硝夫太爾制霉素和甲硝唑栓對(duì)妊娠合并細(xì)菌性陰道病患者絨毛超微結(jié)構(gòu)及Caspase-3表達(dá)的影響

張瓊，胡靜，羅春葉

（云南省第二人民醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650021）

硝夫太爾制霉素和甲硝唑栓對(duì)妊娠合并細(xì)菌性陰道病患者絨毛超微結(jié)構(gòu)及Caspase-3表達(dá)的影響

張瓊，胡靜，羅春葉

（云南省第二人民醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650021）

目的 探討硝夫太爾制霉素和甲硝唑栓對(duì)妊娠合并細(xì)菌性陰道病患者的絨毛超微結(jié)構(gòu)及不良妊娠結(jié)局的影響。方法 將2013年4月-2015年7月在云南省第二人民醫(yī)院就診的妊娠合并細(xì)菌性陰道病患者分為A組（未用藥）37例、B組（硝夫太爾制霉素）62例、C組（甲硝唑）60例，并選同期正常妊娠者為D組（正常組）60例，比較B、C兩組的治療效果，比較4組不良妊娠結(jié)局發(fā)生以及絨毛超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡蛋白天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）表達(dá)上的差異。結(jié)果 B、C兩組的治療總有效率及不良反應(yīng)發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但疾病復(fù)發(fā)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），B組（1.61%）低于C組（18.33%）；不良妊娠結(jié)局發(fā)生率比較，B、C、D 3組均低于A組；絨毛超微結(jié)構(gòu)及Caspase-3表達(dá)比較，A、B、C 3組兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 硝夫太爾制霉素在治療妊娠合并細(xì)菌性陰道病患者時(shí)，具有較高的治療有效率及低復(fù)發(fā)率，且有利于避免絨毛組織結(jié)構(gòu)進(jìn)一步損傷及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

硝夫太爾制霉素；甲硝唑；細(xì)菌性陰道??；妊娠

細(xì)菌性陰道病（bacterial vaginosis，BV）是育齡女性中較為常見(jiàn)的一種下生殖道感染性疾病，其發(fā)病率在10%～30%[1]。臨床研究資料顯示，妊娠期合并BV與如胎膜早破、早產(chǎn)、產(chǎn)褥感染等不良妊娠結(jié)局發(fā)生有相關(guān)性[2]，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。而近年來(lái)臨床研究顯示，細(xì)菌感染導(dǎo)致母胎界面微環(huán)境改變或許對(duì)不良妊娠結(jié)局負(fù)有直接責(zé)任[3]。而作為治療妊娠合并BV常用藥物，甲硝唑雖然短期效果明顯，但高復(fù)發(fā)率在一定程度上限制了其應(yīng)用。而這與微環(huán)境改變直接相關(guān)。持續(xù)細(xì)菌感染往往會(huì)加重機(jī)體炎癥反應(yīng)，并引起機(jī)體釋放大量炎癥因子，誘發(fā)絨毛等組織細(xì)胞凋亡，而絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖是維持妊娠順利進(jìn)行的必要條件[4-5]。因此，一旦發(fā)生細(xì)胞凋亡，也就意味著妊娠無(wú)法順利完成。此外，細(xì)胞凋亡蛋白天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）作為啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要蛋白，Caspase-3活性增加意味著細(xì)胞凋亡的不可逆轉(zhuǎn)變。因而，本研究通過(guò)觀察妊娠合并BV患者絨毛超微結(jié)構(gòu)、Caspase-3及不良妊娠結(jié)局的發(fā)生情況，探討硝夫太爾制霉素及甲硝唑在臨床治療效果上的差異，為更好地指導(dǎo)臨床用藥提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年4月-2015年7月來(lái)云南省第二人民醫(yī)院就診且符合納入標(biāo)準(zhǔn)的妊娠合并細(xì)菌性陰道病患者共計(jì)159例。其中將不愿接受治療的37例患者納入A組（未用藥），剩余122例患者根據(jù)不同用藥隨機(jī)納入B組（硝夫太爾制霉素）62例，C組（甲硝唑栓）60例，并選同期正常妊娠者62例納入D組（正常組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)婦科檢查、分泌物鏡檢結(jié)果確診且符合Amsel臨床有關(guān)診斷觀點(diǎn)[6]；②入院前未采取任何其他藥物治療；③孕周>14周。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他妊娠性疾?。虎诤喜⒂刑悄虿?、高血壓等慢性疾病。各組在年齡、體重、孕周、孕次、產(chǎn)次上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

