賴氨酸對酶的部分抑制。Yoshida等［12］還發(fā)現(xiàn)賴氨酸是天冬氨酸的競爭性抑制劑。另外，G359位點本身是通過水分子的氫鍵作用而穩(wěn)定賴氨酸的結(jié)合。因此，在AKG359D中，雖然解除了G359與水分子間形成的氫鍵，但仍然可與賴氨酸結(jié)合，賴氨酸導(dǎo)致的別構(gòu)抑制與競爭性抑制仍然存在，因此賴氨酸對AK-G359D和AK-WT的抑制效果無顯著差異。當(dāng)蘇氨酸單獨存在時，蘇氨酸使β亞基與α亞基的C-末端結(jié)合而形成完整的調(diào)節(jié)域，但并不引起別構(gòu)變化，使酶仍為活性狀態(tài)。但AK-G359D在高濃度蘇氨酸存在時酶活卻略有下降，表明該位點的突變可能導(dǎo)致蘇氨酸結(jié)合后調(diào)節(jié)域的構(gòu)象改變而影響催化域的結(jié)構(gòu)。但是當(dāng)蘇氨酸與賴氨酸共同存在時，野生型AK-WT中，蘇氨酸結(jié)合后將強化賴氨酸與酶的結(jié)合，使調(diào)節(jié)域與N端的催化域之間形成強結(jié)合，酶處于完全抑制狀態(tài)，使酶活非常低。但在AK-G359D突變體中，蘇氨酸結(jié)合后調(diào)節(jié)域構(gòu)象改變，而無法加強賴氨酸的結(jié)合，使調(diào)節(jié)域不能再與催化域間形成強結(jié)合，而有效解除由賴氨酸導(dǎo)致的別構(gòu)抑制。

4 結(jié)論

本研究通過對野生型C. glutamicum ATCC 13032和賴氨酸高產(chǎn)菌C. glutamicum ZL5天冬氨酸激酶氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)C. glutamicum ZL5的天冬氨酸激酶中僅存在G359D的單點突變。體外純酶酶活檢測發(fā)現(xiàn)天冬氨酸激酶G359D突變體有效解除了賴氨酸與蘇氨酸協(xié)同抑制；在C. glutamicum ZL5體內(nèi)將天冬氨酸激酶G359D回復(fù)突變后發(fā)現(xiàn)賴氨酸產(chǎn)量下降，再次證明了天冬氨酸激酶G359D的突變是非常重要的突變。突變體和野生型的天冬氨酸激酶的三維結(jié)構(gòu)比對和成鍵分析發(fā)現(xiàn)，G359D的突變使Arg151與底物結(jié)合位點Glu74之間無法形成離子鍵，從而解除抑制劑的協(xié)同抑制。

致謝：衷心感謝曹國強老師與李慶剛老師在實驗設(shè)計方面給的幫助，感謝劉嬌老師在酶學(xué)性質(zhì)研究過程中給予的指導(dǎo)。

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Aspartokinase G359D from Corynebacterium glutamicum Relieves the Synergistic Inhibition of Lysine and Threonine

XU De-yu1，2ZHENG Xiao-mei2ZHAO Jing2ZHENG Ping2ZHAO Shu-xin1
（1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

Aspartokinase（AK）is a key enzyme involved in the lysine biosynthesis，but its activity is synergistically inhibited by end-products such as lysine and threonine. This study focuses on finding new mutation to relieve the synergistic inhibition and unveiling this molecular mechanism form protein structure analysis. The amino acid sequences of AK from high lysine-producing strain Corynebacterium glutamicum ZL5 and wild-type（WT）C. glutamicum ATCC 13032 were aligned，and it was shown that G359D mutation was detected in aspartokinase from C. glutamicum ZL5. To discovery the biological function of this mutation，these WT and G359D Aks were expressed in Escherichia coli and were purified by the affinity chromatography；then，the purified recombined proteins were used for enzymatic activity detection when added the inhibitors lysine and threonine. The G359D protein displayed high resistance against the synergistic inhibition of lysine and threonine. The enzymatic activity of G359D remained at 76.94%±1.61% when the concentration of lysine and threonine reached 10 mmol/L，but the WT protein only was in 4.38%±1.28%. The similar result was also verified by the reverse mutation of G359D in the genome of C. glutamicum ZL5 producing high lysine yield，and the lysine yield decreased by 15.57%. From the further homology modeling and protein structure analysis，the G359D still interacted with lysine and threonine，but it enabled to relieve the allosteric effect of lysine，resulting from that the Arg151and Glu74in the catalytic active site of G359D could not form the ionic bond，thus allow the substrate into the active site. The aspartokinases G359D enabled to relieve the synergistic inhibition of lysine and threonine by blocking the allosteric effect of lysine.

Corynebacterium glutamicum；aspartokinase；lysine；threonine；synergistic inhibition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0387

2017-05-11

中國科學(xué)院重點部署項目（ZDRW-ZS-2016-2）

徐德雨，男，碩士研究生，研究方向：輕工技術(shù)與工程（發(fā)酵工程）；E-mail：xu_dy@tib.cas.cn

鄭平，女，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：細菌的代謝工程改造和系統(tǒng)生物學(xué)；E-mail：zheng_p@tib.cas.cn趙樹欣，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：色素紅曲以及現(xiàn)代釀造技術(shù)；E-mail：zsx999@tust.edu.cn

（責(zé)任編輯 朱琳峰）