MUC1黏蛋白1抗體標(biāo)記超順磁納米顆粒在胰腺癌裸鼠模型中的實(shí)驗(yàn)研究

張重捷 鄒 奇 陳 杰 李春生

MUC1黏蛋白1抗體標(biāo)記超順磁納米顆粒在胰腺癌裸鼠模型中的實(shí)驗(yàn)研究

張重捷 鄒 奇 陳 杰 李春生

目的制備MUC1黏蛋白1（MUC1）靶向修飾的探針超順磁納米顆粒（SPION），探討其在胰腺癌移植模型中的MRI特點(diǎn)。材料與方法釆用化學(xué)共軛法將MUC1與SPION耦聯(lián)，構(gòu)建靶向探針，檢測(cè)其基本物理特性，包括水和直徑、表面電荷及MR信號(hào)測(cè)定；同時(shí)建立胰腺癌皮下移植瘤裸鼠模型，研究在裸鼠體內(nèi)的成像效果。取移植瘤標(biāo)本，采用免疫組化及蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定MUC1的表達(dá)。結(jié)果制備的分子探針顆粒大小約為63.5 nm，表面電荷約為10.2 mV，該探針溶液能顯著降低MR橫向弛豫時(shí)間（T2值）。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，MUC1可以選擇性地積聚在裸鼠移植瘤模型上，并能顯著降低T2信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)論制備的探針具有粒徑小、超順磁性等優(yōu)點(diǎn)，并能實(shí)現(xiàn)與胰腺癌組織特異性結(jié)合，通過(guò)體內(nèi)成像，為疾病的診斷提供早期可靠的活體影像學(xué)資料。

腺腫瘤；磁共振成像；黏蛋白類；分子探針；納米球；鐵化合物；造影劑；疾病模型，動(dòng)物；小鼠，裸

分子影像學(xué)是借助于靶向性的分子探針對(duì)相關(guān)組織與器官進(jìn)行定性或定量分析，并將結(jié)果可視化成像的一種全新的成像方法[1-2]。超順磁納米顆粒（superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPION）作為新型的MRI造影劑，具有超順磁性、良好的生物相容性、較強(qiáng)的可塑性等優(yōu)點(diǎn)，適合用于分子探針的制備[3]。利用其攜帶的配體將瘤組織大量異常表達(dá)的受體作為靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記是分子影像學(xué)的基礎(chǔ)。MUC1黏蛋白是一種跨膜糖蛋白，能在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，在胰腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率高于83%，表現(xiàn)為表達(dá)量增加和結(jié)構(gòu)改變，其畸形糖基化或糖基化不全暴露出新的蛋白或糖抗原分布于癌細(xì)胞表面，能被免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而成為腫瘤特異性抗原[4]。本研究擬構(gòu)建以MUC1為分子靶點(diǎn)，以單克隆抗體MUC1修飾的SPION作為分子探針，特異性標(biāo)記陽(yáng)性表達(dá)MUC1受體的人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，探討該分子探針在體內(nèi)的成像情況，以期為胰腺癌的早期診斷提供影像學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 BXPC-3胰腺癌細(xì)胞株（購(gòu)自上海生命科學(xué)院），抗人MUC1單克隆抗體（Abcam公司），SPION（由上海交通大學(xué)-納米生物醫(yī)學(xué)研究中心提供），0.25%胰蛋白酶、高糖DEME培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）、透析袋（Sigma公司）。主要儀器：CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Thermo公司），倒置顯微鏡（德國(guó)徠卡公司），1.5T MR掃描儀（德國(guó)Siemens公司），Zetasizer Nano ZS型激光納米粒度儀（英國(guó)Malvern公司），MRI分析儀（紐邁公司）；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系，20只BALB/c裸小鼠（SPF級(jí)，購(gòu)自上海斯萊克公司），體重約20 g，雌雄各半。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MUC1-SPION分子探針的構(gòu)建 對(duì)MUC1與SPION溶液進(jìn)行化學(xué)共軛拼接，將50 μl MUCl抗體加入0.5 ml濃度為1 mg/ml的SPION溶液中，充分混勻15 min，再加入2 mg碳二亞胺，室溫反應(yīng)30 min，轉(zhuǎn)至透析袋中，4℃條件下于PBS液中透析24 h，收集備用。MUC1-SPION合成后，利用激光納米粒度儀測(cè)量SPION復(fù)合物及MUC1-SPION的粒徑及Zeta電位。

