腫瘤靶向的磁性熒光IR780Fe3O4納米顆粒用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)

孫枝紅 周理華 鄧冠軍 鄭明彬++言偉強(qiáng)++李文軍 蔡林濤 龔萍

摘 要 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells，CTCs）的簡(jiǎn)單、快速分離和檢測(cè)是目前臨床研究中面臨的一項(xiàng)挑戰(zhàn)。本研究制備了具有腫瘤靶向識(shí)別作用的磁性熒光IR780Fe3O4納米顆粒， 并將其用于CTCs的分離和檢測(cè)。通過(guò)電鏡、熒光光譜儀和超導(dǎo)量子干涉儀對(duì)合成的IR780Fe3O4納米顆粒進(jìn)行表征； 采用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀對(duì)IR780Fe3O4納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的靶向效果進(jìn)行了分析； 利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)IR780Fe3O4納米顆粒在MCF7細(xì)胞中的位置進(jìn)行定位； 并根據(jù)IR780Fe3O4納米顆粒孵育后腫瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。研究結(jié)果表明，IR780Fe3O4能很好地靶向多種CTCs。細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，IR780Fe3O4主要靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞的線粒體。通過(guò)Fe3O4磁性納米顆粒偶聯(lián)IR780建立的這種方法可很好地區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，并對(duì)模擬血液中的CTCs進(jìn)行了分離和檢測(cè)。

1 引 言

腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和難以根治的重要原因[1]。腫瘤的微轉(zhuǎn)移（Micrometastasis）是指少數(shù)具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，轉(zhuǎn)移到血液、淋巴結(jié)、骨髓或遠(yuǎn)處器官中。目前臨床上的檢測(cè)方法很難發(fā)現(xiàn)這種微轉(zhuǎn)移[2]。相關(guān)研究表明，在癌癥發(fā)展的早期，已有微轉(zhuǎn)移發(fā)生。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells，CTCs）是自發(fā)或因診療操作，由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移病灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志。CTCs是公認(rèn)的腫瘤轉(zhuǎn)移的先導(dǎo)標(biāo)志，其可作為腫瘤分期的重要判定標(biāo)準(zhǔn)[3]。此外，研究也表明， 腫瘤患者CTCs數(shù)據(jù)可作為腫瘤分期的重要預(yù)測(cè)因子和病情改善與否的標(biāo)志[4]。CTCs的早期檢測(cè)有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的微轉(zhuǎn)移、監(jiān)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)、評(píng)估療效及預(yù)后或選擇合適的個(gè)體化治療[5～7]。而且CTCs檢測(cè)樣本為血液，而血液標(biāo)本易于收集且為微創(chuàng)性，因此即使是在無(wú)轉(zhuǎn)移的情況下，CTCs也可作為潛在性實(shí)時(shí)標(biāo)志物用于監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和指導(dǎo)治療方案的建立，預(yù)測(cè)治療的有效性和必要性[8，9]。CTCs檢測(cè)常見的檢測(cè)方法有聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、流式細(xì)胞分選（Fluorescenceactivated cell scanning/sorting， FACS）、免疫磁性分離（Magneticactivated cell separation， MACS）、稀有細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，及基于表面拉曼增強(qiáng)（SERS）和量子點(diǎn)的方法[6，10～13]，基于納米界面的捕獲和分離方法近幾年來(lái)也備受關(guān)注[14～16]。

盡管CTCs應(yīng)用前景較好，但是在實(shí)際臨床過(guò)程中應(yīng)用程度則較低， 其原因主要有： （1）目前市場(chǎng)上尚無(wú)檢測(cè)CTCs的完善的商業(yè)化系統(tǒng)； （2） 對(duì)于通過(guò)EpCAM檢測(cè)CTCs的方式， 受到EpCAM表達(dá)的限制； （3）目前常用的檢測(cè)方式過(guò)于繁瑣，對(duì)操作水平要求過(guò)高并且所需成本亦較高。鑒于上述的不足，建立快速、簡(jiǎn)易、可準(zhǔn)確檢測(cè)CTCs并且將其有效分離的方法， 仍然是目前該領(lǐng)域所面臨的一項(xiàng)挑戰(zhàn)[10，11]。

