離子液體為流動(dòng)相添加劑高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蓮子心中蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿①

王紅敏 唐 巖 孫愛(ài)玲 柳仁民,

(1.聊城大學(xué) 藥學(xué)院，山東 聊城 252059; 2.聊城大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 聊城 252059)

離子液體為流動(dòng)相添加劑高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蓮子心中蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿①

王紅敏1唐 巖2孫愛(ài)玲2柳仁民1,2

(1.聊城大學(xué) 藥學(xué)院，山東 聊城 252059; 2.聊城大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 聊城 252059)

采用離子液體作為反相高效液相色譜流動(dòng)相添加劑，建立了同時(shí)測(cè)定蓮子心中蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿含量的方法.色譜柱為SPHERIGEL ODS C18 (250 mm× 4.6 mm I.D., 5 μm)，流動(dòng)相為添加30 mmol/L [HMIM][BF4]、pH為3.0的甲醇/水(70/30, v/v)，流動(dòng)相流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm.在濃度范圍為2-200 μg/mL范圍內(nèi)，蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8，0.999 7和0.999 8；對(duì)蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的LOD分別為0.14 mg/L、0.17 mg/L和0.19 mg/L，LOQ分別為0.29 mg/L、0.35 mg/L和0.41 mg/L.

離子液體,流動(dòng)相添加劑,蓮子心,生物堿,反相高效液相色譜法

0 引言

蓮子心為睡蓮科植物蓮的成熟種子中干燥的幼葉及胚根，現(xiàn)代藥學(xué)研究和臨床試驗(yàn)表明蓮子心具有抗心律失常、抗癌、抗血小板聚集、降壓和抗脂質(zhì)過(guò)氧化及清除自由基等多種藥理作用[1-5].蓮子心中的主要活性成分為生物堿類物質(zhì)，如蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿等，其結(jié)構(gòu)如圖1所示.因此，建立同時(shí)測(cè)定蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿含量的方法對(duì)于蓮子心的藥學(xué)研究和質(zhì)量控制具有十分重要的意義.

在通常的反相高效液相色潽(RP-HPLC)流動(dòng)相的pH范圍內(nèi)(3.0

圖1 蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的結(jié)構(gòu)

離子液體是一種由體積相對(duì)較大的有機(jī)陽(yáng)離子和有機(jī)或無(wú)極陰離子構(gòu)成，室下溫為液體的鹽，具有較高的離子遷移率、非常低的蒸氣壓、不易燃性以及很好的化學(xué)穩(wěn)定性[9]等獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，它可以作為環(huán)境友好溶劑而受到人們的廣泛關(guān)注，并被應(yīng)用于氣相色譜固定相[10,11]、作為液相色譜固定相[12,13]以及作為液相色譜流動(dòng)相添加劑[14-19].然而，目前還沒(méi)有關(guān)于應(yīng)用離子液體作為反相高效液相色譜流動(dòng)相添加劑來(lái)分離和測(cè)定蓮子心中的蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的報(bào)道.

本文對(duì)離子液體烷基鏈長(zhǎng)度和陰離子種類、離子液體濃度及流動(dòng)相的pH值對(duì)RP-HPLC分離測(cè)定蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的影響進(jìn)行了研究，建立了應(yīng)用1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體作為流動(dòng)相添加劑，同時(shí)測(cè)定蓮子心中蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿含量的RP-HPLC方法，對(duì)方法的精密度、準(zhǔn)確度等進(jìn)行考查，并且實(shí)際應(yīng)用于蓮子心中蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿含量的測(cè)定，結(jié)果滿意.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀(Agilent Technologies, Germany)，包括：G1311A型四元泵、G1322A型在線脫氣裝置、G1315B型二極管陣列檢測(cè)器、7725i型進(jìn)樣器及安捷倫高效液相色譜工作站.FZ102微型植物粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；SK3300LH超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；UB-7型pH計(jì)(北京Denver Instruments儀器有限公司).

1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

圖2 不同流動(dòng)相添加劑分離色譜圖注：甲醇/水(70/30，v/v) 含 (A) 30 mmol/L的三乙胺；(B) 30 mol/L [EMIM][BF4]；(C) 30 mmol/L [BMIM][BF4]；(D) 30 mmol/L [HMIM][BF4]；(E)30 mmol/L [HMIM][Cl].1：蓮心堿；2：異蓮心堿；3：甲基蓮心堿.

蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所(北京，中國(guó)).本實(shí)驗(yàn)所使用的離子液體：1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([EMIM][BF4])、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM][BF4])、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([HMIM][BF4])和1-己基-3-甲基咪唑氯鹽([HMIM][Cl])，購(gòu)于蘭州化學(xué)與物理研究所(純度>99%).HPLC分析所用甲醇為色譜純(禹城化工廠)，所用水為純凈水.實(shí)驗(yàn)中所用的其他試劑均為分析純，所用水為二次蒸餾水.