1.2.2 MR信號(hào)測(cè)定用PBS液稀釋MUC1-SPION溶液及單純SPION溶液至鐵粒子濃度分別為1.5625、3.125、6.25、12.5、50 μg/ml，以單純PBS液作為對(duì)照，充分搖勻后分別放入MRI分析儀中測(cè)定橫向弛豫時(shí)間（T2），并根據(jù)公式（1）、（2）計(jì)算橫向弛豫率（R2）及△R2。以鐵濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)、△R2為縱坐標(biāo)做線性回歸，驗(yàn)證拼接后的MUC1-SPION是否具有磁學(xué)特性。

1.2.3 胰腺癌皮下移植瘤裸鼠模型的建立 在無(wú)特殊病原體（SPF）條件下飼養(yǎng)裸鼠，并建立胰腺癌動(dòng)物模型。將生長(zhǎng)情況良好的BXPC-3胰腺癌細(xì)胞離心后制成單細(xì)胞懸液，在計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)。將細(xì)胞接種于裸鼠雙側(cè)腋窩部皮下，每側(cè)接種細(xì)胞2×107個(gè)，自接種之日起每天觀察腫瘤結(jié)節(jié)生長(zhǎng)情況，待大部分腫瘤大小生長(zhǎng)至（0.5～1.0）cm×（0.5～1.0）cm時(shí)，開始進(jìn)行體內(nèi)成像。

1.2.4 分子探針的體內(nèi)成像 取已建立胰腺癌模型的裸鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分為MUC1-SPION組（靶向組）和SPION組（對(duì)照組）。經(jīng)尾靜脈分別給予不同濃度的造影劑，低濃度組0.05 mmol/kg，高濃度組0.1 mmol/kg。4 h后行MRI掃描，裸鼠用1%異戊巴比妥鈉行腹腔麻醉后，仰臥位固定于有機(jī)玻璃板上，掃描序列為T2WI，掃描參數(shù)：TR 1000 ms，TE 24.4～135.5 ms，視野 15 cm×15 cm，層厚3 mm，矩陣256×256。使用MR儀后處理軟件對(duì)以上掃描所得圖像進(jìn)行分析，劃定腫瘤感興趣區(qū)（ROI），每次劃定的ROI為信號(hào)較均勻區(qū)域，且ROI大小范圍基本相仿，測(cè)量每幅圖像的腫瘤信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算其平均值作為該組裸鼠的T2值，并分別與給藥前的T2值作比較。

1.2.5 MUC1表達(dá)的檢測(cè) 行MRI掃描后處死小鼠，取皮下移植瘤標(biāo)本行免疫組化及蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）測(cè)定MUC1的表達(dá)。

1.2.5.1 免疫組化 移植瘤組織以4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片后，行免疫組化染色，采用SP兩步法：切片脫蠟至水；高壓熱修復(fù)后，自然冷卻；置于3% H2O2溶液中10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；用PBS液清洗2 min，共3次，滴加兔抗人MUC1單克隆抗體，4℃冰箱中過(guò)夜；用PBS液清洗2 min，共3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫下孵育20 min；用PBS液清洗2 min，共3次，DAB顯色；用蒸餾水沖洗，蘇木精對(duì)比染色細(xì)胞核，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察拍照。

1.2.5.2 Western blot試驗(yàn) 于無(wú)菌條件下取出裸鼠皮下移植瘤，提取組織總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取30 μg等量蛋白上樣，10% SDS-PAGE膠用以分離蛋白，20 V恒壓、130 mA轉(zhuǎn)膜30 min。用封閉液封閉蛋白轉(zhuǎn)移膜30 min。加入一抗MUC1抗體（1∶500稀釋），室溫孵育過(guò)夜。第2天洗滌未結(jié)合一抗，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5000稀釋），室溫孵育2 h。在暗室內(nèi)行放射自顯影，分析條帶灰度值。待測(cè)蛋白表達(dá)量與內(nèi)參照β-actin表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比，表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。用Image-Pro Plus 7.0軟件進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用成組資料t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分子探針的物理特性 采用激光納米粒度儀檢測(cè)溶液粒度分布均勻，MUC1-SPION溶液達(dá)爾文粒徑為63.5 nm，SPION溶液達(dá)爾文粒徑為33.1 nm，Zeta電位分別為10.2 mV、7.2 mV，見圖1。

2.2 分子探針的磁學(xué)特性 隨著溶液鐵離子濃度增大，MUC1-SPION組與SPION組均呈下降趨勢(shì)，符合T2磁共振造影劑的基本特征?！鱎2值與鐵離子濃度呈近線性關(guān)系，線性擬合度較好，兩組分別符合回歸方程：Y=0.2735X+0.5001，R2=0.9832；Y=0.3764X+1.3760，R2=0.9965。見圖2。

