植物基因替換編輯技術(shù)研究進展

王虹麟，張從省，劉昌林，謝傳曉

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植物基因替換編輯技術(shù)研究進展

王虹麟1,2,3，張從省1,2,3，劉昌林1,3，謝傳曉1,3

1中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081 2安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，安徽合肥 230036 3中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所作物分子育種國家工程實驗室，北京 100081

王虹麟, 張從省, 劉昌林, 等. 植物基因替換編輯技術(shù)研究進展. 生物工程學報, 2017, 33(10): 1723–1732.Wang HL, Zhang CS, Liu CL, et al. Advances in targeted replacement genome editing in plants. Chin J Biotech, 2017, 33(10): 1723–1732.

基因替換編輯是通過核酸酶介導的對目標基因進行定點敲入或替換的編輯技術(shù)，可以實現(xiàn)目的基因的定向修飾。本文從基因替換編輯技術(shù)的原理、實現(xiàn)方式與影響因素、應(yīng)用及其前景等進行了總結(jié)與討論，以期為通過定點基因替換或敲入技術(shù)開展高等植物基因功能鑒定與遺傳改良研究提供參考。

基因替換，定點敲入，基因功能鑒定，遺傳改良

基因 (組) 編輯是指通過人工構(gòu)建工程化的核酸酶，對基因組目標區(qū)間序列特異性識別與切割，定點切割產(chǎn)生雙鏈斷裂(Double-stranded break，DSB)，并通過細胞內(nèi)源的同源重組或非同源末端連接DNA損傷修復機制，對受體物種基因或基因組引入目標基因敲除、缺失、插入、替換、修飾或染色體易位與重排等定向突變的技術(shù)[1]。在生命科學領(lǐng)域，基因組編輯技術(shù)最重要的生物學意義是可以實現(xiàn)定點定向突變，即按照人類的設(shè)想精確設(shè)計想要的基因型。因此，該技術(shù)在生物基礎(chǔ)科學研究、醫(yī)學、工業(yè)微生物、作物遺傳改良等廣泛領(lǐng)域具備重大的理論與實踐應(yīng)用研究價值[2]?；蚓庉嫾夹g(shù)體系根據(jù)其定點核酸酶技術(shù)原理，可分為歸巢核酸酶技術(shù)(Meganucleases)、鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)、類轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)，以及成簇規(guī)律間隔短回文重復序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR) CRISPR/Cas系統(tǒng)基因編輯技術(shù)[3-6]。近年來，CRISPR/Cas系統(tǒng)基因編輯技術(shù)發(fā)展突飛猛進，由于其設(shè)計簡便、系統(tǒng)簡單易行、定點突變效率高等優(yōu)點，正在成為基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重要的基礎(chǔ)工具。然而，基因替換尤其是大片段DNA替換編輯仍存在突變效率低與精確性差等技術(shù)限制。本文主要綜述了植物基因替換編輯研究進展。

1 基因替換編輯技術(shù)及其意義

通過基因編輯產(chǎn)生的突變根據(jù)突變基因的功能又可分為無義突變和有義突變。無義突變主要有堿基插入或缺失移碼而導致的基因敲除、基因刪除和倒位突變體[7-8]。有義突變主要有基因的替換、基因修飾以及定點插入。最近報道實現(xiàn)的基因組的單堿基編輯可實現(xiàn)單堿基替換，該技術(shù)實質(zhì)上通過基因定點單堿基修飾[9-11]。

本文所討論的基因替換是指可實現(xiàn)目標區(qū)域較長DNA區(qū)段精確定向突變的技術(shù)，可引入任意人為目標突變，使DNA精確地整合到基因組中所需的位置，并穩(wěn)定表達。例如，Susan M Byrne等通過CRISPR/Cas9技術(shù)對人體多功能干細胞進行替換研究，成功用老鼠的同源序列部分替換了人的相應(yīng)序列[12]。與其他突變相比，任何DNA序列的突變都可以通過較大片段的基因(DNA) 替換來實現(xiàn)。因此，基因替換編輯技術(shù)具備真正意義上的定向突變能力，在農(nóng)作物遺傳改良與基因功能鑒定基礎(chǔ)研究中具有重大的理論價值與實際應(yīng)用意義。

