HCV 5′非編碼區(qū)基因分型與病毒復(fù)制水平的分析

王越 雷金娥 段巍 江嘯 穆麗君 惠凌云 史雯欣 周聰雅 杜憶華

710061 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系[王越(研究生在讀)、杜憶華]；710061 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科(雷金娥、惠凌云)；710000 西安市中心醫(yī)院(段巍)；710061 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(江嘯、穆麗君、史雯欣、周聰雅)

HCV 5′非編碼區(qū)基因分型與病毒復(fù)制水平的分析

王越 雷金娥 段巍 江嘯 穆麗君 惠凌云 史雯欣 周聰雅 杜憶華

710061 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系[王越(研究生在讀)、杜憶華]；710061 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科(雷金娥、惠凌云)；710000 西安市中心醫(yī)院(段巍)；710061 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(江嘯、穆麗君、史雯欣、周聰雅)

目的研究丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)的基因分型與各基因型的病毒復(fù)制水平，為判斷病情及抗病毒治療提供參考。方法收集未經(jīng)抗病毒藥物治療的抗-HCV陽(yáng)性血清標(biāo)本60份，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)及核苷酸序列分析HCV的5′非編碼區(qū)，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行基因分型，并采用定量-PCR檢測(cè)患者的血清HCV-RNA含量。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 5.0和SPSS21.0軟件進(jìn)行分析。多組間的比較采用方差分析，兩獨(dú)立樣本比較的t檢驗(yàn)。結(jié)果本研究人群中HCV各基因亞型的檢出率依次為1b型48.3%(29/60)、3 a型23.3%(14/60)、1a型16.7%(10/60)和2a型10%(6/60)，并檢出一例2c亞型。HCV 各基因亞型的血清平均病毒RNA含量的對(duì)數(shù)值log10(IU/ml)和標(biāo)準(zhǔn)差分別是：1a型 5.46±1.19、1b型6.22±0.78、2a型5.47±0.65、3a型5.38±0.98 log10(IU/ml)。結(jié)論本研究人群中1型HCV 感染率顯著高于2型和3型的感染率(P<0.01)。1b亞型組血清HCV-RNA含量顯著高于1a、2a和3a亞型感染人群的血清HCV-RNA含量(P<0.05)。研究HCV準(zhǔn)確的基因分型與血清HCV-RNA含量，有助于對(duì)各基因型丙型肝炎患者抗病毒治療方案的制定。

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是慢性肝炎的主要病原體之一，呈世界性流行，目前全球感染者約有1.7億，感染率約為2%～2.5%[1-3]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)人群HCV的平均感染率為3.2%[4]，高于全球的平均感染率。HCV屬黃病毒科(Flaviviridae)，是核酸為+ssRNA的有包膜病毒，通過(guò)血液、性和母嬰途徑傳播引起丙型肝炎，HCV感染者大多病情隱匿，其中約50%～60%轉(zhuǎn)為慢性肝炎，有20%的患者發(fā)展為肝硬化，并與原發(fā)性肝癌的發(fā)生關(guān)系密切[5]。HCV基因組全長(zhǎng)約9.6 Kb，具有高度變異性，根據(jù)變異位點(diǎn)的核苷酸序列不同將HCV分為不同基因型。HCV基因分型通常采用Simmonds法，可分為六個(gè)基因型，其中1型進(jìn)一步分為1a/1b/1c三個(gè)亞型；2型分為2a/2b/2c；3型分為3a/3b；4型有4a；5型有5a；6型有6a共11個(gè)亞型[6]。HCV基因型的分布有顯著的地域性特征，在全球范圍內(nèi)，1-3型HCV感染最為常見(jiàn)，廣泛分布于北美洲、歐洲及包括中國(guó)和日本在內(nèi)的亞洲國(guó)家和地區(qū)；4-6型較為少見(jiàn)，4型見(jiàn)于埃及和非洲，5型見(jiàn)于南非，6型常分布于東南亞國(guó)家[3,7]。HCV基因組的5′端有一個(gè)319-341核苷酸的非編碼區(qū)(5′non-coding region，5′NCR)是HCV基因組中最為保守的區(qū)域，有研究指出，即使在HCV最保守的5′NCR，各個(gè)基因型/亞型的核苷酸序列仍不完全相同，可根據(jù)5′NCR的序列對(duì)HCV，分出1-6六個(gè)基因型，及亞型1a/1b, 2a/2b/2c, 3a/3b, 4型有4a, 5型有5a, 6型有6a共10亞型[8]。

