SPECT/光聲雙模態(tài)納米探針在肝成像中的應(yīng)用

張曉潔 王慶大 連云宗

SPECT/光聲雙模態(tài)納米探針在肝成像中的應(yīng)用

張曉潔 王慶大 連云宗

目的肝纖維化、肝硬化、肝癌等疾病嚴(yán)重威脅人類健康。通過特異性納米探針對(duì)肝臟疾病進(jìn)行檢測(cè)，為治療策略的制訂提供參考。材料與方法本研究以牛血清白蛋白為骨架，在白蛋白上修飾半乳糖基團(tuán)用于靶向肝臟上的去唾液酸糖蛋白受體，通過氯胺-T標(biāo)記法進(jìn)行放射性碘的標(biāo)記，并在白蛋白內(nèi)包裹吲哚菁綠分子形成肝靶向的納米顆粒。分別進(jìn)行納米顆粒的粒徑及光譜表征、生物分布、SPECT顯像以及光聲成像實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表征實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該納米顆粒的粒徑為86.4 nm，在705、780 nm處有明顯吸收峰。生物分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該放射性標(biāo)記的納米顆粒在肝臟的分布60 min時(shí)可達(dá)到（55.52±5.39）%ID/g，而受體抑制后，肝臟攝取降為（37.01±7.38）%ID/g，抑制效果明顯（P＜0.05）；該材料的肝攝取在240 min時(shí)依舊保持在（34.22±4.44）%ID/g，而在其他器官中，放射性標(biāo)記物的分布值較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SPECT及光聲成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果與生物分布數(shù)據(jù)一致，肝臟上面有最高信號(hào)，適于進(jìn)行肝的成像。結(jié)論131I標(biāo)記的白蛋白納米顆粒是一種性質(zhì)優(yōu)良的肝靶向雙模態(tài)探針，有望用于肝疾病的檢測(cè)。

體層攝影術(shù)，發(fā)射型計(jì)算機(jī)，單光子；納米粒子；分子探針；光學(xué)；聲學(xué)；診斷顯像；模型，動(dòng)物；小鼠

肝纖維化、肝硬化以及肝癌是嚴(yán)重危害人類健康的肝臟疾病。影像學(xué)檢測(cè)是發(fā)現(xiàn)病灶的主要手段之一，如能夠早期發(fā)現(xiàn)肝臟病變并對(duì)肝臟功能狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)指導(dǎo)治療和評(píng)價(jià)預(yù)后意義重大。去唾液酸糖蛋白（asialoglycoprotein，ASGP）受體主要位于哺乳動(dòng)物的肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜表面，少部分位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，可參與肝臟的血清蛋白代謝。發(fā)生肝癌、肝硬化、肝纖維化等肝臟疾病時(shí)，ASGP受體的數(shù)量及活性下降，肝功能降低[1-5]。因此，檢測(cè)ASGP受體有助于判斷肝臟功能。隨著各種顯像手段的發(fā)展，越來越多的探針針對(duì)ASGP受體這一位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)制備。隨著醫(yī)學(xué)影像的飛速發(fā)展，將具有不同功能的成像模式結(jié)合起來，為病情診斷提供更多元、更豐富的互補(bǔ)信息，成為這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[6-8]。本研究擬將單光子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層掃描（SPECT）成像與光聲成像相結(jié)合，合成ASGP受體靶向的納米顆粒131I-LBI-NPs用于SPECT/光聲雙模態(tài)成像，以期作為一種肝臟疾病的顯像探針，豐富疾病的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 主要材料及動(dòng)物 VFD1000型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；γ-計(jì)數(shù)儀（西安核儀器廠）；小動(dòng)物SPECT成像儀（匈牙利Mediso公司）；小動(dòng)物光聲成像儀（美國(guó)Endra Life Sciences）。Na131I來自福建省泉州市第一醫(yī)院；牛血清白蛋白、吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）、氯胺-T購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。KM小鼠4周齡，雌性，體重16～18 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2 LBI-NPs的制備及131I標(biāo)記 半乳糖修飾的牛血清白蛋白（LB）的合成：將500 mg乳糖酸溶解于去離子水中，待其全部溶解后加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽534 mg及N-羥基琥珀酰亞胺321 mg。在室溫下反應(yīng)2 h后加入1 g牛血清白蛋白，待其全部溶解后用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為9，繼續(xù)反應(yīng)3 d。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液移至透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量7×103）中，使用去離子水透析3 d。收集透析后的溶液并進(jìn)行冷凍干燥，得到淡黃色固體即為乳糖酸修飾的LB。