2 基因替換編輯主要技術(shù)構(gòu)成與步驟

基因替換編輯技術(shù)包括核酸酶剪切模塊和模板修復模塊兩個部分，核酸酶剪切單一位點或多個位點可由ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas9完成，修復模板分為DNA雙鏈或寡核苷酸鏈。基于同源重組(Homologous directed recombination，HDR) 修復途徑的DNA雙鏈修復模板同源臂長度從數(shù)百bp至幾kb不等，寡核苷酸鏈修復模板同源臂約60 nt，核酸酶識別位點位于同源臂兩端；基于非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ) 途徑的修復模板無同源臂，核酸酶識別位點位于模板兩端。

基因替換編輯技術(shù)的步驟主要包括剪切和修復兩個過程，受體基因組目標位點被核酸酶識別剪切，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，修復模板基于同源重組修復(HDR)或非同源末端連接(NHEJ)途徑進行替換，HDR相對于NHEJ修復途徑更為精確，但由于細胞周期中HDR活性存在時間短，效率低于NHEJ[13]。

3 基因替換編輯技術(shù)分類

在基因替換編輯中，依據(jù)目標基因替換的類型，可分為基因替換、啟動子等調(diào)控因子替換以及基因敲入。依賴內(nèi)源DNA損傷修復途徑可分為通過細胞內(nèi)源的HDR或NHEJ DNA損傷修復機制，可通過這兩種機制引入基因替換或插入突變。

3.1 依賴HDR修復途徑的基因替換編輯

對所有真核生物來說，利用基因替換方法準確地將新的等位基因引入基因組具有一定的挑戰(zhàn)性。雖然使用CRISPR/Cas9的基因敲除在許多植物中得到應(yīng)用，但是迄今為止僅有少數(shù)基于CRISPR/Cas9的基因敲入或替換的報道。為了使用CRISPR/Cas9實現(xiàn)基因敲入，必須使用DNA模板作為修復供體序列，通過HDR修復雙鏈斷裂，替換到指定的區(qū)域。HDR是一種精確的修復方式，它可以保證細胞基因組的完整性，在DNA修復中起著舉足輕重的作用。HDR途徑活性一般發(fā)生在細胞有絲分裂的S期到G2期[13]，但修復精確度高。其誘導產(chǎn)生的突變大部分為同源供體DNA介導的大片段的插入或核苷酸修正。

CRISPR/Cas9介導的定點誘變和敲除已被用于水稻和擬南芥原生質(zhì)體[14-15]。最近，該技術(shù)也成功地用于在水稻中替換了兩個乙酰乳酸合酶基因，從而賦予水稻對除草劑雙草醚的抗性[16]。雖然已經(jīng)有一些成功的案例，但在植物中普遍進行基因敲入和替代的策略仍然具有挑戰(zhàn)性。

與HDR相結(jié)合的CRISPR/Cas9剪切有可能克服這一挑戰(zhàn)。在哺乳動物細胞中，研究人員已經(jīng)通過用Cas9/sgRNA復合物靶向基因的同時用化合物Scr7抑制DNA連接酶Ⅵ和/或抑制NHEJ所需的基因 (即編碼和的基因)，通過同源重組的基因替換效率顯著增強[17-19]。這種實驗設(shè)計顯著抑制了NHEJ DNA修復活性，并刺激Cas9-/sgRNA誘導的DNA斷裂位點的同源重組效率提高。實際上，使用ZFN介導的基因靶向的報告顯示，在涉及NHEJ修復的和或中，突變擬南芥中的基因編輯和同源重組增加[20]。最近，在玉米和大豆中證明了同源重組的有效基因替換。使用雙鏈或單鏈DNA分子作為替代鏈，通過啟動轉(zhuǎn)入未成熟玉米胚胎的Cas9和sgRNA基因?qū)崿F(xiàn)了5個不同靶基因的等位基因編輯[21]。