圖1 造影劑的水合直徑及所帶電荷。A、B分別為SPION溶液和MUC1-SPION溶液

圖2 MUC1-SPION組與SPION組△R2值與鐵離子濃度的關(guān)系

圖3 分子探針的體內(nèi)成像。給藥前兩組裸鼠皮下腫瘤均呈高信號(hào)，境界清楚；注入MUC1-SPION后，腫瘤組織信號(hào)肉眼觀察明顯降低，且隨造影劑濃度的增加愈發(fā)明顯，而單純SPION組肉眼觀察腫瘤組織信號(hào)無(wú)明顯改變

2.3 荷瘤小鼠的MRI T2WI見裸鼠皮下腫瘤呈稍高信號(hào)，信號(hào)較均勻，境界清楚；注入MUC1-SPION后，肉眼觀察腫瘤組織信號(hào)明顯降低，且隨造影劑濃度增大越明顯；SPION組肉眼觀察腫瘤組織信號(hào)無(wú)明顯改變，見圖3。MUC1-SPION組及SPION組的T2信號(hào)平均強(qiáng)度見表1。

2.4 MUC1表達(dá)的檢測(cè) 免疫組化與Western blot試驗(yàn)檢測(cè)移植瘤與正常胰腺組織MUC1的表達(dá)，結(jié)果顯示移植瘤組織中MUC1表達(dá)程度較高，而在正常胰腺組織中表達(dá)程度較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖 4。

表1 MUC1-SPION組及SPION組的T2信號(hào)平均強(qiáng)度（±s）

表1 MUC1-SPION組及SPION組的T2信號(hào)平均強(qiáng)度（±s）

注：與給藥前比較，*P＜0.05，#P＜0.01

分組 給藥前 給藥后低濃度組 高濃度組MUC1-SPION 組 990±46 537±63# 218±49#SPION 組 1017±51 962±43* 928±96

圖4 A、C分別為免疫組化及Western blot試驗(yàn)結(jié)果；B、D分別表示在免疫組化及Western blot試驗(yàn)中，胰腺組織及胰腺腫瘤組織MUC1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）

3 討論

MUC1在胰腺癌中呈過(guò)量表達(dá)，尤其是在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌中高表達(dá)，能較好地反映胰腺癌的臨床病理特征，表明MUC1在胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用，因此其表達(dá)與TNM分期、患者生存期明顯相關(guān)[5-6]。SPION為MR T2加權(quán)成像對(duì)比劑，可以通過(guò)靈活的表面修飾，與特異性受體、抗體及轉(zhuǎn)染劑等結(jié)合，構(gòu)建成具有靶向性的生物探針，因此成為新一代的MR造影劑[7]。目前，腫瘤活體分子影像基本上依賴于識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的特異性膜蛋白，通過(guò)對(duì)磁性納米顆粒的表面修飾，具備特異性識(shí)別靶點(diǎn)的功能[8]。這種探針可通過(guò)高通透效應(yīng)和高滯留效應(yīng)進(jìn)入腫瘤組織，再通過(guò)其靶向分子與腫瘤細(xì)胞或腫瘤新生血管表面受體的特異性結(jié)合在腫瘤區(qū)域富集，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)腫瘤的MR造影效果[9]。

由于SPION的粒徑越大，進(jìn)入血液循環(huán)后，越容易受網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬而被清除，為避免這一問(wèn)題，本課題組選用粒徑相對(duì)較小的納米顆粒[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)化學(xué)共軛法實(shí)現(xiàn)MUC1與SPION的拼接，制備的分子探針粒徑較小，表面電荷量較低，因此不易被吞噬細(xì)胞吞噬，具有較長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間，到達(dá)腫瘤部位后，可通過(guò)高滯留效應(yīng)滲入腫瘤組織，從而增強(qiáng)腫瘤組織的T2造影效果[11]。在小鼠體內(nèi)成像研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)尾靜脈給藥4 h后，MUC1-SPION組中腫瘤組織T2信號(hào)降低程度即可顯著高于SPION組，且在MUC1-SPION組中，探針溶液的濃度越高，T2序列降低效果越明顯，但在SPION組中卻無(wú)明顯變化，可能是由于在SPION組中，單純的納米粒子在體內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程中，必須克服包括血管壁、細(xì)胞膜、血-腦屏障等各種生理屏障，并在腫瘤組織中積累到一定的濃度才能達(dá)到腫瘤組織強(qiáng)化的效果[12]。而本實(shí)驗(yàn)中，因網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)納米粒子的吞噬尚未達(dá)到飽和而無(wú)法有足夠多的粒子富集于腫瘤組織。但在MUC1-SPION組中，靶向探針耦聯(lián)的MUC1單克隆抗體特異性地識(shí)別細(xì)胞表面的膜蛋白，然后通過(guò)細(xì)胞的胞吞作用將納米載體吞入細(xì)胞內(nèi)，腫瘤組織在MRI的T2WI上則表現(xiàn)為明顯低信號(hào)。