131I標(biāo)記的LB溶液的制備：采用氯胺-T法對(duì)LB進(jìn)行131I標(biāo)記。將10 mg LB溶解于1 ml PBS（pH值為7.8），加入Na131I溶液3 mCi，混合后，加入新配置的氯胺-T 50 μg/20 μl。迅速振蕩混勻，室溫下反應(yīng)5 min。然后加入還原劑偏重亞硫酸鈉100 μg/40 μl，以終止碘化反應(yīng)，即得到131I標(biāo)記的LB溶液。

131I標(biāo)記的LBI-NPs的制備：取131I標(biāo)記的LB溶液，攪拌并加入5 mg還原型谷胱甘肽，反應(yīng)30 min后緩慢加入5 mg ICG，繼續(xù)反應(yīng)1 h。然后加入1.1 ml無水乙醇，繼續(xù)攪拌30 min。反應(yīng)完成后將反應(yīng)液移至透析袋中，在偏堿性溶液中4℃條件下透析過夜。透析完成后收集透析袋中的溶液，即得到131I-LBI-NPs分散液。以聚酰胺薄膜/生理鹽水為層析體系，可以測(cè)定標(biāo)記率。

1.3131I-LBI-NPs標(biāo)記率的鑒定 用毛細(xì)管吸取131I-LBINPs分散液在聚酰胺薄膜底端點(diǎn)樣，自然吹干。然后用生理鹽水展開。131I-LBI-NPs的Rf值為0～0.1，游離的131I-的Rf值為0.4～0.5。層析結(jié)束后將紙條剪成10段，用γ放射性計(jì)數(shù)儀檢測(cè)計(jì)數(shù)，計(jì)算標(biāo)記率。

1.4131I-LBI-NPs的光譜及粒徑測(cè)定 由于131I具有放射性，在此以穩(wěn)定的127I代替131I進(jìn)行光譜和粒徑的測(cè)試。取少量127I-LBI-NPs，用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸收光譜。此外，取少量127I-LBI-NPs，利用粒度儀及電鏡測(cè)定其粒徑及納米顆粒形貌。

1.5131I-LBI-NPs在小鼠體內(nèi)的分布 將20只KM小鼠隨機(jī)分為5組，每組4只，每只小鼠尾靜脈注射10 μCi131I-LBI-NPs，注射后分別于5、30、60、240 min將小鼠斷頭處死，取心臟、肝、肺、腎、脾、胃、骨、肉、腸、血稱重，隨后測(cè)定各個(gè)器官的放射性計(jì)數(shù)，并計(jì)算單位每克組織攝取放射性占注入量的百分率（%ID/g）；抑制組提前5 min注射1 mg LB進(jìn)行抑制。

1.6 小鼠SPECT成像實(shí)驗(yàn) 另取3只正常小鼠進(jìn)行SPECT成像。在注射放射性標(biāo)記物前10 min注射NaI溶液對(duì)小鼠甲狀腺進(jìn)行封閉。通過尾靜脈注射131I-LBI-NPs 100 μCi，小鼠顯像過程中進(jìn)行異氟烷麻醉并固定在顯像倉(cāng)中，每只小鼠跟蹤掃描5 min、30 min、60 min的成像。采用低能高分辨準(zhǔn)直器、斷層采集，矩陣為256×256，旋轉(zhuǎn)360°，每15°采集一幀，每幀采集30 s。

1.7 小鼠光聲成像實(shí)驗(yàn) 另取3只正常小鼠進(jìn)行光聲成像實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行成像前將小鼠胸腔前的毛發(fā)去除洗凈，以避免其對(duì)光聲成像的干擾。通過尾靜脈注射200 μl131I-LBI-NPs的透析液，并將小鼠用異氟烷進(jìn)行麻醉。進(jìn)行圖像掃描時(shí)將小鼠的胸腔緊貼托盤底部，使肝臟部位對(duì)準(zhǔn)托盤中心位置，此項(xiàng)操作可排除其他器官的信號(hào)干擾。每只小鼠采集注射前以及注射后5 min、30 min、60 min的成像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件，生物分布結(jié)果以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

2 結(jié)果

2.1131I-LBI-NPs的標(biāo)記率及光譜和粒徑測(cè)定 以聚酰胺薄膜/生理鹽水為層析體系進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)記率達(dá)90%以上。通過動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定納米顆粒的粒徑大小為86.4 nm，且形態(tài)分布均勻（圖1）。通過測(cè)定吸收光譜可見，其在705 nm及780 nm有2個(gè)明顯的吸收峰，與ICG的吸收峰一致，證明ICG被包裹在白蛋白內(nèi)。

