性別差異對磷脂轉(zhuǎn)運蛋白基因敲除小鼠膽固醇逆轉(zhuǎn)運效率的影響*

張穎，司艷紅，秦樹存

（泰山醫(yī)學院 山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室，山東 泰安271000）

性別差異對磷脂轉(zhuǎn)運蛋白基因敲除小鼠膽固醇逆轉(zhuǎn)運效率的影響*

張穎，司艷紅，秦樹存

（泰山醫(yī)學院 山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室，山東 泰安271000）

目的 觀察磷脂轉(zhuǎn)運蛋白基因敲除（PLTP-/-）后雌雄小鼠血漿脂質(zhì)水平的差異，比較PLTP-/-對雌雄小鼠膽固醇逆轉(zhuǎn)運（RCT）效率的影響。方法 選擇8周齡同窩出PLTP-/-小鼠雌雄各8只，喂飼高脂飼料4周后，酶法檢測小鼠血漿中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-Ch）和非高密度脂蛋白膽固醇（non-HDL-Ch）水平，Western blot檢測血漿載脂蛋白A1（apoA1）表達，小鼠腹腔注射含3H-膽固醇的巨噬細胞，48 h后，取小鼠血漿、肝臟、膽汁、小腸和糞便，利用液閃計數(shù)儀檢測小鼠各組織中的放射活度，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測肝組織清道夫受體BI（SR-B1）、低密度脂蛋白受體（LDL-R）、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G5/G8（ABCG5/G8）、肝X受體α（LXRα）、膽固醇7α羥化酶（CYP7A1）、小腸ABCG5/G8和肝x受體α（LXRα）的基因表達。結(jié)果 相比于雄性PLTP-/-小鼠，雌性PLTP-/-小鼠血漿中TC、TG、HDL-Ch和non-HDL-Ch的表達無明顯改變，但apoA1水平，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），雌性PLTP-/-小鼠升高；體內(nèi)RCT實驗顯示：與雄性PLTP-/-小鼠相比，雌性PLTP-/-小鼠血漿和小腸中放射活度無變化，肝臟、膽汁和糞便中放射活度，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），雌性PLTP-/-小鼠升高；RT-PCR顯示：與雄性PLTP-/-小鼠相比，雌性PLTP-/-小鼠肝臟中RCT相關(guān)因子LXRα、ABCG5/G8及CYP7A1表達，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），雌性PLTP-/-小鼠升高，而SR-B1、LDL-R表達無明顯變化；小腸壁LXRα、ABCG5/G8表達未見明顯變化。結(jié)論 磷脂轉(zhuǎn)運蛋白基因敲除后，雌性PLTP-/-小鼠的膽固醇逆轉(zhuǎn)運效率較高于雄性PLTP-/-小鼠，肝臟中RCT相關(guān)蛋白基因表達增加。

磷脂轉(zhuǎn)運蛋白；膽固醇逆轉(zhuǎn)運；3H-膽固醇；性別差異

膽固醇逆轉(zhuǎn)運（reverse cholesterol transport，RCT）是將外周組織細胞內(nèi)的膽固醇通過血液循環(huán)以高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoproteincholesterol，HDL-Ch）的形式轉(zhuǎn)運至肝臟，在肝臟轉(zhuǎn)化為膽汁酸，最后以糞便的形式排泄出去的過程，可防止膽固醇在外周組織細胞的沉積。在RCT過程中，由于HDL介導了膽固醇從巨噬細胞中流出，促進了膽固醇逆轉(zhuǎn)運而抑制了動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）的發(fā)生和發(fā)展[1]。

