紫外分光光度計法測定茶葉中鄰苯基苯酚的含量

陳 迪 ，劉楠囡 ，林 雯 ，陳 哲 ，林 峰 ，馬 艷 ，李秀華 ，

（1.福州出入境檢驗檢疫局，福建福州 350001；2.福建師范大學化學與化工學院，福建福州 350108；3.漳州出入境檢驗檢疫局，福建漳州 350006；4.閩江師范高等?？茖W校化學與生物工程系，福建 福州 350000）

紫外分光光度計法測定茶葉中鄰苯基苯酚的含量

陳 迪1，劉楠囡2，林 雯3，陳 哲4，林 峰1，馬 艷1，李秀華2，1

（1.福州出入境檢驗檢疫局，福建福州 350001；2.福建師范大學化學與化工學院，福建福州 350108；3.漳州出入境檢驗檢疫局，福建漳州 350006；4.閩江師范高等?？茖W校化學與生物工程系，福建 福州 350000）

為建立茶葉中的鄰苯基苯酚含量的測定方法，利用甲醇:水(7:3)作為萃取劑,萃取方法選擇超聲波萃取法，萃取出茶葉中的鄰苯基苯酚，采用紫外分光光度法，建立鄰苯基苯酚標準曲線對其進行含量測定。對萃取劑，緩沖液，最適宜pH值等條件進行優(yōu)化。優(yōu)化后的鄰苯基苯酚濃度與吸光度具有良好線性關系，線性相關系數(shù)為0.994，加標回收率在90.1%～91.2%之間，證明該方法切實可行。該研究為通過超聲波萃取結合紫外分光光度法能夠測定茶葉中鄰苯基苯酚，并且該方法具有準確度高，反應靈敏，操作簡便等優(yōu)點。

茶葉；超聲波提取法；鄰苯基苯酚；紫外分光；標準曲線

食品的三大機能：營養(yǎng)學特性、嗜好性感官品質(zhì)特征、對人體的調(diào)節(jié)技能或保健機能。茶葉是為數(shù)不多的同時具備這三大機能要求的完美食品。茶不僅能夠帶給人們味覺的享受，還能夠促進人們的身體健康，種種好處使得茶受到越來越多人的歡迎。飲茶、品茶已經(jīng)成為人們生活中不可缺少的一部分。隨著茶葉風靡全球，越來越多人開始重視茶葉的質(zhì)量和安全問題。但是在茶葉的生長過程中，為了殺蟲除菌、提高增產(chǎn)率，不可避免的會使用到農(nóng)藥，農(nóng)藥會殘留在茶葉上極難清除，也不可避免的會對環(huán)境和人類健康產(chǎn)生危害或者有潛在的威脅。有資料顯示，中國的茶樹除了有機茶被限制不能噴灑農(nóng)藥，99%的茶樹都或多或少的噴撒了農(nóng)藥?，F(xiàn)在世界上有近30億人飲用茶，世界各地都有種植茶葉和茶葉進出口貿(mào)易，在如此大的需求面前，許多國家制定的農(nóng)藥殘留相關法規(guī)并沒有那么完善，大部分國家只標明了茶葉中農(nóng)藥殘留的最大標準，而并不是禁止農(nóng)藥殘留的存在。同時各個國家對茶葉的農(nóng)藥殘留相關的法律法規(guī)也不統(tǒng)一，例如，歐洲因為地域氣候關系不適合種植茶葉，同時對食品的安全衛(wèi)生要求更高，因此它對茶葉農(nóng)藥殘留的標準最嚴格，而中國的產(chǎn)茶量和出口量居世界領先，但由于國外貿(mào)易壁壘日趨嚴格，導致了中國茶葉的出口量減少[1]，主要原因是因為中國關于茶葉農(nóng)藥殘留量的指標還未完善[2]。這幾年茶葉農(nóng)殘相關國家標準不斷更新出臺，可見茶葉中農(nóng)藥殘留問題越來越受到重視[3]。