2.2131I-LBI-NPs在小鼠體內(nèi)的分布 生物分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過靜脈給藥后131I-LBI-NPs納米顆粒在小鼠體內(nèi)主要分布于肝組織上（P＜0.05），見表1。肝的攝取在60 min達(dá)到最高，為（55.52±5.39）%ID/g。在受體抑制后，60 min時(shí)間點(diǎn)的攝取下降到（37.01±7.38）%ID/g，抑制效果明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），證明納米顆粒的肝臟攝取與ASGP受體靶向有關(guān)。在前期階段，相對(duì)于脾、胃等其他正常組織或器官，心臟和血液的分布較高，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)清除較快。在240 min時(shí)，放射性標(biāo)記物在胃的分布很高，僅次于肝臟攝取，而在其他器官中，放射性標(biāo)記物的分布值更低，肝臟與其他器官差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可能與脫碘有關(guān)。240 min后，在其他器官中，131I-LBI-NPs的分布較少。

圖1 127I-LBI-NPs粒徑分布（A）及127I-LBI-NPs吸收光譜（B）

表1 131I-LBI-NPs在小鼠體內(nèi)的生物分布（±s，%ID/g，n=4）

表1 131I-LBI-NPs在小鼠體內(nèi)的生物分布（±s，%ID/g，n=4）

組織不同時(shí)間各組織的放射性攝取5 min 30 min 60 min 240 min 60 min抑制心臟 11.34±3.98 6.81±1.44 4.59±1.08 1.77±0.37 6.39±1.11肝41.41±5.54 4 6.65±7.39 5 5.52±5.39 3 4.22±4.44 3 7.01±7.38肺8.38±1.39 4.14±1.04 3.23±0.56 2.10±0.49 4.22±1.22腎3.01±0.86 2.49±0.49 2.02±0.31 1.79±0.33 2.43±0.32脾6.36±2.32 7.23±3.01 5.71±1.73 4.20±1.03 5.43±1.43胃2.11±0.23 2.48±0.73 3.64±0.97 9.25±2.55 4.70±0.78骨1.03±0.15 1.44±0.44 0.89±0.43 0.80±0.27 0.98±0.22肉1.32±0.43 0.67±0.09 0.58±0.17 0.47±0.16 0.56±0.19腸1.90±0.77 2.32±0.23 2.45±1.02 4.86±1.63 3.11±0.84血液 9.30±3.87 4.50±1.25 4.12±1.89 2.03±0.45 6.77±1.49

2.3 SPECT成像實(shí)驗(yàn) SPECT顯像可見，與生物分布的結(jié)果一致，放射性主要集中于肝臟，而在其他器官中分布較少（圖2）。在60 min時(shí)，肝臟上的分布最高，由此在60 min會(huì)得到更佳的成像效果。由于提前注射了NaI溶液進(jìn)行甲狀腺抑制，故顯像中未觀察到甲狀腺上有明顯的放射性信號(hào)存在。為了更好地與各組織器官進(jìn)行對(duì)位匹配，同時(shí)進(jìn)行CT的輔助定位成像。

2.4 光聲成像實(shí)驗(yàn) 與SPECT成像不同，光聲成像無法進(jìn)行全身成像，故只能采集肝臟部位的光聲信號(hào)。由顯像結(jié)果可見，與注射前相比，注射后肝臟上的光聲信號(hào)明顯增加，說明探針在肝臟的分布明顯（圖3）。與生物分布及SPECT顯像結(jié)果一致，其在60 min時(shí)間點(diǎn)，肝臟分布達(dá)到最高值。

圖2 131I-LBI-NPs在小鼠體內(nèi)的SPECT成像

圖3 131I-LBI-NPs在小鼠肝臟的光聲信號(hào)

3 討論

多模態(tài)成像探針的構(gòu)建需要合適的平臺(tái)，而高靈敏度、智能化、具有獨(dú)特物理與化學(xué)性質(zhì)的納米材料在這方面優(yōu)勢(shì)非常明顯，能夠最大限度地滿足多模式成像探針的制備需求。通過結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、可控合成及表面修飾，可以得到功能豐富、生物相容性良好的納米材料，從而實(shí)現(xiàn)具有靶向功能的多模態(tài)成像。本研究采用牛血清白蛋白作為骨架。牛血清白蛋白由多種氨基酸殘基組成，其相對(duì)分子質(zhì)量約為66×103，在結(jié)構(gòu)上有多個(gè)二硫鍵，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)可以作為多種染料或小分子藥物的載體[9-11]。還原型谷胱甘肽可使白蛋白上的二硫鍵斷裂，這一斷裂在聚集的過程有利于對(duì)ICG等染料進(jìn)行包裹形成納米顆粒[12]。本研究在設(shè)計(jì)上也正是利用了白蛋白的這一特性。此外，白蛋白結(jié)構(gòu)上的酪氨酸基團(tuán)是碘標(biāo)記的常用基團(tuán)。選擇氯胺-T法進(jìn)行標(biāo)記，效率高、重復(fù)性好，是目前使用較多的碘標(biāo)記方法。

