毛鉤藤堿對(duì)缺氧乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響*

翟娜娜， 黃器偉， 陳奎生

(1黃河科技學(xué)院， 河南 鄭州 450099； 2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 河南 鄭州 450052)

毛鉤藤堿對(duì)缺氧乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響*

翟娜娜1， 黃器偉1， 陳奎生2△

(1黃河科技學(xué)院， 河南 鄭州 450099；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 河南 鄭州 450052)

目的觀察毛鉤藤堿對(duì)缺氧誘導(dǎo)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，并探討其分子機(jī)制。方法選取MCF-7細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用CCK-8法檢測(cè)毛鉤藤堿的細(xì)胞毒性作用；采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)量細(xì)胞遷移率；采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲力；采用Western blot法檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)、Snail、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的蛋白表達(dá)水平；采用RT-PCR法檢測(cè)HIF-1α的mRNA水平。結(jié)果自32 μmol/L開始，隨著毛鉤藤堿濃度的升高，MCF-7細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)，IC50為62.82 μmol/L；在缺氧條件下，MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，HIF-α、Snail和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，HIF-1α的mRNA水平也顯著升高(P<0.05)；除缺氧MCF-7細(xì)胞中HIF-α的mRNA水平未受影響外，上述效應(yīng)均被毛鉤藤堿(16 μmol/L)明顯抑制(P<0.05)。結(jié)論毛鉤藤堿可在體外抑制缺氧誘導(dǎo)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲，這可能與毛鉤藤堿下調(diào)HIF-1α、Snail和MMP-9蛋白表達(dá)水平，上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

毛鉤藤堿； 乳腺癌； 缺氧； 細(xì)胞遷移； 細(xì)胞侵襲

在惡性實(shí)體腫瘤的演進(jìn)過程中，由于惡性腫瘤細(xì)胞增殖速度快以及腫瘤組織自身供血相對(duì)不足，惡性實(shí)體腫瘤的組織內(nèi)部往往普遍處于缺氧狀態(tài)[1]。缺氧微環(huán)境可通過調(diào)控多個(gè)基因表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間的黏附下降、腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)，缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)正是其中最重要的調(diào)節(jié)因子之一[2]。乳腺癌是女性最常見的惡性實(shí)體腫瘤之一。在歐盟和美國(guó)，2017年女性乳腺癌預(yù)計(jì)死亡人數(shù)在所有女性癌癥中位居前兩位，將分別達(dá)到92 600例和40 610例[3-4]。因此抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、改善乳腺癌患者的預(yù)后仍是目前亟待解決的問題。從天然植物中篩選出具有抗腫瘤作用的活性成分一直是癌癥研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。Lou等[5]在對(duì)56種植物化學(xué)成分篩選后發(fā)現(xiàn)，毛鉤藤堿(hirsutine)可在體內(nèi)抑制小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞向肺轉(zhuǎn)移，并在體外抑制小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞遷移[5]。然而關(guān)于毛鉤藤堿對(duì)缺氧誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響目前尚無相關(guān)報(bào)道。因此本研究以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對(duì)象，在缺氧條件下觀察毛鉤藤堿對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲的影響并探究及其分子生物學(xué)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；毛鉤藤堿(純度≥98%)購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；Matrigel和Transwell小室購(gòu)自Corning；CCK-8試劑盒、結(jié)晶紫染色液、Trizol試劑、RIPA裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人HIF-1α、Snail、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)、β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自Cell Signaling Technology；RT-PCR試劑盒和PCR引物購(gòu)自大連寶生物公司。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞置于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，以0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

2.2毛鉤藤堿工作液的配制 將毛鉤藤堿溶于DMSO配制成100 mmol/L的儲(chǔ)備液，分裝后于-20 ℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用RPMI-1640培養(yǎng)液分別稀釋成4、8、16、32和64 μmol/L的工作液，DMSO終濃度為0.1%。對(duì)照組使用含有0.1% DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)液。