通過CRISPR/Cas9剪切，同源重組率可以通過增加供體DNA的拷貝數(shù)，提高大約一個數(shù)量級。在近期的一項研究中，核酸酶構(gòu)建體可以對改良大豆黃矮病毒基因組進行編碼，該病毒能在植物細胞內(nèi)進行復制。模板同樣在該復制子上編碼，其側(cè)翼是靶基因切割位點側(cè)翼DNA的同源序列。將該復制子序列通過農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)入番茄細胞。此外，預計會導致滾環(huán)式復制，并產(chǎn)生數(shù)百到數(shù)千個復制。使用該復制子觀察到的基因靶向效率約為10%，比所觀察到的非復制型T-DNA載體序列增加一個數(shù)量級[22]。該研究結(jié)合了同一實驗室之前的研究結(jié)果，證明修復序列的高拷貝數(shù)與位點特異性DNA切割有效地通過同源修復過程促進基因靶向[23]。

3.2 依賴NHEJ修復途徑的基因替換編輯

NHEJ修復是細胞的主要修復方式。當細胞內(nèi)形成雙鏈斷裂時，DSBs處被一些末端結(jié)合因子蛋白結(jié)合，防止DSBs被核酸酶降解。隨后，DSBs由于這些蛋白的相互作用使裂口處的DNA雙鏈相互靠近，DNA鏈就通過連接酶的作用連接從而修復斷裂的DNA雙鏈[24]。NHEJ途徑活性高且持續(xù)整個細胞分裂周期并傾向差錯修復(Error prone repair)。其產(chǎn)生的突變大部分為少量核苷酸的插入或刪除。由于NHEJ修復中DSBs的修復沒有模板，所以發(fā)生的概率要高于HDR途徑所介導的基因替換。但由于其不依賴同源序列重組，對修復重連的DNA沒有選擇性，會導致引入錯誤的修復，精確性較差。

除了通過HDR的遺傳整合，也可以用NHEJ完成靶向基因的插入或替換。在這種情況下，不包含側(cè)翼同源性臂的線性供體分子在被NHEJ修復期間在DSB被捕獲。這種方法經(jīng)常用于哺乳動物細胞中[25]，但在植物中的使用鮮有報道[26-27]。隨著DSBs捕獲外源DNA效率的進一步提高[28-29]，該方法成為將靶DNA整合到植物基因組中的潛在有效方法。高彩霞研究員與李家洋研究員利用CRISPR/Cas9技術(shù)基于NHEJ修復方式在內(nèi)含子區(qū)域非同源末端連接修復機制，通過使用靶向相鄰內(nèi)含子的一對sgRNA和包含一對相同sgRNA位點的供體DNA模板，已經(jīng)實現(xiàn)了頻率為2.0%的內(nèi)源性水稻基因5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶 (EPSPS) 的基因替換，同時通過基因編輯技術(shù)實現(xiàn)了目標基因2.2%的基因插入，并成功培育出具有抗除草劑水稻[30]。這些新開發(fā)的方法通常可用于在水稻和其他植物中插入或替換靶基因片段。

4 影響基因替換編輯效率的因素

基因替換編輯技術(shù)中，靶向定點DNA的核酸酶、轉(zhuǎn)化策略、DNA修復供體模板以及內(nèi)源性DNA損傷修復途徑等是影響基因替換效率的重要因素。

DNA修復模板可以通過基因槍轟擊的方法提供。Svitashev等對授粉后8–10 d的未成熟玉米胚胎用基因槍進行轟擊，與對照相比，Cas9-gRNA處理的胚胎產(chǎn)生高頻率的突變，大多數(shù)測試的gRNA產(chǎn)生突變頻率大于1.3%[31]。通過基因槍轟擊，提供的修復模板拷貝數(shù)明顯增多，但同時也會存在一些缺點，如片段可能不完整、可能引起染色體重排、或受體基因組小片段外源DNA污染等。