蓮子心藥材：樣品1產(chǎn)地中國(guó)南京，樣品2產(chǎn)地中國(guó)江西，樣品3產(chǎn)地中國(guó)浙江，均購(gòu)于安徽毫州藥材市場(chǎng)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定為正品藥材.

1.3 HPLC色譜條件

色譜柱為SPHERIGEL ODS C18(250 mm × 4.6 mm ID. 5 μm)，流動(dòng)相為含有30 mmol/L [HMIM][BF4]、pH為3.0的甲醇/水 (70:30,v/v)溶液，流動(dòng)相流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為室溫.

1.4 樣品溶液的制備

將干燥的蓮子心用植物粉碎機(jī)粉碎至約為40目，稱取0.20 g的蓮子心粉末，加入40 mL的甲醇溶液超聲30 min，將超聲后的溶液以4 000 rpm的轉(zhuǎn)速離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶中，用甲醇溶液定容，搖勻，最后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾.

2 結(jié)果與討論

2.1 離子液體的選擇

在利用RP-HPLC法分析堿性化合物時(shí)，通常會(huì)使用三乙胺作為流動(dòng)相添加劑.因此，本實(shí)驗(yàn)首先研究了三乙胺對(duì)分離蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的影響，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與離子液體進(jìn)行比較，有關(guān)色譜圖見(jiàn)圖2.由圖2可見(jiàn)，當(dāng)使用離子液體作為流動(dòng)相添加劑時(shí)，分析物的保留時(shí)間、分離效率、分離度以及色譜峰的對(duì)稱性都得到了顯著的改善.

表1列出了不同烷基鏈長(zhǎng)度的離子液體作為流動(dòng)相添加劑時(shí)，蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的保留因子、分離度及理論塔板數(shù).由表1可見(jiàn)，對(duì)于具有相同陰離子的離子液體，隨著烷基鏈長(zhǎng)度的增加，蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的保留降低了，并且色譜峰形也得到了顯著的改善.由此可以清楚地表明，使用[HMIM][BF4]作為流動(dòng)相添加劑可以提供好的分離效果以及短的保留時(shí)間.

表1同時(shí)列出了[HMIM][BF4]和[HMIM][Cl]作為流動(dòng)相的添加劑時(shí)，蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的保留因子、分離度及理論塔板數(shù).從表1可以看出，當(dāng)[HMIM][BF4]作為流動(dòng)相的添加劑時(shí)，可以獲得好的分離結(jié)果以及高的分離效率.故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用[HMIM][BF4]作為流動(dòng)相添加劑.

表1 離子液體作為流動(dòng)相添加劑時(shí)蓮子心生物堿保留因子、分離度及理論塔板數(shù)

注：1. 蓮心堿，2. 異蓮心堿， 3. 甲基蓮心堿

2.2 [HMIM][BF4]濃度的影響

圖3 [HMIM][BF4]的濃度對(duì)保留因子的影響注：1：蓮心堿；2：異蓮心堿；3：甲基蓮心堿

研究了不同濃度的[HMIM][BF4]作為流動(dòng)相添加劑對(duì)分離蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3可見(jiàn)，當(dāng)向流動(dòng)相中添加6 mmol/L的[HMIM][BF4]后，蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的保留因子即急劇降低，隨著流動(dòng)相中[HMIM][BF4]濃度的進(jìn)一步增加，蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿保留因子的降低趨勢(shì)逐漸減緩，當(dāng)[HMIM][BF4]的濃度達(dá)到30 mmol/L后，保留因子只有微小的變化.因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇[HMIM][BF4]的濃度為30 mmol/L.

2.3 流動(dòng)相pH的影響

流動(dòng)相的pH對(duì)蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的分離也有重要的影響.眾所周知，在通常的RP-HPLC流動(dòng)相pH范圍內(nèi)(3

圖4 流動(dòng)相的pH值對(duì)保留因子的影響注：1：蓮心堿；2：異蓮心堿；3：甲基蓮心堿

2.4 離子液體作為添加劑的可能分離機(jī)制

當(dāng)離子液體作為流動(dòng)相添加劑時(shí)，蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的保留時(shí)間、分離效率、分離度以及色譜峰的對(duì)稱性都得到了顯著的改善.這種分離機(jī)制可能歸結(jié)為離子液體在RP-HPLC中的雙重性質(zhì).當(dāng)離子液體作為流動(dòng)相添加劑時(shí)，它會(huì)在色譜體系中同時(shí)發(fā)生一系列的變化.一方面，可能會(huì)導(dǎo)致咪唑陽(yáng)離子與分析物的極性官能團(tuán)通過(guò)靜電作用相互競(jìng)爭(zhēng)固定相表面殘余的硅羥基.另一方面，離子液體的陰離子可以通過(guò)疏水作用與固定相相結(jié)合，從而吸附在固定相表面.因此，離子液體作為添加劑的分離機(jī)制是一種復(fù)合機(jī)制，主要包括：離子對(duì)形成、離子交換、靜電作用以及疏水作用[20].