光聲成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靜脈注射后131I-LBI-NPs主要分布于肝臟。通常大顆粒的納米顆?？赡軙?huì)在脾和肺上聚集較多。但本研究中，脾和肺的聚集量較少，可能與探針進(jìn)行了半乳糖修飾有關(guān)。成功的半乳糖修飾更有利于幫助納米顆粒靶向肝臟部位，提高肝的攝取率。

目前，99Tcm在臨床上應(yīng)用更為廣泛，主要是由于Mo-Tc發(fā)生器的推廣應(yīng)用，該發(fā)生器大大簡(jiǎn)化了核素獲取途徑。同時(shí)，99Tcm標(biāo)記藥物大多可以實(shí)現(xiàn)藥盒化，簡(jiǎn)化了標(biāo)記步驟。99Tcm的半衰期較短，僅有6 h，納米顆粒的制備及純化時(shí)間較長(zhǎng)，故本研究采用半衰期更長(zhǎng)的131I核素，其除可用于SPECT成像外，還可用于放射性核素治療。此外，125I也可用于SPECT成像。在標(biāo)記位點(diǎn)的選擇上，通過氯胺-T法進(jìn)行標(biāo)記可使放射性碘標(biāo)記在白蛋白結(jié)構(gòu)上的酪氨酸基團(tuán)。而99Tcm的標(biāo)記需通過化學(xué)反應(yīng)引入雙功能螯合劑，該過程可能會(huì)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)造成破壞。

本研究中，由生物分布的結(jié)果可見，131I-LBI-NPs在體內(nèi)會(huì)存在脫碘過程，因此在60 min時(shí)間點(diǎn)或更早的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行成像，可以保證成像質(zhì)量。盡管SPECT成像技術(shù)在肝臟疾病成像中優(yōu)勢(shì)明顯，但由于131I為放射性核素，會(huì)產(chǎn)生輻射劑量的問題。光聲成像不需要運(yùn)用放射性核素進(jìn)行成像，更為安全。但由于穿透深度的不足，目前主要用于淺表組織檢測(cè)或小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。此外，其無法像SPECT成像一樣提供全身成像信息。在以往的小動(dòng)物光聲成像實(shí)驗(yàn)中，大多以腫瘤的血管成像為主。光聲成像用于肝臟組織的報(bào)道很少。因此，本研究可以為光聲的肝成像提供借鑒。鑒于其在腫瘤血管成像方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，使之有可能在肝臟腫瘤的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。當(dāng)然，由于不同的成像方法存在明顯的優(yōu)缺點(diǎn)，且關(guān)注點(diǎn)不同，目前光學(xué)成像與核醫(yī)學(xué)成像無法相互替代。不同成像模式之間更多的是互補(bǔ)關(guān)系。將SPECT及光聲2種成像手段進(jìn)行融合，并研究該結(jié)合模式在監(jiān)測(cè)肝臟疾病尤其是肝臟腫瘤方面的表現(xiàn)具有重要意義，該策略也為醫(yī)院和患者提供了更多的選擇。同時(shí)，將這2種顯像信息進(jìn)行匹配，可以大大提高診斷的準(zhǔn)確性，符合精準(zhǔn)醫(yī)療的要求。

總之，更為準(zhǔn)確的肝顯像方法會(huì)為肝臟疾病的治療和評(píng)價(jià)預(yù)后提供更為有效的依據(jù)和信息，在肝臟疾病的發(fā)生過程中，肝臟ASGP受體減少，能夠有效靶向于ASGP受體的探針將能夠有效反映疾病的程度。因此，本研究中的131I-LBI-NPs也有望用于肝纖維化、肝硬化、肝癌等模型的顯像。

[1]Beppu T,Hayashi H,Okabe H,et al.Liver functional volumetry for portal vein embolization using a newly developed Tc-99m-galactosyl human serum albumin scintigraphy SPECT-computed tomography fusion system.J Gastroenterol,2011,46(7): 938-943.

[2]項(xiàng)燦宏,董家鴻.利用Tc-GSA SPECT/CT顯像技術(shù)評(píng)估肝臟儲(chǔ)備功能的研究.北京: 解放軍總醫(yī)院,2011.