納米材料尤其是磁性納米顆粒納米材料已被廣泛用于癌癥的診斷和治療。其中超順磁性氧化鐵納米顆粒尤其是Fe3O4， 因其獨(dú)特的磁特性和易于化學(xué)修飾而改善生物相容性備受關(guān)注[17，18]。Fe3O4納米顆粒已廣泛應(yīng)用于生物固定、生物分離、環(huán)境處理、生物醫(yī)藥和醫(yī)學(xué)工程、食品分析等方面[19～22]。此外，近紅外染料逐漸被應(yīng)用于腫瘤成像和靶向治療方面，其穿透能力強(qiáng)，激發(fā)波長(zhǎng)一般介于700～1000 nm之間，因此，在深部組織很容易檢測(cè)到熒光強(qiáng)度[23～25]； IR780作為近紅外染料中的一種， 具有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度和腫瘤靶向性， 可選擇性地靶向輸送至腫瘤的線粒體中， 常用于腫瘤成像和治療[23～30]。Zhang等[31]探討IR780靶向線粒體的機(jī)制，結(jié)果表明， 有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽OATP1B3亞型在IR780靶向腫瘤細(xì)胞線粒體的過(guò)程中扮演著重要作用； Wang等[32]利用IR780靶向腫瘤細(xì)胞線粒體的特點(diǎn)，將其用于耐藥性肺癌細(xì)胞的治療，同常見化療藥物相比， 其可更好地靶向腫瘤細(xì)胞， 并且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

本研究建立了Fe3O4磁性納米顆粒偶聯(lián)IR780分離和檢測(cè)CTCs的新的檢測(cè)方法。利用IR780兼具較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度和靶向腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，通過(guò)熒光成像和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的可行性，并建立了定量測(cè)定CTCs的方法，對(duì)其實(shí)用性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

FP6000熒光光譜儀（Jasco公司）； Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)萊卡公司）； NANO ZS多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）； ViCELL XR全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）； Tecnai G2F20場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（美國(guó)FEI公司）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、鏈霉素、青霉素等購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司； Lysotracker Green、DAPI磁珠（Fe3O4納米顆粒， 美國(guó)Thermo Fisher公司）。所用試劑均為分析純

2.2 IR780Fe3O4納米顆粒的制備

2.2.1 IR780NH（CH2）6NH2的合成 在5 ml無(wú)水DMF中加入6.97 mg己二胺2.1 μL三乙胺（TEA）， 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入10 mg IR780，進(jìn)行氯取代，室溫下反應(yīng)4 h。減壓蒸餾除去DMF，用二氯甲烷/甲醇溶解， 層析過(guò)柱，得到綠色固體，產(chǎn)率為78%。

2.2.2 IR780Fe3O4的制備 將100 μL磁珠、 200 μL 0.4 mol/L NHS、 200 μL 0.4 mol/L EDC在DMF中活化3 h。 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入IR780NH（CH2）6NH2， 室溫反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)液用水透析3天后，將透析好的納米顆粒用截留分子量100 kDa 的超濾管超濾洗滌3次，即得到IR780Fe3O4納米顆粒。endprint

2.3 IR780Fe3O4納米顆粒的表征

采用透射電鏡（ TEM）觀察IR780Fe3O4納米顆粒的形貌。取純水溶液中的IR780Fe3O4納米顆粒通過(guò)FP6000熒光光譜儀測(cè)定其熒光發(fā)射光譜； 采用VSM振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)測(cè)定IR780Fe3O4納米粒子的磁化曲線。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

選擇MCF7、bEnd3、A498、293、A549、HepG2、LO2、SKOV3和MCF10A（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中MCF10A、LO2細(xì)胞系用RPMI1640完全培養(yǎng)基，其余細(xì)胞系均用DMEM完全培養(yǎng)基（10%小牛血清+1%的青霉素，鏈霉素）培養(yǎng)，置于5% CO2氣氛中， 37℃恒溫箱中培養(yǎng)。