DNA修復模板還可以通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化提供。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的優(yōu)點是供體來自穩(wěn)定的系統(tǒng)，其中目標生物體中的DNA模板可以更完整，并且替代物的殘余序列可以在后代的回交期間通過同源重組進行精確追蹤和排除，從而產(chǎn)生“無轉(zhuǎn)基因”個體[32]。本小組通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化提供的DNA修復模板獲得0.8%的頻率，這對于大多數(shù)植物研究來說是令人滿意的[33]。使用CRISPR/Cas9和DNA供體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化策略也在擬南芥中應(yīng)用于產(chǎn)生靶向突變[34]。

修復模板的提供對基因替換編輯效率有很大影響?？梢酝ㄟ^優(yōu)化供體DNA模板(數(shù)量、長度、類型、導入方式等) 提高HDR介導的定點插入或替換效率。Baltes等在煙草中利用雙生病毒(Geminivirus) 載體表達序列特異核酸酶(Sequence-specific nucleases，SSNs) 和DNA模板，通過提高SSNs和DNA模板數(shù)量，提高了同源重組效率[23]。?ermák等在番茄中利用雙生病毒復制子提高模板DNA含量，與傳統(tǒng)的DNA傳送方法相比，編輯位點的整合效率提高了10倍[22]。

也有研究人員通過優(yōu)化DNA 模板同源臂的長度來提高同源重組效率。雙鏈DNA模板的同源臂長度一般為1–4 kb，即在DSB兩側(cè)等分成大約0.5–2 kb[35]。Byrne等使用小鼠對應(yīng)物替代內(nèi)源性人類基因的系統(tǒng)模型進行了同源重組靶向載體設(shè)計參數(shù)的綜合研究，高達11%的人誘導多能干細胞都實現(xiàn)了2.7 kb純合基因替換效率[12]。研究發(fā)現(xiàn)同源長度在不與切割部位相鄰的臂上特別重要，而基因替換最佳同源臂長度約為2 kb。切割位點內(nèi)的同源序列對靶向效率是不利的。而Shin等利用TALEN技術(shù)建立了GFP報告系統(tǒng)，用于檢測活斑馬魚胚胎中HDR事件的發(fā)生頻率。通過共同注射具有不同大小同源臂的TALE核酸酶和GFP報告子靶向構(gòu)建載體，發(fā)現(xiàn)較長的同源臂和線性化的供體DNA載體更有利于同源重組，同時還發(fā)現(xiàn)，在較短的一側(cè)同源臂的內(nèi)部切斷供體DNA載體獲得的同源重組效率最高，定點插入的傳代效率能達到10%以上[36]。

基因定點插入通常以雙鏈環(huán)狀載體或雙鏈線性DNA作為供體DNA，此外，還可以使用單鏈寡核苷酸DNA (ssDNA)，其設(shè)計與合成比構(gòu)建雙鏈DNA載體更簡便[37]。研究發(fā)現(xiàn), 單鏈或雙鏈DNA模板對同源重組均有效[38]。Li等利用靶位點兩端各1 kb的同源臂，將外源潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因片段同源重組整合到大豆基因組中，得到具有潮霉素抗性的大豆植株[39]。另外，較短基因序列的精確修飾可以采用單鏈寡核苷酸DNA作為模板，同源臂的長度甚至可以僅為40 nt，即兩側(cè)各有20 nt[37]。Puchta實驗室建立了一種高效的基因靶向(Gene targeting，GT) 系統(tǒng)來提高同源重組效率，首先在植物基因組上穩(wěn)定整合SSNs及供體DNA模板，SSNs表達后同時切開基因組靶位點及供體DNA兩側(cè)的識別位點，釋放線性供體DNA，發(fā)生HDR修復[40]。傳統(tǒng)基因打靶實驗中DNA模板由T-DNA載體提供，而植物體內(nèi)基因打靶在所有細胞及植物發(fā)育周期中都能發(fā)生，因此HDR發(fā)生頻率可能更高。