磷脂轉(zhuǎn)運蛋白（phospholipid transfer protein，PLTP）是參與HDL代謝和膽固醇逆轉(zhuǎn)運的重要蛋白，它存在于各種組織細胞和血漿中，將磷脂從富含三酰甘油（Triglyceride，TG）的apoB脂蛋白顆粒凈轉(zhuǎn)運至HDL，從而影響體內(nèi)HDL顆粒大小和功能活性[2]。研究證實，系統(tǒng)性PLTP缺乏可明顯下調(diào)血漿HDL水平[3]，內(nèi)源性或外源性PLTP缺乏可損傷三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）介導的膽固醇從巨噬細胞流出[4-5]。前期實驗證實，PLTP缺乏可抑制體內(nèi)RCT效率[6]，但目前未見性別差異對RCT效率影響的相關(guān)報道，本研究針對上述問題進行探討。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乙?；兔芏戎鞍祝╝cetylated low density lipoprotein，ac-LDL）根據(jù)文獻方法制備，1，2-3H- 膽固醇購于美國PerkinElmer公司，Raw264.7巨噬細胞購于上海細胞生物研究所，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購于加拿大Giboc公司，TC、TG、HDL-Ch試劑盒購于北京普利萊生物科技有限公司，apoA1一抗均購自美國Abcam公司，QuantscriptRT Kit Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒、DNA酶I混合液購自德國QIAGEN公司承擔，引物設(shè)計由生工生物工程上海有限公司，液閃計數(shù)儀美國Beckman Ls 6500。

1.2 動物分組與喂養(yǎng)

8周齡PLTP-/-鼠（雌雄各8只）由蔣憲成教授（美國SUNNY大學）提供，在溫度為25℃和空氣相對濕度為55%的適宜環(huán)境中，12/12 h光暗循環(huán)對動物高脂飼料（21%脂肪和0.15%膽固醇）喂飼4周。

1.3 LDL的乙?；?/h3>

取新鮮人血漿，超速離心技術(shù)提取LDL，濃縮至5 g/L，4℃條件下，在不含EDTA的生理鹽水中透析24 h。冰浴中不斷攪拌下，將1 ml飽和醋酸鈉加入含有 1 ml LDL（5 mg）的試管內(nèi)，再滴（2μl/滴）加7.5 mg醋酸酐（約LDL蛋白的1.5倍，30 min內(nèi)滴加完畢），攪拌30 min后裝入透析袋，4℃下透析24 h終止乙?；y得TBARS值為1.415，瓊脂糖凝膠電泳顯示遷移率增加了1倍，表明LDL被乙?；?，得到ac-LDL[7]。其中透析液組成：0.15 mol/L NaCl，0.3 mmol/L EDTA，pH7.4。

1.4 3H-膽固醇標記的巨噬泡沫細胞的培養(yǎng)

制備巨噬泡沫細胞[8]：Raw264.7巨噬細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基，加入5 mCi/L3H-膽固醇和100mg/Lac-LDL孵育24 h。收集細胞，胰酶消化離心，加入預冷PBS沖洗2遍，離心2 min（1 000r/min），使細胞懸浮于PBS，調(diào)整細胞數(shù)為1.2×1010個/L，置于冰上備用。吸取細胞懸液置于EP管（100μl/管）中離心，吸取上清液10μl，液體閃爍儀計數(shù)，重復3次。吸除剩余上清，加入200μl正己烷/異丙醇（3∶2），混勻，離心，將有機相真空干燥（抽提2遍），液體閃爍儀計數(shù)，計算細胞內(nèi)和上清液記數(shù)的平均比例，細胞內(nèi)應(yīng)>95%。

1.5 小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運實驗

高脂喂飼PLTP-/-鼠4周后，內(nèi)眥取血100μl，離心取血漿，用于檢測TC、TG、HDL-Ch和non-HDLCh。小鼠腹腔注射3H-膽固醇標記的巨噬泡沫細胞，48 h后檢測血液中的放射活性：內(nèi)眥取血離心10 min（2 500 r/min），取20μl血漿加入閃爍液10 ml，檢測放射活性。小鼠禁食12 h后處死，取膽汁，加入閃爍液10 ml，檢測放射活性。肝臟中放射活性的檢測[9]如下：取肝臟組織，預冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重勻漿，用正己烷/異丙醇（3∶2）萃?。ㄖ貜?次），收集脂質(zhì)層，真空冷凍干燥濃縮，檢測放射活性。糞便中放射活性的檢測[10]如下：取48 h內(nèi)的糞便稱重，在4℃超純水中浸泡過夜（1 g/10 ml），次日加入等量乙醇勻漿，取200μl勻漿液進行放射活性檢測。