近五年，歐盟對茶葉相關法規(guī)進行了多達69次修訂，茶葉農(nóng)殘標準限制對象已經(jīng)從茶園中使用的一般農(nóng)藥擴展到草甘膦等除草劑，再到蒽醌、多氯酸鹽等環(huán)境污染物。最近出口歐盟的茶葉中又查出鄰苯基苯酚這一防腐殺菌劑，鄰苯基苯酚是一種能夠致癌的物質(zhì)，對腎臟會產(chǎn)生毒副作用，危害人體健康，因此迫切需要建立一種高效，快捷的方法來測定茶葉中鄰苯基苯酚。鄰苯基苯酚，又叫做2-羥基聯(lián)苯(ortho-phenylpheno，簡稱OPP)，一般為白色片狀或塊狀，具有一定生物毒性。鄰苯基苯酚具備良好的殺菌殺毒能力，是常用的防腐劑之一，一般都用在對果蔬類的防腐和保鮮，或者是用于紡織品、橡膠制品、化妝品等當中的消毒劑和防腐劑。目前，OPP殘留檢測的主要方法有液相色譜法[4-7]、氣相色譜法或氣相色譜-質(zhì)譜法[8-10]。色譜法分析成本高，色譜儀價格及日常維護費用貴，分析時間一般比較長。而紫外檢測器是最普遍的檢測途徑，大部分物質(zhì)在液體狀態(tài)下都有紫外檢測光譜，其吸光值和其濃度呈現(xiàn)一定的線性關系，且不同的物質(zhì)的紫外峰基本都是唯一峰，并且紫外分光光光度法適合大眾能夠做到的檢測方法，它還擁有分析成本低、紫外檢測儀價格及日常維護費用低、準確度高、使用方便等優(yōu)點。

茶葉中因含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)和化合物，增加了茶葉前處理的難度。而茶葉的前處理是整個分析過程的重要步驟，高效快速的提取方法更是茶葉中農(nóng)藥殘留分析的核心，直接影響后期檢測方法的準確度。因此農(nóng)藥殘留分析茶葉的前處理要求提取率高，盡量少用或不用有機溶劑[11]，以減少污染。常見的樣品前處理方法主要有干法灰化法、固相萃取法、超聲波提取法等[12-14]，通過查閱文獻[15-20]，本實驗采用超聲波萃取法作為茶葉的前處理方法。超聲波提取法是利用超聲波強化提取作用，即媒質(zhì)產(chǎn)生獨特的機械振動作用和空化作用，機械振動作用將超聲波的能量傳遞給樣品，使組分脫附和溶解加快；空化作用使分子運動加快[21]。超聲波提取法操作簡單，并且它擁有操作簡便、提取效率高，可克服常規(guī)方法的被測成分在多次轉(zhuǎn)移中損失，從而影響檢測準確性的缺點。近年來超聲波提取法在茶葉的前處理中有著廣泛應用[19-21]。

本文將專門講述先用甲醇：水，甲醇，乙醇溶液分別為提取試劑，并采用超聲波萃取來提取茶葉中的鄰苯基苯酚，結合紫外分光光度計分析在不同緩沖液中，不同pH值下鄰苯基苯酚的最大吸收峰并繪制標準曲線，通過計算加標回收率確定方法的準確性。從而建立了一種快速簡便地檢測茶葉中鄰苯基苯酚含量的方法。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

1.1.1 試劑

2-苯基苯酚，Rd，Nanqiao Twon，F(xiàn)engxian Shanghai，China；甲醇，AR，國藥集團化學試劑有限公司；乙醇，AR，國藥集團化學試劑有限公司；茶葉，西湖龍井，浙江省杭州市1.1.2 儀器設備

紫外可見分光光度計，UV1901PC，上海棱光技術有限公司；電子天平，ML104/02，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超聲波清洗器，KQ3200E，昆山市超聲儀器有限公司