2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成密度為1×108/L的細(xì)胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去培養(yǎng)液，各孔分別加入200 μL含有不同濃度毛鉤藤堿的工作液(4、8、16、32和64 μmol/L)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔和對(duì)照孔，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入20 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。采用SPSS 16.0軟件Probit回歸模型計(jì)算毛鉤藤堿對(duì)MCF-7細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至單層狀態(tài)時(shí)，更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，用無菌的100 μL移液器槍頭在底部劃線，吸去培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，將細(xì)胞分成3組：(1)常氧對(duì)照(control)組：MCF-7細(xì)胞在含0.1% DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于O2體積分?jǐn)?shù)為21% 的培養(yǎng)箱中常氧培養(yǎng)；(2)缺氧(hypoxia)組：MCF-7細(xì)胞在含0.1% DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于O2體積分?jǐn)?shù)為1% 的培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)；(3)缺氧+毛鉤藤堿(hypoxia+hirsutine)組：MCF-7細(xì)胞在含16 μmol/L毛鉤藤堿的工作液中，置于O2體積分?jǐn)?shù)為1% 的培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)。各實(shí)驗(yàn)組分別在培養(yǎng)0 h和24 h用倒置顯微鏡進(jìn)行拍照，用ImageJ 1.45s軟件測(cè)量劃痕面積，計(jì)算平均遷移距離(S)，每孔測(cè)量5處，取平均值，每組設(shè)3復(fù)孔。遷移率(%)=S實(shí)驗(yàn)組/S對(duì)照組×100%。

2.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel與RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶6稀釋，取50 μL均勻鋪到Transwell小室上室內(nèi)，將小室放入24孔板中，37 ℃恒溫孵育3 h使其成凝膠狀。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。細(xì)胞分組及處理方法同2.4，取密度為1×109/L的各組細(xì)胞懸液100 μL加入上室內(nèi)，在24孔板中加入600 μL含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，PBS洗滌2次，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS 洗滌2次。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細(xì)胞，隨機(jī)挑選5個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)，取其平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。侵襲率(%)=實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

2.6Western blot法檢測(cè)蛋白水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。細(xì)胞分組及處理方法同2.4，用RIPA裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取25 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液(5% BSA/TBST)封閉1 h，加入抗HIF-1α、Snail、E-cadhe-rin、MMP-9和β-actin的 I 抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入 II 抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影、拍照，使用ImageJ 1.45s軟件進(jìn)行灰度分析。

2.7RT-PCR檢測(cè)HIF-1α的mRNA水平 參照Trizol說明書抽提各組細(xì)胞總RNA，取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件為42 ℃ 60 min、70 ℃ 15 min，所得反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液置于-20 ℃凍存?zhèn)溆?。? μL上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為: 94 ℃ 1 min； 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)。引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，經(jīng)PubMed BLAST驗(yàn)證。HIF-1α(214 bp)的上游引物為5’-ATGTAATGCTCCCCTCACCC-3’，下游引物為5’-CCATCGGAAGGACTAGGTGT-3’； GAPDH(276 bp)的上游引物為5’-CCTGACCTGCCGTCTAGAAA-3’，下游引物為5’-TACTCCTTGGAGGCCATGTG-3’。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳成像，使用ImageJ 1.45s軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1毛鉤藤堿對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0 μmol/L)相比，4、8和16 μmol/L毛鉤藤堿未對(duì)MCF-7細(xì)胞存活率產(chǎn)生明顯影響；自32 μmol/L開始，隨著毛鉤藤堿濃度的升高，MCF-7細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)，當(dāng)毛鉤藤堿濃度達(dá)到64 μmol/L時(shí)MCF-7細(xì)胞存活率降至47.64%±4.54%，毛鉤藤堿作用MCF-7細(xì)胞24 h的IC50為62.82 μmol/L，見圖1。

Figure 1. The effect of hirsutine on the cell viability in MCF-7 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05vs32 μmol/L group.

圖1毛鉤藤堿對(duì)MCF-7細(xì)胞存活率的影響

2毛鉤藤堿抑制缺氧誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞的遷移能力

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與常氧對(duì)照組相比，缺氧組MCF-7細(xì)胞的遷移率顯著升高(P<0.05)；然而在16 μmol/L毛鉤藤堿作用下，缺氧誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞遷移率僅為121.33%±11.31%，顯著低于缺氧組 (P<0.05)。這表明毛鉤藤堿抑制了缺氧誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞遷移，見圖2。

3毛鉤藤堿抑制缺氧誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞的侵襲能力

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在缺氧條件下，MCF-7細(xì)胞的侵襲能力較常氧時(shí)顯著增強(qiáng)(P<0.05)；但與缺氧組相比，缺氧+毛鉤藤堿組MCF-7細(xì)胞侵襲率明顯降低(P<0.05)。這表明毛鉤藤堿可抑制缺氧誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞侵襲，見圖3。

