陰離子型芘基探針用于水體中對硝基苯胺的熒光檢測

葛文奇+圣迎迎+喬亞東+曹忠+吳海臣+姚志軼

摘 要 本研究利用陰離子型芘衍生物8羥基芘1，3，6三磺酸三鈉鹽（HPTS），建立了一種快速、可視化的對硝基苯胺（PNA）熒光檢測方法。檢測原理主要是基于PNA通過非共價作用而導(dǎo)致的HPTS的熒光淬滅。通過測量加入PNA后HPTS在512 nm處熒光強度的變化，可以實現(xiàn)PNA的熒光檢測。本方法的線性范圍為10～120 μmol/L，檢出限（3σ/s）為4.6 μmol/L。對本方法的抗干擾性以及方法的實際應(yīng)用性進行了考察。結(jié)果表明，本方法具有低成本、高靈敏度、高選擇性、操作簡便等優(yōu)點。

1 引 言

苯胺及其衍生物是一類重要的化工原料與藥物中間體，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥，橡膠，高分子，染料及藥物等化學(xué)品的生產(chǎn)過程中[1，2]。該類化合物的過度使用與排放已經(jīng)對環(huán)境，特別是水體，造成了很大程度的污染。對硝基苯胺（pNitroaniline，PNA）是一種特殊的苯胺衍生物，具有很高的化學(xué)毒性，可以通過吸入、口服、皮膚接觸等多種方式產(chǎn)生毒害作用，誘發(fā)缺氧、黃疸、貧血等疾病[3～5]。在印染、醫(yī)藥、油漆等行業(yè)中，PNA常被用作化工原料或中間體，可通過多種途徑進入生態(tài)環(huán)境。由于PNA難降解，在環(huán)境中容易發(fā)生蓄積，已成為一種典型的有機污染物[6]。因此，發(fā)展PNA的快速、特異、PNA低成本的檢測方法具有重要意義。

目前所報道的PNA分析方法包括高效液相色譜法[7]、氣相色譜法[8]、氣相色譜質(zhì)譜法[9]， 電化學(xué)分析法[10，11]、分光光度測定法[12，13]、基于納米材料的熒光檢測法[14]、抑制熒光動力學(xué)法[15]等。其中， 色譜法是PNA檢測的國家標準方法，具有較高的準確度； 電化學(xué)分析法需要對電極進行修飾，依靠待測物在電極上的氧化還原反應(yīng)進行檢測。盡管這些方法特點鮮明，但仍然存在一些問題，例如依賴于大型儀器的樣品前處理過程繁瑣、測試周期較長、靈敏度與特異性較低等，而納米材料制備的重復(fù)性和較大毒性也在很大程度上限制了方法的應(yīng)用。為解決以上問題，本研究采用商業(yè)化的陰離子型芘衍生物8羥基芘1，3，6三磺酸三鈉鹽（8Hydroxypyrene1，3，6trisulfonic acid， trisodium salt，HPTS），建立一種簡單、快速、可視化的PNA熒光檢測法。芘及其衍生物是一類性能優(yōu)異的熒光傳感材料，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、高的量子產(chǎn)率和較長的熒光壽命[15～18]，但繁瑣的合成過程和較差的水溶性是限制芘基熒光探針應(yīng)用的主要因素。HPTS作為一種特殊的芘基熒光探針，除了具有上述特點外，還具有良好的水溶性及低廉的成本[19]。 An等利用HPTS與陽離子型聚噻吩的非共價相互作用制備了一種熒光淬滅的超分子聚集體，并用于檢測表面活性劑[20]； Rochar等利用咖啡因?qū)PTS熒光的淬滅，建立了一種咖啡因的熒光檢測法[21]。上述方法均利用了HPTS超高的量子產(chǎn)率和和優(yōu)異的水溶性，具有簡便靈敏的特點。本研究利用市售的HPTS作為探針，通過HPTS與PNA之間的非共價相互作用對水體中的PNA進行測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

U3900型紫外可見分光光度計（日本Hitachi公司）； Scientific Fluorolog3型分子熒光光譜儀（HORIBA）； FE20型pH計（上海梅克勒儀器公司）； BS124分析天平（北京賽多利斯儀器公司）。