同時(shí)，當(dāng)離子液體作為流動(dòng)相添加劑時(shí)，離子液體可以有效地覆蓋固定相表面殘余的硅羥基，并且有效地改善了蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的色譜峰峰形.因此，離子液體可以作為一種合適的環(huán)境友好替代劑來(lái)有效地降低或抑制殘余硅羥基的活性.

2.5 方法驗(yàn)證

2.5.1 線性.在最佳的RP-HPLC條件下，在濃度范圍為2-200 μg/mL之間，測(cè)定了7種不同濃度的蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液.在所測(cè)定范圍內(nèi)蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8，0.999 7和0.999 8，這說(shuō)明被測(cè)物濃度與其相應(yīng)峰面積之間具有良好的線性關(guān)系.

2.5.2 檢出限(LOD)和定量限(LOQ).在優(yōu)化的色譜條件下，通過(guò)檢測(cè)一系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以信噪比為3測(cè)定了方法的檢出限(LOD)，以信噪比為3測(cè)定了方法的定量限(LOQ).對(duì)于蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿，方法的LOD分別為0.14、0.17和0.19 mg/L，LOQ分別為0.29、0.35和0.41 mg/L.

2.5.3 精密度、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性.用日內(nèi)和日間的變化對(duì)方法的精密度進(jìn)行了評(píng)價(jià).重復(fù)分析已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液6次，蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.39%、1.15%和1.27%.在連續(xù)3天的日間實(shí)驗(yàn)中，蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.53%、1.38%和1.46%.相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%.

向已知蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿含量的樣品中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定了方法的回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.由表2 可見(jiàn)，本法的回收率在98%-102%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%.

表2 本法的回收率(n=3)

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用本法對(duì)產(chǎn)地分別為南京、江西和浙江的三種蓮子心樣品中蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3.圖5為產(chǎn)地為南京的蓮子心樣品色譜圖.從圖5可以看出，當(dāng)離子液體作為流動(dòng)相添加劑時(shí)，蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的色譜峰形良好，并且觀察不到明顯的干擾峰，新建立的RP-HPLC方法可以成功地應(yīng)用于蓮子心樣品生物堿的定量分析中.

表3 不同產(chǎn)地蓮子心樣品中蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的含量

圖5 南京產(chǎn)蓮子心樣品的色譜圖注：1：蓮心堿；2：異蓮心堿；3：甲基蓮心堿.

3 結(jié)論

本文研究了離子液體咪唑環(huán)上烷基鏈的長(zhǎng)度和陰離子的種類、離子液體的濃度和流動(dòng)相的pH值對(duì)蓮子心中蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿分離的影響.通過(guò)使用[HMIM][BF4]作為流動(dòng)相添加劑，建立了一種同時(shí)測(cè)定蓮子心中蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿含量的RP-HPLC法.更為重要的是，[HMIM][BF4]不僅可以作為液相色譜流動(dòng)相添加劑來(lái)改善蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的分離，對(duì)于其他樣品的RP-HPLC分析，也很有發(fā)展前景.

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SimultaneousDeterminationofLiensinine,IsoliensinineandNeferineinNelumbinisPlumulabyReversedPhaseHighPerformanceLiquidChromatographyUsingIonicLiquidsastheMobilePhaseAdditives

WANG Hong-min1TANG Yan2SUN Ai-ling2LIU Ren-min1,2

(1.School of Pharmacy, Liaocheng University, Liaocheng 252059，China； 2.School of Chemistry and Chemical Engineering, Liaocheng University, Liaocheng 252059，China)

A reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method for simultaneous determination of liensinine, isoliensinine and neferine inNelumbinisPlumulawas established by using 1-hexyl-3-methylimidazolium tertafluoroborate ([HMIM][BF4]) as the mobile phase additives. A SPHERIGEL ODS C18 column (250 mm×4.6 mm I.D., 5 μm was used for separation. Methanol/water (70/30, v/v) containing 30 mmol/L [HMIM][BF4] was used as the mobile phase. The pH of the mobile phase was 3.0 and the flow rate of the mobile phase was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 280 nm. In the range of 2-200 μg/mL, the linear correlation coefficients were all better than 0.999 7. For liensinine, isoliensinine and neferine, the LOD of this method was 0.14, 0.17 and 0.19 mg/L, respectively, and the LOQ of this method was 0.29, 0.35 and 0.41 mg/L, respectively.

ionic liquids, mobile phase additives,NelumbinisPlumula, alkaloids, reversed phase high performance liquid chromatography

2017-05-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(21675071)資助

柳仁民,E-mail:liurenmin@lcu.edu.cn.

O657.7+2

A

1672-6634(2017)03-0035-06