1.6 血漿脂質(zhì)和apoA1水平檢測

酶法測定血漿中TC、TG和HDL-Ch水平，non-HDL-C水平由TC減去HDL-Ch獲得。Western blot實驗檢測血漿中apoA1水平。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）實驗

取肝組織或小腸各50~100 mg，液氮中研磨成粉末，迅速加入1 ml Trizol液研磨得勻漿液。室溫放置5 min，離心取上清，棄沉淀。上清液中加入200μl氯仿，擰緊離心管蓋，用手劇烈震蕩15 s，4℃離心15 min（12 000 r/min），分為 3 層，棄去中下層。取上層水相約400μl至EP管，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置 10 min，4℃離心，12 000 r/min，15 min。棄去上清，將管壁和管底沉淀合并，加入DEPC水配制的75%乙醇1 ml洗滌沉淀，4℃離心5 min（7 500 r/min）。棄去洗液，沉淀室溫干燥15～20 min，去離子水20μl（DEPC處理）溶解沉淀。取2μl原液置另一EP管中，加入98μl DEPC水，混勻。以DEPC水為空白對照，檢測260 nm與280 nm波長下的 OD值，1 OD值=40μg RNA。OD260/280值>1.6的標本進行實驗，在1.80～2.00范圍內(nèi)的視為純度較高。取5μl總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取情況和完整性。另取10μg總RNA稀釋于30μl DEPC水中，加入5μl DNA酶I混合液于37℃水浴40 min，再加入3.5μl 20 mmol/L的EDTA，75℃10 min滅活DNA酶活性。上述混合液分裝在單個反應(yīng)管中置于冰上，再加入模版RNA，徹底混勻（渦旋震蕩時間不超過5 s），簡短離心收集管壁殘留液體，37℃孵育 60 min，采用 2-ΔΔCt方法實時定量mRNA水平，以基因相對β-actin數(shù)值作為表達數(shù)值。采用Rotor-gene Q軟件Ver.1.7（Qiagen）。每個實驗重復3次。見表1。

表1 RT-PCR所用引物序列

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PLTP基因敲除對雌雄小鼠體重和肝重的影響

兩組小鼠的體重和肝重數(shù)值見表2。高脂喂飼4周后，相比于雄性PLTP-/-小鼠，雌性PLTP-/-小鼠的體重和肝重分別下降了19.152%和28.57%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表2 高脂喂飼4周后雌雄PLTP-/-小鼠的體重、肝重及肝指數(shù)的變化 （n=8，±s）

表2 高脂喂飼4周后雌雄PLTP-/-小鼠的體重、肝重及肝指數(shù)的變化 （n=8，±s）

注：覮與雄性PLTP-/-小鼠比較，P<0.05

組別肝指數(shù)/%雄性PLTP-/-小鼠 4.999±0.28雌性PLTP-/-小鼠 4.416±0.22體重/g 肝重/g 28.204±1.51 1.410±0.22 22.805±2.32覮 1.007±0.20覮

2.2 PLTP基因敲除對雌雄PLTP-/-小鼠血脂的影響

高脂喂飼4周后，雌性PLTP-/-小鼠的TC、HDL-Ch、TG和non-LDL-Ch分別為61.701、16.722、103.011和 45.013 mg/dl，雄性PLTP-/-小鼠的 TC、HDL-Ch、TG和non-LDL-Ch分別為 65.721、18.533、102.403和48.511 mg/dl。與雄性PLTP-/-小鼠相比，雌性PLTP-/-小鼠上述指標均無統(tǒng)計學意義（P=0.091、0.112、0.553 和 0.080）（見圖 1）。Western blot 檢測雄性PLTP-/-小鼠apoA1表達量為0.49，雌性PLTP-/-小鼠apoA1為0.69，兩兩比較，雌性小鼠相比于雄性PLTP-/-小鼠表達升高了40.25%（見圖2）。