以上研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批示通過(guò)，且參與研究者知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

B組給予硝夫太爾制霉素陰道軟膠囊（北京朗依制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20051563），給藥方法為患者在每晚入睡前清洗外陰，將本品1粒（含500 mg硝夫太爾+20萬(wàn)u制霉素）放入陰道后穹隆處，以7 d為1個(gè)療程；C組給予甲硝唑栓（成都第一藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H51023193），給藥方法為患者在每晚入睡前清洗外陰，將甲硝唑2粒（250 mg/粒）放入陰道后穹隆處，以7 d為1個(gè)療程。兩組均治療1個(gè)療程。B、C兩組在進(jìn)行1個(gè)療程治療后的第1、4和12周進(jìn)行復(fù)診，其中治療效果判斷依據(jù)第4周復(fù)查結(jié)果，復(fù)發(fā)情況針對(duì)第4周仍有效后進(jìn)行第12周的復(fù)查。A、D組均未給藥，且在首次就診時(shí)、就診后第4和12周進(jìn)行相同檢查。研究期間，需對(duì)4組患者進(jìn)行跟蹤隨訪，直至產(chǎn)褥期結(jié)束，并記錄各組患者出現(xiàn)胎膜早破、早產(chǎn)、產(chǎn)褥感染、新生兒感染及新生兒窒息的發(fā)生情況。

1.3 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

B、C組在治療1個(gè)療程后的第4周，A、D組在就診后第4周，分別按如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)比較。

1.3.1 標(biāo)本采集 待流產(chǎn)或早產(chǎn)孕婦胎盤(pán)分娩出后，先進(jìn)行大體標(biāo)本檢查，隨后在距離臍帶4 cm處無(wú)出血壞死的新鮮胎盤(pán)和蛻膜全層中選取面積大約1.0 cm×1.0 cm的胎盤(pán)絨毛。

1.3.2 療效判斷[5]評(píng)價(jià)指標(biāo)包括：①線索細(xì)胞<20%；②氨試驗(yàn)結(jié)果陰性；③陰道pH值<4.5。其中痊愈：患者各項(xiàng)臨床癥狀、體征均消失，陰道清潔度Ⅰ度且符合上述3項(xiàng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；顯效：患者各項(xiàng)臨床癥狀及體征均明顯減輕，陰道清潔度Ⅱ度，且至少符合上述2項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)；有效：患者臨床癥狀及體征有所減輕，陰道清潔度Ⅲ、Ⅳ度符合上述1項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)；無(wú)效：患者臨床癥狀及體征無(wú)改善或加重，不符合上述任何一項(xiàng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。復(fù)發(fā)是指治療有效以上患者3個(gè)月后復(fù)診，其臨床癥狀及體征復(fù)現(xiàn)，且至少不符合上述評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中2項(xiàng)。治療有效率=（痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)+無(wú)效例數(shù)）/本組總例數(shù)。

1.3.3 絨毛超微結(jié)構(gòu)觀察 取各組絨毛組織，經(jīng)生理鹽水沖洗后分成2份，1份剪成1 mm×1 mm×1 mm左右組織塊，浸泡入電鏡固定液中，經(jīng)脫水、浸透、包埋、聚合、切片、染色步驟后，采用透射電子顯微鏡（JEOL-1400日本電子株式會(huì)社）對(duì)絨毛組織超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

1.3.4 Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性檢測(cè) 取上述另1份絨毛組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)SP染色。其中以細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)棕黃色顆?；蚱瑺钊旧珵殛?yáng)性細(xì)胞。具體步驟如下：在400倍鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)不重疊區(qū)域，依據(jù)染色程度及細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分，其中染色程度計(jì)分為0分（無(wú)顯色）、1分（淺黃色）、2分（棕黃色）、3分（棕褐色）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例計(jì)分為0分（≤5%）、1分（6%～25%）、2分（26%～50%）、3分（51%～75%）、4分（>75%）。總分為以上兩項(xiàng)乘積。按總分分為陰性（0～3分）、弱陽(yáng)性（4～6分）、陽(yáng)性（7～9分）、強(qiáng)陽(yáng)性（>9分）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。兩組間直接比較，當(dāng)P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在4組比較的基礎(chǔ)上，采用了χ2分割法進(jìn)行兩兩比較，P<0.007為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較

各組在年齡、體重、孕周、孕次、產(chǎn)次上比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組一般臨床資料比較 （±s）