此外，NHEJ和HDR兩個途徑也會對基因替換編輯效率產(chǎn)生影響。與NHEJ途徑相比，依賴HDR途徑修復的基因編輯效率較低。例如，本小組實現(xiàn)的HDR基因替換編輯的頻率為0.8%[33]。但在精確度方面，HDR要優(yōu)于NHEJ途徑。盡管NHEJ相對于HDR容易出錯，基因片段可能被反向插入或在DSBs連接處產(chǎn)生核苷酸的插入或缺失，但NHEJ的效率要遠高于HDR，因此在精確度要求不高的情況下，可以選擇NHEJ途徑開發(fā)目標基因替換的工具。

5 植物基因替換編輯應(yīng)用

5.1 基于基因替換的遺傳改良與育種應(yīng)用

在玉米中，Svitashev等利用單鏈寡核苷酸或雙鏈DNA載體作為修復模板編輯ALS2基因，通過HDR途徑將靶基因插入到目標基因座，得到氯磺隆抗性植株[31]。Townsend等利用ZFN技術(shù)，通過HDR途徑分別定點替換煙草乙酰乳酸合成酶基因(SuRA、SuRB) 的3個關(guān)鍵核苷酸位點，得到抗除草劑煙草，基因打靶效率在0.2%–4%之間[41]。基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，Sun等通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的同源重組，對水稻ALS基因的兩個氨基酸位點的密碼子進行定點替換，通過后代分離，獲得不含有轉(zhuǎn)基因元件的抗除草劑水稻[42]。

5.2 基于基因替換報告系統(tǒng)在基因功能鑒定上的應(yīng)用

基因表達的組織與細胞定位是基因功能鑒定分析的重要內(nèi)容，傳統(tǒng)方法是把報告基因構(gòu)建到推定的調(diào)控元件序列下游通過體外試驗鑒定該基因的表達部位。由于是體外試驗，不能完全模擬原目標基因上下游基因組序列及組織、器官與個體等不同發(fā)育水平的背景，結(jié)果并不可靠。基于DNA序列替換的定點敲入技術(shù)可把報告基因敲入目標位置，從而可以實現(xiàn)通過報告基因在活體細胞、不同發(fā)育階段跟蹤該基因的表達特征，獲得準確與完整的基因功能鑒定。Voytas實驗室通過在煙草原生質(zhì)體中整合功能缺失的報告基因來檢測同源重組率，該基因上含有ZFN (Zif268) 識別序列，再將ZFN和供體DNA轉(zhuǎn)入含有基因的煙草原生質(zhì)體中，成功完成替換[43]。Zhang等在煙草原生質(zhì)體中轉(zhuǎn)化TALEN和供體DNA，高達14%的煙草原生質(zhì)體細胞ALS基因位點整合了YFP報告基因，能夠通過流式細胞術(shù)定量TALEN活性[44]。Wang等在小麥原生質(zhì)體細胞中通過NHEJ途徑介導不含啟動子的GFP報告基因插入TaMLO基因位點，并通過流式細胞儀檢測到6.5%細胞有GFP表達，測序結(jié)果證明GFP按照正確讀碼框整合在MLO位點[38]。Fauser等在擬南芥中利用DGU.US和IU.GUS兩個GUS報告基因系統(tǒng)，證明Cas9核酸酶和Cas9切口酶都能有效誘導HDR，且Cas9切口酶效率更高[45]。