8羥基1，3，6芘三磺酸三鈉（北京華威銳科有限公司）； KNO3、Ca（NO3）2、Mg（NO3）2、NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaNO3、NaH2PO4、苯胺、硝基苯、對氨基苯甲酸、對硝基苯胺（阿拉丁試劑有限公司）； 組氨酸、賴氨酸、精氨酸、對氨基苯酚（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）； 對甲氧基苯胺、對氨基氟苯（百靈威公司）。

2.2 母液的配制

稱量26.2 mg HPTS固體，用超純水溶解并定容至10 mL，低溫避光保存，待用（母液濃度為5 mmol/L）。采用相同方法配制100 mmol/L的待測物母液。

2.3 線性響應(yīng)及檢出限的確定

將996 μL 10 mmol/L PB緩沖液（pH=7）加入到樣品池中，加入1 μL HPTS母液，混合均勻后，測定熒光光譜； 隨后，向樣品池中逐漸添加適量PNA，充分混合均勻后（30 s），測定對應(yīng)光譜； 當混合物的光譜響應(yīng)強度基本保持不變時停止測試。根據(jù)IUPAC計算得到檢出限。 熒光光譜的激發(fā)波長為403 nm，激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫寬度為3.0 nm。

2.4 選擇性及干擾效應(yīng)測試

在含有10 mmol/L PB緩沖液的樣品池中，加入1 μL HPTS母液和3 μL不同的干擾物母液，充分混合均勻，測定選擇性的熒光光譜； 類似的，向含有10 mmol/L PB緩沖液的樣品池中，加入1 μL HPTS、3 μL PNA和3 μL 干擾物，充分混合均勻后，測定干擾性的熒光光譜。

2.5 水樣處理、分析

自來水和土壤（北京）經(jīng)過離心和過濾處理，加入到樣品池中，再加入1 μL HPTS母液，混合均勻后，測定熒光光譜； 隨后，向樣品池中逐漸添加適量PNA，測定對應(yīng)光譜； 當混合物的光譜響應(yīng)強度基本保持不變時停止測試。

3 結(jié)果與討論

3.1 實驗條件選擇

HPTS熒光探針檢測PNA的機理如圖1所示。在以HPTS為探針熒光檢測PNA中，考慮到二者相互作用的動力學(xué)問題，首先考察了HPTS與PNA在隨后的1、3、5、7和10 min內(nèi)基本維持不變。此結(jié)果表明HPTS與PNA作用迅速，可在短時間內(nèi)達到平衡。在混合后的1～10 min內(nèi)進行測量，可以忽略混合時間所產(chǎn)生的影響。為了實現(xiàn)最佳傳感性能，考察了溶液pH值對熒光響應(yīng)的影響（圖3）。在不同pH條件下， PNA對HPTS的熒光淬滅程度有輕微波動，在H=70達到最大（86.4%）。因此后續(xù)實驗選擇H=70。endprint

3.2 傳感性能研究

在上述條件下，研究了HPTS的發(fā)射光譜隨PNA濃度變化情況。由圖4可見，在為403 nm入射光激發(fā)下，HPTS的最大發(fā)射波長位于512 nm，此結(jié)果與文獻[17]相符。隨著PNA加入濃度逐漸增大，512 nm的發(fā)射強度逐漸衰減，當[PNA]=500 μmol/L時，發(fā)射峰強僅余初始的2.8%。這驗證了HPTS作為探針快速檢測PNA的可行性。值得注意的是，在PNA濃度逐漸增加過程中，512 nm熒光強度（I）與初始值（I0）的比值（I/I0）與PNA濃度在一定范圍內(nèi)（10 ～ 120 μmol/L）呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)r=0.999。這表明本方法可用于PNA的定量檢測。根據(jù)IUPAC規(guī)定的傳感器靈敏度計算方法可得，此探針對PNA的檢出限（LOD）為4.8 μmol/L。由于HPTS的熒光發(fā)射位于可見光區(qū)，PNA導(dǎo)致的熒光淬滅也可通過肉眼進行觀測。圖5給出了不同濃度PNA存在下HPTS的熒光照片。在未加入PNA時，HPTS溶液可以觀測到明亮的綠色熒光； 當加入50 μmol/L PNA時，HPTS的熒光發(fā)生了明顯下降； 隨著不同濃度PNA的加入，HPTS綠色熒光逐漸變暗直至消失。因此，該探針可用于PNA的可視化檢測，檢出限為50 μmol/L。