2.5 激光共聚焦顯微鏡測(cè)定IR780Fe3O4的靶向效果

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7、bEnd3細(xì)胞按照5000個(gè)/孔的濃度鋪于8孔共聚焦平板中，放置于5% CO2， 37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基，每孔加入200 μL無(wú)血清的DMEM，同時(shí)加入5 μL濃度為2.5 μg/mL IR780Fe3O4納米顆粒，孵育30 min后，PBS洗滌2次，加入DAPI染色液對(duì)細(xì)胞核染色和Lyso tracker Green對(duì)細(xì)胞溶酶體進(jìn)行染色。15 min后，PBS洗滌兩次，加入DMEM后用激光共聚焦顯微鏡對(duì)其進(jìn)行成像及定位觀察。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞對(duì)IR780Fe3O4納米顆粒攝取

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞（MCF7、A498、SKOV3和A549）和正常細(xì)胞（bEnd3、293、LO2、和MCF10A）按照5×104 cell/mL鋪于培養(yǎng)皿中，放置于5% CO2， 37℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜后，分別加入10 μL 2.5 μg/mL IR780Fe3O4納米顆粒，孵育30 min，棄去培養(yǎng)基，0.25%胰酶消化，置于1.5 mL離心管，再用PBS離心洗2次，流式細(xì)胞儀測(cè)定腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞對(duì)IR780Fe3O4納米顆粒的攝取情況。

2.7 CTC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及性能評(píng)價(jià)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7細(xì)胞按照5 × 104 cell/mL鋪于培養(yǎng)皿中，置于5% CO2， 37℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜后，加入10 μL IR780Fe3O4納米顆粒至終濃度為2.5 μg/mL，孵育30 min，棄去培養(yǎng)基，0.25%胰酶消化，稀釋成不同的濃度（50、100、5×102、1×103、5×103、1×104、5×104、1×105 cell/mL），測(cè)定不同濃度下的熒光值，根據(jù)熒光測(cè)定值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果與討論

3.1 IR780Fe3O4的合成及對(duì)腫瘤和正常細(xì)胞的靶向識(shí)別原理

IR780具有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度和腫瘤靶向性，并且其穿透能力強(qiáng)，在深部組織中也可檢測(cè)到其熒光強(qiáng)度[33，34]。在所有類別的納米顆粒中，超順磁性氧化鐵納米顆粒，尤其是Fe3O4，因其獨(dú)特的磁特性和易于化學(xué)修飾而改善生物相容性備受關(guān)注[17，18]。

IR780Fe3O4納米顆粒的透射電鏡（圖1A）顯示其顆粒大小均一，分散性好，呈經(jīng)典的球形。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射DLS粒度儀測(cè)得IR780Fe3O4納米顆粒的平均水合粒徑約為31.6 nm； IR780Fe3O4在不同pH值和不同NaCl濃度的穩(wěn)定性如圖1B所示，表明IR780Fe3O4在pH值介于5～9之間具有很好的穩(wěn)定性，但是過(guò)高的離子濃度則破壞IR780Fe3O4的穩(wěn)定性； 圖1C為IR780的激發(fā)和發(fā)生光譜，在730 nm激發(fā)下，IR780Fe3O4納米顆粒的發(fā)射峰在788 nm，具有較好的體內(nèi)成像潛力[13，17]； 室溫下測(cè)得IR780Fe3O4納米粒子磁化曲線，其飽和磁強(qiáng)度為4.02 emu/g，如圖1D所示，說(shuō)明IR780Fe3O4納米顆粒兼具Fe3O4的磁特性優(yōu)勢(shì)[18]，可用于腫瘤細(xì)胞的磁分離。

3.2 IR780Fe3O4對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向識(shí)別作用

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示， 視野中經(jīng)IR780Fe3O4孵育后，在同樣的參數(shù)條件下，MCF7細(xì)胞和bEnd3細(xì)胞相比呈現(xiàn)更強(qiáng)熒光強(qiáng)度，為進(jìn)一步說(shuō)明條件的一致性，將IR780Fe3O4孵育后MCF7和bEnd3細(xì)胞分別給予溶酶體探針標(biāo)記，通過(guò)對(duì)比可更清晰地呈現(xiàn)出兩種細(xì)胞之間的熒光差異性。此外，將MCF7和bEnd3細(xì)胞混合共培養(yǎng)，經(jīng)IR780Fe3O4孵育，在同一視野下可清晰分辨出MCF7和bEnd3熒光差異性，同時(shí)也將其用溶酶體探針染色后，通過(guò)對(duì)比可顯示出更明顯熒光差異（圖2）。