5.3 基于定點敲入替換技術(shù)的定點轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用

將外源DNA引入植物基因組中預定的位置可為植物基因功能的研究提供有力的工具，并促進作物新品種的發(fā)展[46-49]。基于定點敲入替換技術(shù)的定點轉(zhuǎn)基因技術(shù)首先在動物中得到應(yīng)用。Kamanaka等設(shè)計了GFP敲入靶向載體，通過同源重組將GFP整合到小鼠體內(nèi)細胞產(chǎn)生的白細胞介素-10 (IL-10) 基因座并對其進行分析[50]。在植物中，Shukla等通過ZFN介導的基因打靶在玉米中實現(xiàn)了基因的定點插入，使內(nèi)源基因插入失活，基因替換效率達到10%以上，并可以穩(wěn)定遺傳[51]。Cai等將靶向煙草幾丁質(zhì)基因的ZFNs轉(zhuǎn)化煙草，并共轉(zhuǎn)兩端含有與靶基因同源的除草劑抗性標記，成功獲得約10%定點插入抗性標記的轉(zhuǎn)化細胞[52]。當前的作物商業(yè)轉(zhuǎn)化事件均需要從大量隨機受體基因組整合的遺傳轉(zhuǎn)化事件中篩選優(yōu)良農(nóng)藝表現(xiàn)型的事件進入應(yīng)用，費時費力，定點轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以在受體基因組染色質(zhì)活性區(qū)域定點轉(zhuǎn)入目標基因，可以有效提高研發(fā)與應(yīng)用效率，因此也具備重要的應(yīng)用價值。

6 討論與展望

基因替換編輯通過核酸酶編輯技術(shù)以供體基因取代受體基因，可以實現(xiàn)DNA的定點替換與插入，可以對任何需要的目的DNA序列進行修飾。在農(nóng)作物遺傳改良與基因功能鑒定基礎(chǔ)研究中具有重大的理論價值與實際應(yīng)用意義。

基因替換的要素包括目標DNA核酸酶、替換修復模板以及內(nèi)源DNA損傷修復。修復模板基于HDR或NHEJ途徑進行替換，HDR相對于NHEJ修復途徑更為精確，而在修復周期上會短于NHEJ。由于向植物細胞導入同源重組供體片段和DNA同源重組的效率較低，對目標基因進行堿基替換、片段替換和定點插入等精準編輯的效率低成為該技術(shù)的重大限制因素。因此，對于基因替換編輯來說，如何提高效率的同時保證編輯的精確性成為當前迫切需要解決的關(guān)鍵科學技術(shù)問題。

現(xiàn)有的實驗證據(jù)表明，可以通過優(yōu)化供體DNA模板，如增加供體DNA的拷貝數(shù)、優(yōu)化DNA模板同源臂的長度、改變供體模板的類型及導入方式等，使同源重組效率提高[35-40]。另一方面，也可以通過改變修復途徑來提高基因替換編輯效率。比如通過CRISPR/Cas9復合物靶向基因的同時，利用化合物抑制DNA連接酶和/或抑制NHEJ所需的基因，來抑制NHEJ DNA修復過程，并刺激CRISPR/Cas9誘導的DNA斷裂位點的同源重組效率提高[17-19]。與HDR修復一般發(fā)生在有絲分裂S期到G2期相比，NHEJ修復在全細胞周期都具有較高活性，也可通過NHEJ完成靶向基因的插入或替換。高彩霞課題組運用NHEJ在水稻中實現(xiàn)了頻率為2.0%的內(nèi)源性水稻基因替換，并成功培育出具有抗藥性的水稻[30]。此外，基因替換編輯效率可以從合適的轉(zhuǎn)化策略及對啟動子進行優(yōu)化等方面來提高。本小組通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化提供的DNA修復模板獲得0.8%的頻率[33]。

CRISPR/Cpf1技術(shù)的出現(xiàn)[53]為基于NHEJ修復方式的基因替換提供了新的方向。CRISPR/Cpf1技術(shù)裂解DNA后會產(chǎn)生4–5 nt的粘性末端，根據(jù)受體產(chǎn)生的缺口，設(shè)計產(chǎn)生與其相互補的供體靶位點，在內(nèi)源DNA連接酶的作用下拼接，相對于平末端會更加精確。這一特點已被應(yīng)用于微生物載體的構(gòu)建，并取得了顯著的效果[54]。相比于CRISPR/Cas9技術(shù)，CRISPR/Cpf1技術(shù)因其粘性末端的特點會有更大的潛力。