2 結果與討論

2.1 最佳溶劑（萃取劑）的選擇

鄰苯基苯酚微溶于水，因此選擇了三種不同極性的溶劑[22-23]（甲醇：水，甲醇，乙醇）來進行比較選出最佳溶劑。

稱取鄰苯基苯酚，在其他制備條件保持不變的前提下，使用三種不同溶劑：甲醇：水（7:3）、甲醇、乙醇分別配制6 μg/mL，分別以不同溶劑作為空白進行基線的確定，在190～400 nm波長范圍內(nèi)多次進行光譜的連續(xù)掃描，并作出紫外峰來進行比較。可知甲醇：水（7:3）紫外吸收峰最好，并采用其作為溶液的溶劑（萃取劑）。實驗結果可知，甲醇：水（7:3），甲醇，乙醇三種萃取劑的標準溶劑吸收曲線峰形一致，在其他條件不變的是情況下，甲醇：水（7:3）溶劑的紫外峰最大吸收波長處的吸光值最好，更故采用甲醇：水（7:3）作為樣品的萃取劑。

2.2 OPP紫外檢測方法優(yōu)化

2.2.1 OPP最大吸收波長的選擇

吸取2 μg/mL的OPP溶液于比色皿中，以甲醇：水（7:3）溶劑作為空白進行基線的確定，在190～400 nm波長范圍內(nèi)多次進行光譜的連續(xù)掃描，如圖（1），以確定OPP的最大吸收波長。

圖（1） 最大吸收波長的確定

由圖（1）可知，鄰苯基苯酚在190～400 nm范圍內(nèi)，在201.0、283.5 nm波長處均有吸收峰，其中以201.0 nm處的吸收峰最強，無雜峰干擾且較為穩(wěn)定，適合作為最大吸收波長進行實驗。

2.2.2 OPP適宜緩沖液的選擇

在三組6 μg/mL的OPP溶液分別加入pH=8.5的不同的緩沖液（BR緩沖液，PBS緩沖液，醋酸緩沖液），分別加入于比色皿中，以甲醇：水（7:3）溶劑作為空白進行基線的確定，在其他制備條件保持不變的前提下，在190～400 nm波長范圍內(nèi)多次進行光譜的連續(xù)掃描，通過其紫外峰的最大吸收峰來確定最適宜的緩沖液。實驗結果可知，三種不同緩沖液（BR緩沖液，PBS緩沖液，醋酸緩沖液）對于OPP標準液的影響的不同程度，其中醋酸緩沖液所得吸光值最大，但因其最大吸收波長處也導致偏離，故選用BR緩沖液作為OPP溶液的適宜緩沖液。

2.2.3 OPP最適宜緩沖液pH值的選擇

通過查閱文獻可知[24]，在酸性條件下,pH對OPP的紫外吸收影響不大，故在 6μg/mL 的 OPP 溶液中加入 pH 值為 6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10 的 BR 緩沖液，并測其最大吸收峰。根據(jù)不同pH值測得的吸光度繪制pH值與吸光度的變化關系。得出6 μg/mL OPP標準溶液在不同pH值下BR緩沖液的吸光值，可知OPP標準溶液在pH=7.5下的吸光值最好。

2.3 OPP標準曲線的繪制

從上述 OPP 儲備液（200.0 μg/mL）標準溶液中精確吸取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1mL 定容于 10mL 容量瓶，配制 2、4、6、8、10、12、20 μg/mL 質(zhì)量濃度的標準溶液。從2 μg/mL標準溶液中吸取5mL定容于10mL容量瓶中配制1μg/mL溶液。從20μg/mL標準溶液中吸取 0.1、0.25、0.75mL定容至 10mL容量瓶中配制 0.2、0.5、1.5μg/mL 溶液。從1μg/mL 標準溶液中吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2mL 定容至 10mL 容量瓶中配制 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12μg/mL溶液。標準溶液均用甲醇：水（7:3）定容，采用最佳緩沖液的pH值，并在最大吸收波長處進行紫外掃描得出OPP標準曲線并計算出線性相關系方程如圖（2）。