圖1 高脂喂飼4周后，雌雄PLTP-/-小鼠血脂的變化 （n=8，±s）

圖2 高脂喂飼4周后，雌雄PLTP-/-鼠血脂中apoA1 的表達變化 （n=8，±s）

2.3 PLTP基因敲除對雌雄PLTP-/-小鼠膽固醇逆轉(zhuǎn)運效率的影響

閃爍計數(shù)儀檢測結(jié)果顯示，雄雌性PLTP-/-小鼠血漿中放射活度分別為0.613和0.655，兩者差異無統(tǒng)計學意義（P=0.212）。雌雄性PLTP-/-小鼠小腸中放射活度分別為2.723和2.822，兩者比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.072）。雄性PLTP-/-小鼠肝臟、膽汁和糞便中放射活度分別為3.112、0.282和4.031，雌性PLTP-/-小鼠肝臟、膽汁和糞便中的放射活度分別為6.024、0.514和8.012，相比于雄性PLTP-/-小鼠，雌性PLTP-/-小鼠的放射活度，分別升高57.89%、66.67%和87.52%（見圖3）。

2.4 PLTP基因敲除對膽固醇逆轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達的影響

RT-PCR實驗結(jié)果顯示，雄性PLTP-/-小鼠的LXRα、ABCG5/G8、膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7-alphahydroxylase，CYP7A1） 表達分別為 1.439、1.401、1.423和1.476，雌性PLTP-/-小鼠的LXRα、ABCG5/G8、CYP7A1 表達分別為 1.824、1.602、1.614 和 1.735。相比于雄性PLTP-/-小鼠，雌性PLTP-/-小鼠肝臟中上述指標均差異有統(tǒng)計學意義（P=0.016、0.023、0.034和0.014），表達上升。SR-B1、LDL-R表達差異無統(tǒng)計學意義（P=0.073和 0.105）（見圖 4A），而LXRα、ABCG5/G8在雌雄PLTP-/-小鼠小腸中表達差異無統(tǒng)計學意義（P=0.077、0.125和 0.081）（見圖4B）。

圖3 PLTP-/-雌雄小鼠對膽固醇逆轉(zhuǎn)運效率的影響（n=8，±s）

圖4 膽固醇逆轉(zhuǎn)運相關(guān)基因mRNA在PLTP-/-雌雄小鼠肝臟（A）與小腸（B）中的表達 （n=8，±s）

3 討論

RCT是膽固醇與脂蛋白代謝的重要途徑，1973年由GLOMSET等[11]首次提出，亦稱為傳統(tǒng)的RCT路線。其過程如下[1]：首先，膽固醇經(jīng)外周細胞膜上的轉(zhuǎn)運體流出到apoA-1或HDL上。血液中HDL顆粒上的部分膽固醇酯可與LDL、VLDL或乳糜微粒上的TG或磷酯（PL）進行交換，前者依靠膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白（cholesterol ester transfer protein，CETP）介導，后者依靠PLTP介導。PLTP不僅介導PL轉(zhuǎn)移，還使中等大小的α-HDL融合成大的HDL，釋放貧脂apoA-l，從而促進外周膽固醇轉(zhuǎn)運。其次，HDL隨血液循環(huán)到達肝臟，結(jié)合特異性受體SR-B1，HDL攜帶的膽固醇轉(zhuǎn)運至肝臟。肝臟中的膽固醇可經(jīng)CYP7A1催化轉(zhuǎn)變成膽汁酸，膽汁酸經(jīng)ABCB4/B11外排至膽管，經(jīng)膽汁進入腸道排出；肝臟中的膽固醇亦可直接經(jīng)ABCG5/G8轉(zhuǎn)運至膽汁中，進而經(jīng)糞便排出體外。

實驗證實性別差異影響了PLTP-/-小鼠體內(nèi)RCT效率。同位素示蹤實驗顯示：與雄性PLTP-/-小鼠相比，雌性PLTP-/-小鼠肝臟、膽汁和糞便中3H-膽固醇升高，而腸壁中3H-膽固醇含量無明顯變化，這提示雌性小鼠經(jīng)肝臟途徑RCT效率增高，而經(jīng)腸道直接排出效率與雄性小鼠差異無統(tǒng)計學意義。熒光定量PCR實驗發(fā)現(xiàn)：雌性小鼠肝臟中ABCG5/G8及CYP7A1表達升高，這表明，小鼠主要以肝臟直接排泌或以膽汁酸形式排泌膽固醇。本實驗亦證實雌性小鼠肝臟LXRα表達升高。LXRα是配體活化的轉(zhuǎn)錄因子，在體內(nèi)RCT調(diào)控中起著十分重要的作用。LXRα-ABC通路在RCT過程中具有重要調(diào)控作用，LXRα通過對ABC超家族中ABCA1、ABCG1、ABCG5/G8等的表達調(diào)節(jié)直接調(diào)控細胞膽固醇代謝。與腸道3H-膽固醇表達無變化相對應(yīng)，影響腸壁膽固醇排泌的轉(zhuǎn)運蛋白ABCG5/G8及其上游調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運子表達無變化。