植物中基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的同源重組效率較低，很難以此實現(xiàn)高效、穩(wěn)定的單堿基突變。因此，植物育種和基因功能研究迫切需要新技術(shù)來提高基因組單堿基定點突變的效率，以實現(xiàn)基因功能與農(nóng)藝性狀的定向改良。目前較多的是在動物中的研究，Komor等報道了一種新的基因組編輯方法，可以以可編程的方式直接且不可逆地將一個目標DNA堿基替換為另一種堿基，而不需要dsDNA主鏈切割或供體模板。他們設(shè)計了CRISPR/Cas9的融合體，在人和小鼠細胞中，在大約5個核苷酸的窗口內(nèi)轉(zhuǎn)化胞質(zhì)堿，介導胞苷到尿苷的直接轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生C→T (或G→A) 的替代[9]。Kim等設(shè)計了含有突變的胞苷脫氨酶結(jié)構(gòu)域的基因編輯，將編輯窗口的寬度從約5個核苷酸縮小到1–2個核苷酸，從而能夠區(qū)分相鄰的C核苷酸，而且可以使疾病相關(guān)的靶標Cs的數(shù)目加倍，并優(yōu)先于鄰近的非目標Cs進行校正[55]。高彩霞研究組借鑒哺乳動物單堿基編輯方法，利用Cas9變體(nCas9-D10A) 融合大鼠胞嘧啶脫氨酶(rAPOBEC1) 和尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI)，成功地在小麥、水稻和玉米基因組中實現(xiàn)高效、精確的單堿基定點突變，并獲得了突變效率最高可達43.48%的突變植株[11]。單堿基編輯系統(tǒng)成功建立和應(yīng)用，為高效和大規(guī)模創(chuàng)制單堿基突變體提供了一個可靠方案，為作物遺傳改良和新品種培育提供了重要的技術(shù)支撐。

從長遠來看，基因組編輯技術(shù)能使人們對植物基因組特定基因 (位點) 進行精準、高效的改造，這將對植物功能基因組研究和作物遺傳改良產(chǎn)生巨大的推進作用，并對未來農(nóng)業(yè)日益增長的需求提供可靠的保障。

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(本文責編 郝麗芳)

Advances in targeted replacement genome editing in plants

Honglin Wang1,2,3, Congsheng Zhang1,2,3, Changlin Liu1,3, and Chuanxiao Xie1,3

1 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China 2 School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, Anhui, China 3 National Engineering Laboratory of Crop Molecular Breeding Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Targeted replacement genome editing refers to DNA modification and engineering technology that could induce and achieve mutations of targeted gene replacement or knockin at a target gene or DNA region. In this review, the principles, implementation methods, factors that influence efficiency and accuracy, and applications of gene replacement editing were summarized and discussed. It provides the reference for gene functional characterization and genetic improvements through gene replacement strategies in higher plant especially crops.

targeted replacement, targeted knock-in, gene function identification, crops genetic improvement

May 10, 2017;

August 1, 2017

Chuanxiao Xie. Tel: +86-10-82107464; Fax: +86-10-82106748; E-mail: xiechuanxiao@caas.cn

Supported by:Special Fundamental Grants of Chinese Academy of Agricultural Sciences (No. Y2017XM03).

中國農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務(wù)費專項院級統(tǒng)籌項目 (No. Y2017XM03) 資助。

謝傳曉 博士，中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所研究員。主要從事高等植物基因編輯技術(shù)、玉米遺傳育種新技術(shù)及其應(yīng)用、玉米重要性狀基因克隆與功能鑒定研究。先后主持國家自然科學基金委國際合作重大研究項目和面上項目、科技部“863”項目等轉(zhuǎn)基因重大專項等，在、、等以通訊作者發(fā)表論文20余篇，授權(quán)國家發(fā)明專利4項，已獲審定我國玉米主產(chǎn)區(qū)普通玉米品種1個，待審定品種2個。