表1 各組一般臨床資料比較 （±s）

組別 年齡/歲 體重/kg 孕周/周 孕次/次 產(chǎn)次/次A 組（n=37） 25.63±3.23 49.62±2.84 18.74±4.19 2.11±0.24 0.53±0.14 B 組（n=62） 25.15±3.52 49.45±2.75 19.13±4.32 2.05±0.25 0.48±0.17 C 組（n=60）D 組（n=62）25.53±3.41 25.78±3.33 50.04±2.81 49.71±2.85 19.29±4.41 18.77±4.28 2.15±0.22 2.32±0.27 0.62±0.11 0.55±0.13 F值 0.785 0.894 0.862 0.847 1.214 P值 0.962 0.846 0.873 0.866 0.718

2.2 療效比較

B、C組治療總有效率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.607，P=0.962），但兩組疾病復(fù)發(fā)率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.612，P=0.048）。見(jiàn)表2。

表2 B、C組治療效果比較 例（%）

2.3 藥物不良反應(yīng)

本次研究中共5例患者主訴外陰有灼熱感、干澀或皮膚瘙癢，其中B組2例、C組3例，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.244，P=0.993）。5例患者均未進(jìn)行特殊治療，癥狀在停藥后自行緩解。

2.4 不良妊娠結(jié)局比較

4組不良妊娠結(jié)局發(fā)生率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.743，P=0.000），采用 χ2分割法進(jìn)行兩兩比較（α值=0.05（4（4-1）/2+1）=0.007），結(jié)果顯示A組vs D組、A組vs B組、A組vs C組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.124、4.113和6.982，P=0.000、0.005 和 0.003）。見(jiàn)表 3。

表3 各組不良妊娠結(jié)局比較 例（%）

2.5 各組絨毛超微結(jié)構(gòu)

A組電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞質(zhì)明顯空泡化，細(xì)胞器數(shù)量減少，細(xì)胞變性如細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)異常等（見(jiàn)附圖A）；B、C組細(xì)胞形態(tài)正常，但仍可見(jiàn)部分細(xì)胞表面存在微絨毛減少及增粗，且C組較B組明顯（見(jiàn)附圖B、C）；D組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞膜清晰可見(jiàn)，胞質(zhì)中有豐富細(xì)胞器，染色質(zhì)分布均勻（見(jiàn)附圖D）。

2.6 Caspase-3陽(yáng)性結(jié)果

各組Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性率比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，A組vs B組、B組vs C組、C組vs A組、A組vs D組均差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.432、3.116、7.432和 8.351，P=0.004、0.034、0.004 和 0.001）。見(jiàn)表 4。

附圖 各組絨毛超微結(jié)構(gòu)圖 （透射電鏡×400）

表4 各組Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性率

3 討論

正常生理下，以乳酸桿菌為代表的優(yōu)勢(shì)菌群可分泌乳酸等酸性物質(zhì)來(lái)維持女性陰道微環(huán)境處于弱酸性，并分泌H2O2來(lái)抑制其他致病菌的增殖。但是，當(dāng)女性處于妊娠狀態(tài)時(shí)，雌激素的激增為病原菌增殖帶來(lái)豐富的糖原，陰道微環(huán)境改變，如黏膜水腫、細(xì)胞通透性增加也給其他病原菌入侵提供了便利[7-8]。此外以加德鈉菌為主的病原微生物還可分泌唾液酸酶及黏蛋白酶來(lái)分解黏蛋白及脂質(zhì)，為細(xì)菌入侵宮頸上皮細(xì)胞及進(jìn)入羊膜腔提供條件，并對(duì)滋養(yǎng)層組織微環(huán)境結(jié)構(gòu)造成影響，從而引起細(xì)胞凋亡等病理改變[9]。而一旦細(xì)菌進(jìn)入羊膜腔，不僅能引起胎膜水腫和張力下降，還可引起細(xì)胞凋亡及其他一系列免疫反應(yīng)，并最終引發(fā)胎膜早破、早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。因此，提高妊娠期BV治療效果具有一定的臨床意義。