PLTP是調(diào)節(jié)HDL代謝的重要蛋白之一，其表達變化影響HDL介導的RCT的多個環(huán)節(jié)。但性別差異對PLTP-/-鼠RCT功能的影響未見報道。已有實驗證實雌激素對心血管疾病具有保護作用，其抗AS的機制大多與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮、血管平滑肌、血脂及抗凝血等作用有關(guān)[12]。前期實驗證實，PLTP缺乏后降低了HDL中鞘氨醇磷酸酯（sphingosine-1-phosphate，S1P）的含量[13]，并且 S1P 是 HDL心血管保護作用的重要介質(zhì)[14-15]，因此，雌性血漿HDL在心血管內(nèi)皮的保護作用極有可能與雌性激素調(diào)節(jié)S1P水平有關(guān)。其相關(guān)機制，有待進一步深入研究。

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（張蕾 編輯）

Effect of gender difference on reverse cholesterol transport efficiency in PLTP-/-mice*

Ying Zhang,Yan-hong Si,Shu-cun Qin
(Key Laboratory of Atherosclerosis in Universities of Shandong,Taishan Medical University,Taian,Shandong 271000,China)

Objective To compare the effects of phospholipid transfer protein gene knockout(PLTP-/-)on reverse cholesterol transport effiency,and observe the changes of plasma lipids in male and female PLTP-/-mice.Methods In this study 8 male and 8 female 8-week littermate PLTP-/-mice were selected and fed with high-fat diet for 4 weeks.Then plasma lipids such as total cholesterol(TC),triglyceride(TG),high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C)and non-high density cholesterol(non-HDL-C)were detected by an enzymatic method.The plasma level of apolipoprotein A1(apoA1)was analyzed by Western blot.Then all mice were injected intraperitoneally with3H-cholesterol labeled macrophages and the appearance of3H-tracer in plasma,liver,bile,intestinal wall and feces over 48 h was determined by liquid scintillation counter.The mRNA expressions of scavenger receptor class B type 1(SR-B1),low density lipoprotein-receptor(LDL-R),ATP-binding cassette transporter G5/G8 (ABCG5/G8),liver X receptor α (LXRα)and cholesterol 7α-hydroxylase A1(CYP7A1)in liver,and ABCG5/G8 and LXRα in intestinal wall were determined by RT-PCR.Results Compared with the male PLTP-/-mice,the expressions of TC,TG,HDL-C and non-HDL-C in the female PLTP-/-mice were not obvious changed,the expression of apoA1 was increased significantly(P<0.05).The isotope tracing experiment showed3H-cholesterol of plasma and intestine had no differences between the female and male mice;3H-tracer of liver,bile and feces was increased significantly(P<0.05).Meanwhile,RT-PCR analysis showed the mRNA expressions of LXRα,ABCG5/G8 and CYP7A1 in the liver were up-regulated significantly in the female mice compared with the male mice(P<0.05),while the mRNA expressions of SRB1 and LDL-R in the liver and LXRα and ABCG5/G8 in the intestinal wall were not different between the female and male mice(P>0.05).Conclusions Reverse cholesterol transport efficiency is higher and the mRNA expressions of the genes related to reverse cholesterol transport in liver are also significantly higher in the female PLTP-/-mice than in the male PLTP-/-mice.

phospholipid transfer protein;reverse cholesterol transport;3H-cholesterol；gender difference

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.25.003

1005-8982（2017）25-0013-06

2016-10-12

山東省自然科學基金（No：ZR2013HL063）；山東省泰山學者崗項目（No：ts20151105）