[3]Kim EM,Jeong HJ,Kim SL,et al.Asialoglycoprotein-receptor-targeted hepatocyte imaging using99Tcmgalactosylated chitosan.Nucl Med Biol,2006,33(4): 529-534.

[4]de Graaf W,Bennink RJ,Vetelainen R,et al.Nuclear imaging techniques for the assessment of hepatic function in liver surgery and transplantation.J Nucl Med,2010,51(5): 742-752.

[5]Van Beers BE,Daire JL,garteiser P.New imaging techniques for liver diseases.J Hepatol,2015,62(3): 690-700.

[6]邢巖,趙晉華.放射性核素標(biāo)記納米探針在腫瘤多模態(tài)分子影像學(xué)中的應(yīng)用.中國(guó)醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志,2015,23(2):144-147.

[7]周暉,吳俊嬌,范潔琳.多模態(tài)分子影像技術(shù)應(yīng)用于腫瘤的研究進(jìn)展.中國(guó)醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志,2011,19(10): 794-797.

[8]陳飛,郝蘭,嚴(yán)思靜,等.載血卟啉單甲醚納米高分子微球的制備及顯像實(shí)驗(yàn).中國(guó)醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志,2016,24(8):632-636.

[9]Chen Q,Wang C,Zhan Z,et al.Near-infrared dye bound umin with separated imaging and therapy wavelength channels for imaging-guided photothermal therapy.Biomaterials,2014,35(28): 8206-8214.

[10]Chen Q,Liang C,Wang X,et al.An albumin-based theranostic nano-agent for dual-modal imaging guided photothermal therapy to inhibit lymphatic metastasis of cancer post surgery.Biomaterials,2014,35(34): 9355-9362.

[11]Lam PL,Kok S,Gambari R,et al.Evaluation of berberine/bovine serum albumin nanoparticles for liver fibrosis therapy.Green Chemistry,2015,17(3): 1640-1646.

[12]Sheng Z,Hu D,Zheng M,et al.Smart human serum albumin-indocyanine green nanoparticles generated by programmed assembly for dual-modal imaging-guided cancer synergistic phototherapy.ACS Nano,2014,8(12): 12310-12322.

（本文編輯 周立波）

Albumin-based SPECT/Photoacoustic Dual-modality Nanoprobe in Liver Imaging

ZHANG XiaojieWANG QingdaLIAN Yunzong

PurposeLiver fibrosis,liver cirrhosis and liver cancerseriously threaten human health.To detect liver diseases by specific nanoprobes,and to provide reference for the formulation of treatment strategies.Materials and MethodsIn this study,bovine serum albumin was used as a skeleton and modified with galactose groups for targeting asialoglycoproteinreceptors on liver.The albumin was labeled with radioactive iodine by chloramines T method,and indocyanine green molecules was encapsulated to form livertargeting nanoparticles.Physical and chemical characterization (particle size and spectral characterization),bio-distribution,SPECT imaging and photoacoustic imaging were carried out respectively.ResultsThe size of the nanoparticles was about 86.4 nm and there were two obvious absorption peaks at 705 nm and 780 nm.Bio-distribution showed that the radiolabeled nanoparticles had a high distribution in liver at 60 min [(55.52±5.39)%ID/g],while after the receptor was inhibited,the uptake in liver was reduced to(37.01±7.38)%ID/g,indicating a significant inhibitory effect (P＜0.05); the uptake of this material at 240nm still remained (34.22±4.44)%ID/g,while in other organs,the detected uptake was quite low,with a statistically significant difference (P＜0.05).The results of SPECT and photoacoustic imaging were consistent with the data of bio-distribution,and images showed highest signal on liver.Thus,the probe was suitable for liver imaging.Conclusion131I-labeled albumin nanoparticle is an excellent liver-targeting dual modal imaging probe,which can be used for the detection of liver diseases.

Tomography,emission-computed,single-photon; Nanoparticles; Molecular probes; Optics; Acoustics; Diagnostic imaging; Models,animal; Mice

10.3969/j.issn.1005-5185.2017.10.003

福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院檢驗(yàn)科福建泉州 362000

連云宗

Department of Laboratory Medicine,Fujian Medical University Af fi liated Quanzhou No.1 Hospital,Quanzhou 362000,China

Address Correspondence to:LIAN YunzongE-mail: lianyz888@sina.com

R575；R445

2017-05-15

修回日期：2017-08-06

中國(guó)醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志

2017年 第25卷 第10期：729-733

Chinese Journal of Medical Imaging 2017 Volume 25 (10): 729-733