圖（2） OPP標準曲線

測定不同濃度鄰苯基苯酚標準品溶液在最大吸收波長處的吸光值，繪制標準曲線圖（2），可知鄰苯基苯酚濃度與吸光度沒有呈直線關系，通過分析，取lgC為橫坐標，A為縱坐標，并擬合得到回歸方程：y=0.3x+1.505，線性相關系數(shù)為0.994。由圖（2）可以看出當標準溶液質(zhì)量濃度在0.02～12μg/mL范圍內(nèi)，鄰苯基苯酚標準曲線的線性關系良好。說明使用該曲線測定待測樣品的鄰苯基苯酚含量具有較高的準確性。

2.4 樣品的預處理與測定

2.4.1 樣品的預處理

稱取0.1g茶葉樣品，碾碎于離心瓶中加入甲醇：水（7：3）萃取劑10mL，在超聲波清洗器中超聲提取20分鐘，將萃取劑倒出在10mL燒杯中備用。

2.4.2 樣品的測定和樣品加標回收率的測定

提取超聲后的萃取劑0.1 mL稀釋至10 mL,加入BR緩沖液，以甲醇：水（7:3）溶劑作為空白進行基線的確定，作出樣品的紫外峰與OPP標準溶液的紫外峰圖進行比較。

量取上述稀釋后樣品溶液均勻液體試樣5 mL，裝入比色皿中在最大波長處進行紫外掃描，確定空白樣品中OPP的含量。然后分別量取3份均勻液體試樣5mL，加入5 mL質(zhì)量濃度為 0.5、2、8 μg/mL的OPP溶液。以甲醇：水（7:3）溶劑作為空白進行基線的確定，采用最佳緩沖液的PH值，在最大波長處進行紫外掃描。每組回收率測定3次，取平均值進行計算，計算結果如表1所示，由此可見，其加標回收率范圍在90.1%～91.2%，回收率在正常范圍內(nèi)，符合加標回收率的標準，證明方法是可行的。

表一 OPP加標回收率測定結果

1.3.4 干擾物實驗的測定

為確定茶葉中是否有其他物質(zhì)干擾影響實驗結果的測定，分別配制兒茶素、咖啡因、維生素C 6μg/mL，取1mL裝入比色皿中，作出三種物質(zhì)的紫外吸收峰，和OPP標準溶液的紫外峰圖進行比較，觀察是否對最大波長處的吸收峰有影響。實驗證明上述物質(zhì)對該檢測方法均無干擾。

3 總結

本實驗建立了茶葉中的鄰苯基苯酚含量的測定方法，具有準確性和穩(wěn)定性。利用甲醇:水（7:3）作為萃取劑，萃取方法選擇超聲波萃取法，萃取出茶葉中的鄰苯基苯酚，并采用紫外分光光度法，建立鄰苯基苯酚標準曲線對其進行含量測定，對標準曲線的萃取劑，緩沖液，最適宜pH值等條件進行優(yōu)化。在在0.02～12μg/mL范圍內(nèi)，鄰苯基苯酚濃度與吸光度具有良好線性關系，其相關系數(shù)為0.994，加標回收率在90.1%～91.2%之間，符合加標回收率的標準，證明方法是可行的。結論為通過超聲波萃取結合紫外分光光度法能夠測定茶葉中鄰苯基苯酚，并且該方法具有準確度高，反應靈敏，操作簡便等優(yōu)點。

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福州市科技局項目（No.2015-s-160,2015-G-72），福建省科技廳項目（2017J01620；2016J05026）

陳 迪（1982-），女，江蘇人，農(nóng)業(yè)推廣碩士，工程師，研究方向進出口茶葉貿(mào)易與檢驗。