近年來(lái)，部分學(xué)者也嘗試采用分子量較小的單鏈抗體、蛋白及多肽等生物分子或葉酸等腫瘤特異性的小分子構(gòu)建腫瘤MR分子影像探針[13-15]。與單克隆抗體相比，單鏈抗體具有分子量小、通透性強(qiáng)、免疫原性低及不易與具有Fc受體的非靶細(xì)胞結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)。Xie等[15]構(gòu)建以整合素αVβ3作為靶點(diǎn)的活體分子影像探針精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸RGD多肽-Fe3O4納米顆粒用于乳腺癌、惡性黑色素瘤及鱗狀上皮細(xì)胞癌等的體內(nèi)診斷，Vigor等[16]采用癌胚抗原（CEA）相關(guān)單鏈抗體ScFvCEA當(dāng)成分子靶點(diǎn)，以SPION為載體構(gòu)建了MR分子影像探針ScFvCEA-SPION，該實(shí)驗(yàn)證明其能特異性結(jié)合CEA過(guò)量表達(dá)的人體腫瘤細(xì)胞。以SPION為基礎(chǔ)的納米材料在胰腺癌的成像診斷應(yīng)用中具有良好的前景，但若將其用于臨床仍有不少困難，各種參數(shù)的變化均會(huì)影響其成像效果，包括顆粒大小，表面修飾、結(jié)合受體的親和力和顆粒表面配體結(jié)合方式等。目前大多數(shù)研究均集中于體內(nèi)成像的分子機(jī)制，胰腺癌表面蛋白的表達(dá)及合成開發(fā)合適的多肽與SPION相結(jié)合。然而，配體的安全性和有效性是臨床和藥物載體設(shè)計(jì)時(shí)需考慮的首要問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)的局限性為：①本實(shí)驗(yàn)以裸鼠皮下移植瘤為模型，與原位胰腺腫瘤的成像效果可能存在差異，需進(jìn)一步建立原位移植模型，以更好地彌補(bǔ)皮下移植瘤模型與人體內(nèi)研究之間的差距；②本實(shí)驗(yàn)未能反映MUC1-SPION在體內(nèi)的代謝情況，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其在體內(nèi)分布情況的變化。

總之，MUC1-SPION靶向分子探針具有粒徑小、超順磁性的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)胰腺癌組織有較好的靶向作用，可為胰腺癌的診斷提供早期可靠的活體影像學(xué)資料。

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（本文編輯 張春輝）

MUC1 Mucin 1 Antibody Marking Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles in Nude Mice Model of Pancreatic Cancer: An Experimental Study

ZHANG ZhongjieZOU QiCHEN JieLI Chunsheng

PurposeTo prepare superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION)probe targeted and modified by MUC1 murin (MUC1) in order to explore its MRI characteristics in pancreatic cancer transplantation model.Materials and MethodsChemical conjugate method was adopted for coupled response of MUC1 and SPION to construct targeted probe and tested its basic physical properties,including water and diameter,surface charge and MR signal measuring.Meanwhile,nude mice model of pancreatic cancer transplant subcutaneous sarcoma was set up to study imaging effect inside the nude mice.Transplant sarcoma specimen was taken and immunohistochemical and Western blot were adopted to measure MUC1 expression.ResultsPartial size of the prepared particle probe was approximately 63.5 nm and surface charge was about 10.2 mV.The probe solution could obviously decrease MR transverse relaxation time (T2 value).In vitro experiment,MUC1 could selectively gather on nude mice transplant sarcoma model could greatly lower T2 signal intensity.ConclusionPrepared probe has small partial size,superparamagnetic and other advantages.It can realize combination with pancreatic cancer tissue speci fi city and provide reliable in vivo iconology in early stage for disease diagnosis through vitro imaging.

Pancreatic neoplasms; Magnetic resonance imaging; Mucins; Molecular probes; Nanospheres; Iron compounds; Contrast media; Disease models,animal; Mice,nude

10.3969/j.issn.1005-5185.2017.10.001

復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院肝膽外科 上海201399

李春生

Department of Hepatobiliary Surgery,Pudong Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai 201399,China

Address Correspondence to:LI Chunsheng

E-mail: chunshenglish@126.com

上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金醫(yī)療衛(wèi)生項(xiàng)目（PKJ2015-Y33）

R-33；R445.2

2017-04-24

修回日期：2017-07-07

中國(guó)醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志

2017年 第25卷 第10期：721-725

Chinese Journal of Medical Imaging 2017 Volume 25 (10): 721-725