本研究比較硝夫太爾制霉素和甲硝唑栓的臨床治療效果，并針對(duì)高復(fù)發(fā)率問(wèn)題做進(jìn)一步分析。結(jié)果顯示，用藥的B、C組在治療效果及藥物不良反應(yīng)率上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但在復(fù)發(fā)率上，給予甲硝唑栓治療的C組復(fù)發(fā)率高于B組，且C組的復(fù)發(fā)率基本與前人研究報(bào)道相符合。以往研究[10]認(rèn)為甲硝唑短期有效率可達(dá)85%以上，但3個(gè)月后，復(fù)發(fā)率可為20%～40%。高復(fù)發(fā)率的原因之一是女性陰道微環(huán)境的改變現(xiàn)狀并未得到有效逆轉(zhuǎn)。本研究針對(duì)各組的絨毛超微結(jié)構(gòu)研究進(jìn)一步證實(shí)，D組絨毛結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞胞漿內(nèi)含有豐富細(xì)胞器，而B(niǎo)、C組雖然細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯異常，但B、C兩組絨毛組織均有微絨毛減少現(xiàn)象，其中C組可見(jiàn)部分凋亡細(xì)胞；A組不僅微絨毛減少，細(xì)胞變性，且大部分細(xì)胞胞質(zhì)空泡化。通過(guò)各組Caspase-3細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性率比較可知，B組、D組無(wú)明顯細(xì)胞凋亡，但是C組、A組細(xì)胞凋亡較為明顯。由于凋亡蛋白Caspase-3在滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡中起到關(guān)鍵作用，且一旦細(xì)胞高表達(dá)Caspase-3即意味著細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的凋亡階段，而凋亡細(xì)胞增多，不僅會(huì)加劇組織微環(huán)境進(jìn)一步損傷，也使患者治療后恢復(fù)效果較差。由此認(rèn)為，甲硝唑栓雖然短期療效明顯，但在抑制減少細(xì)胞凋亡上，并無(wú)明顯作用，而細(xì)胞凋亡是加劇陰道微環(huán)境改變的重要因素，以至于雖然短期致病菌大量被殺死，但毫無(wú)保護(hù)的陰道依然是病原菌重點(diǎn)侵襲部位[11]，而這或許是導(dǎo)致治療高復(fù)發(fā)率的重要因素之一。硝夫太爾臨床研究顯示[12]，該藥物不僅具有廣譜抗菌特性，還有加德鈉菌強(qiáng)抑制作用及對(duì)乳酸桿菌無(wú)抑制作用等優(yōu)點(diǎn)，從而保證了較高的治療效果。本研究還發(fā)現(xiàn)，硝夫太爾制霉素在抑制細(xì)胞凋亡上具有一定作用，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，對(duì)妊娠合并細(xì)菌性陰道病患者，給予硝夫太爾制霉素藥物治療，治療效果明顯，復(fù)發(fā)率低，且藥物在一定程度上可減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，有助于改善陰道微環(huán)境。但是，鑒于此研究樣本數(shù)較少，后續(xù)還需進(jìn)行大樣本、隨機(jī)、雙盲實(shí)驗(yàn)，以便獲得更為可信的結(jié)論。

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（張蕾 編輯）

Effect of Nifuratel nystatin and Metronidazole suppositories on villus ultrastructure and caspase-3 expression of pregnant women with bacterial vaginosis

Qiong Zhang,Jing Hu,Chun-ye Luo
(Division of Reproductive Medicine,the Second People's Hospital of Yunnan,Kunming,Yunnan 650021,China)

Objective To investigate the effect of Nifuratel nystatin and Metronidazole suppositories on villus ultrastructure and adverse pregnancy outcomes in pregnant women with bacterial vaginosis.Methods The pregnant women with bacterial vaginosis who were admitted to our hospital from April 2013 to July 2015 were divided into group A(37 cases without medication),group B(62 cases treated with Nifuratel nystatin)and group C(60 cases treated with Metronidazole suppositories);at the same time 60 normal pregnant women were enrolled into group D(normal group).The treatment effect was compared between the groups B and C.The adverse pregnancy outcomes,villus ultrastructure and expression of apoptosis protein caspase-3 were compared among the four groups.Results There was no significant difference in the total effective rate or incidence of side effects between the groups B and C(P>0.05),but the recurrence rate in the group B (1.61%)was lower than that in the group C(18.33%,P<0.05).The incidences of adverse pregnancy outcomes in the groups B,C and D were lower than that in the group A(P<0.05).There were significant differences in the villous ultrastructure and caspase-3 expression among the groups A,B and C(P<0.05).Conclusions Nifuratel nystatin has high efficiency and a low recurrence rate in the treatment of bacterial vaginosis in pregnant women,and helps to avoid further damage to villus structure and the occurrence of apoptosis.

Nifuratel nystatin;Metronidazole;bacterial vaginosis;pregnancy

R711.31

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.25.007

1005-8982（2017）25-0032-05

2016-12-13