3.3 選擇性研究

從圖6可見，除PNA外，所有其它物質(zhì)的I0/I≈107，而PNA的I0/I=780，是其它化合物的7倍以上， 此結(jié)果表明HPTS探針對PNA具有優(yōu)異的選擇性。 溶液熒光顏色的變化也可用于PNA的定性識別。如圖6B所示，只有PNA能夠使HPTS發(fā)生淬滅而變暗，其它物質(zhì)均不會影響其亮綠色熒光的產(chǎn)生。此結(jié)果再次證實了HPTS對PNA的特異性。在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，對傳感機制開展了研究。首先，對比了PNA、苯胺和硝基苯的化學(xué)結(jié)構(gòu)后可知，PNA對HPTS熒光的淬滅是硝基與氨基協(xié)同作用的結(jié)果，氫鍵可能是主要作用力之一。為此對比了HPTS與HPTS/PNA的吸收光譜，發(fā)現(xiàn)加入PNA后，HPTS在455 nm的吸收峰下降，而在368 nm處的吸收峰升高，同時藍移5～6 nm，這表明了HPTS的8位羥基質(zhì)子化狀態(tài)的改變[23]，一定程度上證實了氫鍵存在的可能。其次，熒光壽命測量顯示，HPTS的平均壽命為13.1 ns，分別加入10、30和50 μmol/L PNA后，壽命分別為12.9、12.6和12.3 ns，相對于初始值未發(fā)生顯著變化，說明PNA對HPTS熒光的淬滅并非動態(tài)機制，而是由于二者靜態(tài)復(fù)合物的形成[18]； 此外，核磁共振氫譜的實驗結(jié)果表明，HPTS與PNA混合后，芳環(huán)區(qū)質(zhì)子的化學(xué)位移均向高場區(qū)移動了δ 0.2～0.3，表明二者之間存在著nn作用[16]。綜上所述，PNA的硝基、氨基與HPTS通過氫鍵、nn等相互作用形成復(fù)合物， 導(dǎo)致了HPTS熒光淬滅。

3.4 應(yīng)用研究

為了驗證方法的實用性，首先對方法的抗干擾能力進行了研究。將干擾物與PNA混合，考察HPTS對混合樣品的熒光響應(yīng)情況。在實驗中，對比了Na+、K+、Ca2+、Mg2+、C

4、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、苯胺、對甲氧基苯胺、對氨基氟苯、對氨基苯甲酸、對氨基苯酚及硝基苯對PNA傳感的干擾情況。由圖7可見，與空白比較，干擾物存在時HPTS對PNA的熒光響應(yīng)幾乎未受影響，表明本方法對PNA檢測具有較好的抗干擾能力。

基于上述結(jié)果，將HPTS直接用于實際樣品中PNA的測試。采集自來水（北京）進行分析研究，并采用樣品加標法測定。如圖8所示，HPTS在自來水中對PNA的傳感性能與緩沖液中性能基本一致，線性范圍為10～120 μmol/L，相關(guān)系數(shù)r=0.997，檢出限為4.6 μmol/L。將本方法應(yīng)用于土壤樣品中PNA殘留的測試，得到了與自來水相似的結(jié)果，在土壤樣品提取液中PNA檢測的線性范圍為10～120 μmol/L，相關(guān)系數(shù)r=0.999， 檢出限為8.1 μmol/L。上述結(jié)果表明此傳感器適用于實際水樣中PNA的檢測，具有較好的潛在應(yīng)用價值。

4 結(jié) 論

利用陰離子型芘基探針HPTS建立了一種PNA的快速可視化熒光檢測法。與常規(guī)方法相比，本方法具有快速、簡單、環(huán)保、特異性高、抗干擾能力強等特點。檢測機制基于二者之間非共價相互作用而形成的超分子復(fù)合物。本方法的線性范圍為10～120 μmol/L，可用于實際水樣中PNA的檢測。endprint