4毛鉤藤堿對(duì)HIF-1α、Snail、E-cadherin和MMP-9蛋白水平的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與常氧對(duì)照組相比，缺氧組MCF-7細(xì)胞中HIF-1α、Snail和MMP-9的蛋白水平顯著升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與缺氧組相比，缺氧+毛鉤藤堿組MCF-7細(xì)胞中HIF-1α、Snail和MMP-9的蛋白水平明顯下降(P<0.05)，而E-cadherin的蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見圖4。

5毛鉤藤堿對(duì)HIF-1αmRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，缺氧可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞HIF-1α mRNA的表達(dá)升高(P<0.05)，但在16 μmol/L毛鉤藤堿作用下，缺氧MCF-7細(xì)胞中的HIF-1α的mRNA水平未發(fā)生明顯變化(P>0.05)，見圖5。

Figure 2. Hirsutine inhibited hypoxia-induced migration in MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vshypoxia group.

圖2毛鉤藤堿抑制缺氧誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞遷移

Figure 3. Hirsutine inhibited hypoxia-induced invasion in MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vshypoxia group.

圖3毛鉤藤堿抑制缺氧誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞侵襲

Figure 4. The effect of hirsutine on the protein levels of HIF-1α, Snail, E-cadherin and MMP-9 in MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vshypoxia group.

圖4毛鉤藤堿對(duì)HIF-1α、Snail、E-cadherin和MMP-9蛋白水平的影響

Figure 5. The effect of hirsutine on the mRNA level of HIF-1α in MCF-7 cells. A and D: control group; B and E: hypoxia group; C and F: hypoxia+hirsutine group; marker: 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp and 100 bp. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5毛鉤藤堿對(duì)MCF-7細(xì)胞中HIF-1αmRNA水平的影響

討 論

茜草科植物鉤藤為常用中藥，吲哚類生物堿是鉤藤植物中的主要化學(xué)成分，包括鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、毛鉤藤堿和去氫毛鉤藤堿等，這些吲哚類生物堿具有廣泛的藥理學(xué)作用[6]。最新的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，這些吲哚類生物堿均能有效逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿、阿霉素和紫杉醇的耐藥性[7]。毛鉤藤堿還可在體內(nèi)抑制小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞向肺轉(zhuǎn)移，并在體外抑制小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞遷移[5]。

在本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)，毛鉤藤堿可在體外抑制缺氧誘導(dǎo)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲。為避免細(xì)胞毒性作用的干擾，本研究首先采用CCK-8法檢測(cè)了毛鉤藤堿對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞活力的影響。依據(jù)CCK-8法檢測(cè)結(jié)果，在不顯著影響MCF-7細(xì)胞活力的情況下，我們選取的毛鉤藤堿的給藥濃度為16 μmol/L。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明，缺氧可顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲，然而在16 μmol/L毛鉤藤堿作用下，該效應(yīng)被顯著抑制。為探究其分子機(jī)制，我們采用Western blot法分析了毛鉤藤堿(16 μmol/L)對(duì)HIF-1α、Snail、E-cadherin和MMP-9蛋白水平的影響。結(jié)果表明毛鉤藤堿可抑制缺氧對(duì)MCF-7細(xì)胞中HIF-1α、Snail、MMP-9和E-cadherin蛋白表達(dá)的效應(yīng)。為進(jìn)一步探究毛鉤藤堿對(duì)HIF-1α蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，我們采用RT-PCR法檢測(cè)了毛鉤藤堿對(duì)HIF-1α mRNA水平的影響。結(jié)果顯示毛鉤藤堿未對(duì)缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α的mRNA表達(dá)產(chǎn)生顯著影響。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步揭示了毛鉤藤堿抑制缺氧誘導(dǎo)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲的分子機(jī)制，但毛鉤藤堿直接作用的靶蛋白以及對(duì)相關(guān)蛋白的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

缺氧在乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，其中一個(gè)重要機(jī)制就是誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[8]。EMT是指細(xì)胞通過去分化由多邊形上皮樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮伍g葉性細(xì)胞形態(tài)，并獲得更具運(yùn)動(dòng)能力表型的過程。EMT的一個(gè)主要特征為E-cadherin蛋白表達(dá)減少，E-cadherin是一種鈣依賴性細(xì)胞黏附分子，在維持正常上皮細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞極性中發(fā)揮著重要作用[9]。多項(xiàng)研究已證實(shí)，下調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲[10-11]。發(fā)生EMT的乳腺癌細(xì)胞可通過分泌MMP-2和MMP-9降解細(xì)胞外基質(zhì)，向周邊侵襲[12]。由此可見，毛鉤藤堿上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)可能是毛鉤藤堿抑制缺氧MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲的重要環(huán)節(jié)之一。