流式細(xì)胞儀分析IR780Fe3O4，孵育后腫瘤細(xì)胞（MCF7、A498、A549和SKOV3）和正常細(xì)胞（bEnd3、293、LO2和MCF10A）熒光強(qiáng)度的變化（圖3），IR780Fe3O4孵育后，無(wú)論是腫瘤細(xì)胞，還是正常細(xì)胞，均較未孵育的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度增加，但是孵育后腫瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)度均介于104～105，明顯高于正常細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（102～103）。

3.3 IR780Fe3O4納米顆粒在細(xì)胞中的定位

圖2和圖3表明IR780Fe3O4可進(jìn)入細(xì)胞。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察IR780Fe3O4在細(xì)胞器中的具體分布情況（圖4），將經(jīng)2.5 μg/mL IR780Fe3O4孵育后的MCF7細(xì)胞，分別進(jìn)行溶酶體和細(xì)胞核雙染及線粒體和細(xì)胞核雙染，在激發(fā)波長(zhǎng)為405， 543和633 nm激光下觀察IR780Fe3O4的分布情況，IR780Fe3O4位于細(xì)胞質(zhì)中，并未進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，其熒光與線粒體探針熒光基本上可以完全重合，表明IR780Fe3O4納米顆?？梢赃M(jìn)入細(xì)胞并且靶向于線粒體中，結(jié)果如圖4所示，這與文獻(xiàn)[31，32]一致，IR780可以靶向至腫瘤的線粒體中，可用于腫瘤熒光成像。

3.4 IR780Fe3O4應(yīng)用于CTC檢測(cè)

將IR780Fe3O4納米顆粒孵育MCF7細(xì)胞，分別稀釋成50、100、500、1×103、5×103、1×104、5×104和1×105 cell/mL，采用FP6000熒光光譜儀測(cè)定不同濃度下相應(yīng)的熒光值，并且根據(jù)熒光測(cè)定值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）； 取IR780Fe3O4納米顆粒孵育過(guò)，但細(xì)胞濃度未知的MCF7、A549、A498和SKOV3 細(xì)胞，按照1∶1， 1∶5和1∶25的比例稀釋成3個(gè)梯度，每個(gè)梯度分別取3 mL（分裝在3個(gè)離心管中，每管1 mL），其中管1通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度并根據(jù)熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞數(shù)量； 另外，管2應(yīng)用磁分離技術(shù)將分離出的細(xì)胞分別用細(xì)胞板和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和熒光法均具有較好依從性優(yōu)于細(xì)胞板計(jì)數(shù)法，表明采用IR780Fe3O4檢測(cè)CTC的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有可行性（見表1和圖5）。

為了進(jìn)一步闡明IR780Fe3O4可有效地檢測(cè)和分離腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，將1000 cell/mL MCF7分別與同濃度正常細(xì)胞bEnd3、293、LO2、和MCF10A

4 結(jié) 論

CTCs是循壞癌癥極為重要的標(biāo)志物，可作為患者預(yù)后判斷的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)指標(biāo)。本研究通過(guò)分析熒光強(qiáng)度變化，成功構(gòu)建了CTCs檢測(cè)體系。與其它方法相比，本方法制備簡(jiǎn)單、檢測(cè)和分離方式快捷，可有效地用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞。但是，CTCs因癌癥種類不同而存在差異性，因此不能通過(guò)單一的檢測(cè)方式就能夠確定CTCs數(shù)量，進(jìn)而評(píng)估患者疾病狀態(tài)及其預(yù)后，而是應(yīng)根據(jù)不同腫瘤細(xì)胞表面分子表達(dá)特點(diǎn)聯(lián)合小分子熒光測(cè)定的優(yōu)勢(shì)，確定CTCs的數(shù)量，因此，后續(xù)的研究可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步完善，進(jìn)而提高檢測(cè)效率。endprint