為探究毛鉤藤堿對(duì)E-cadherin蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，我們觀察了毛鉤藤堿對(duì)缺氧條件下MCF-7細(xì)胞中Snail蛋白表達(dá)水平的影響。Snail為轉(zhuǎn)錄因子Snail家族成員，該家族包括Snail、Slug和Smuc，其羧基末端高度保守，含有4～6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。其中Snail蛋白的羧基末端含有4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可特異性地與E-cadherin啟動(dòng)子中的E-box作用元件相結(jié)合而抑制E-cadherin蛋白的表達(dá)[13]。Lu等[14]研究證實(shí)，在乳腺癌病理組織中，Snail蛋白表達(dá)水平與E-cadherin蛋白表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)；當(dāng)沉默Snail基因后，MCF-7細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高。因此毛鉤藤堿可能是通過抑制Snail蛋白表達(dá)而上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)的。

HIF-1是缺氧誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵分子[8]。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β 2個(gè)亞基構(gòu)成的異源二聚體，HIF-1α是HIF-1的功能亞基。在常氧條件下，HIF-1α極易被脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase，PHD)羥化，羥化HIF-1α可迅速經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解。但在缺氧條件下，由于PHD失活，HIF-1α降解受阻，半衰期大幅延長(zhǎng)[15]。HIF-1α可直接上調(diào)Snail基因表達(dá)[16]。由此可推測(cè)，HIF-1α/Snail通路在缺氧誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲的過程中發(fā)揮著重要作用。在本研究中，毛鉤藤堿可下調(diào)缺氧MCF-7細(xì)胞中HIF-1α蛋白水平，但未對(duì)其mRNA水平產(chǎn)生影響，這表明毛鉤藤堿可能是通過影響mRNA翻譯和/或HIF-1α蛋白降解過程調(diào)控HIF-1α蛋白水平的。

綜上所述，毛鉤藤堿可在體外抑制缺氧誘導(dǎo)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲，這可能與毛鉤藤堿下調(diào)HIF-1α、Snail和MMP-9蛋白表達(dá)水平，上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)水平有關(guān)，具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of hirsutine on hypoxia-induced migration and invasion abilities in human breast cancer MCF-7 cells

ZHAI Na-na1, HUANG Qi-wei1, CHEN Kui-sheng2

(1HuangheCollegeofScienceandTechnology,Zhengzhou450099,China;2FirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China.E-mail: 812032363@qq.com)

AIM: To investigate the effect of hirsutine on hypoxia-induced migration and invasion abilities of human breast cancer MCF-7 cells and its possible mechanism.METHODSCCK-8 assay was employed to detect the cytotoxic effect of hirsutine on the MCF-7 cells. Cell migration was observed by wound healing assay, and cell invasion ability was measured by Transwell invasion assay. Western blot was used to analyze the protein levels of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α), Snail, E-cadherin and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). The mRNA levels of HIF-1α was detected by RT-PCR.RESULTSHirsutine remarkably reduced the cell viability from 32 μmol/L (P<0.05), and the IC50value was 62.82 μmol/L. In hypoxia state, MCF-7 cells showed more powerful capabilities of migration and invasion (P<0.05), higher protein levels of HIF-1α, Snail and MMP-9 (P<0.05), lower protein level of E-cadherin (P<0.05), and higher mRNA level of HIF-1α (P<0.05). These hypoxia-induced effects were all inhibited by hirsutine at 16 μmol/L (P<0.05), apart from the mRNA level of HIF-1α.CONCLUSIONHirsutine inhibits hypoxia-induced migration and invasion in human breast cancer MCF-7 cells most likely via down-regulation of the protein levels of HIF-1α, Snail and MMP-9, and up-regulation of the protein level of E-cadherin.

Hirsutine; Breast cancer; Hypoxia; Cell migration; Cell invasion

1000- 4718(2017)11- 2009- 06

2017- 06- 02

2017- 07- 17

河南省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃(No. 122300410434)

△通訊作者 Tel： 0371-168886100； E-mail： 812032363@qq.com

R737.9； R285.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.014