血清中HCV-RNA含量的檢測(cè)是診斷丙型肝炎與評(píng)價(jià)抗病毒治療的重要指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，感染HCV不同基因型是影響疾病嚴(yán)重程度和抗病毒治療效果的主要因素[7,9]。不同基因型HCV感染者對(duì)于干擾素或干擾素聯(lián)合利巴韋林治療的敏感度差異較大，例如1型和4型HCV感染者對(duì)干擾素聯(lián)合利巴韋林治療的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率(Sustained virological response, SVR)遠(yuǎn)較2型和3型感染者的SVR低[7,9-10]，這些研究結(jié)果提示HCV的基因型是影響抗病毒治療效果的重要因素。因此，本研究擬采用通用特異性引物經(jīng)5′NCR核苷酸測(cè)序?qū)CV進(jìn)行基因分型，同時(shí)分析患者血清HCV-RNA含量與病毒基因型的關(guān)系，探討不同基因型HCV在患者體內(nèi)的復(fù)制增殖特征。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象收集2012年5月至2013年9月就診于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院的丙型肝炎患者血清共60份,其中男性28例、女性32例。所有患者血清抗-HCV抗體陽(yáng)性，診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)2015年制定《丙型肝炎防治指南》。所有患者標(biāo)本在就診前半年內(nèi)均未經(jīng)過(guò)抗病毒藥物治療，并排除其它病毒性肝炎。受檢者空腹采集靜脈血，室溫放置20 min, 3 000×g離心15 min，收集血清用于RT-PCR和定量PCR。所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究通過(guò)西安交通大學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審查通過(guò)。

1.2HCVRNA提取病毒RNA提取采用E.Z.N.A viral RNA kit(R6874-01，Omega公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒采用TIAN Script RT Kit(KR104-01，Tiangen公司產(chǎn)品)，按公司提供的說(shuō)明書(shū)操作，提取待檢測(cè)血清中的丙型肝炎病毒RNA，進(jìn)行病毒cDNA 第一鏈的合成。

1.3RT-PCR與HCV核苷酸測(cè)序

1.3.1 PCR引物設(shè)計(jì)：通過(guò)查詢NCBI (National Center for Biotechnology Information)的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得HCV基因型1-6的標(biāo)準(zhǔn)株全基因組序列，Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)的訪問(wèn)號(hào)是(NC_004102.1、NC_009823.1、NC_009824.1、NC_009825.1、NC_009826.1、NC_009827.1)。各基因型的5′NCR核苷酸序列經(jīng)比對(duì)(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST)，得到序列高度保守的區(qū)域進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)特異性通用引物的設(shè)計(jì)。PCR上游引物F1(引物序列5′-CCTCCCGGGAGAGCCATAG-3′(位置是5′NCR的-216 ～ -198nt)位于高度保守，PCR下游引物及逆轉(zhuǎn)錄引物R2(位置是5′NCR的-23 ～-4)，引物序列為5′-CACGGTCTACGAGACCTCCC-3′)；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為213 bp，覆蓋約63%的HCV 5′NCR。由于HCV的基因型/亞型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列不同，通過(guò)以上通用特異性引物的RT-PCR及核苷酸測(cè)序，不僅可將HCV分出1-6型6個(gè)基因型，而且能夠區(qū)分出1a/1b、2a/2b/2c、3a/3b、4a、5a和6a共10個(gè)亞型[8]。

1.3.2 RT-PCR：取2 μl RNA 2 μl逆轉(zhuǎn)錄引物R2 2 μl 4XdNTPs，用ddH2O定容至14.5 μl。70 ℃ 加熱5 min后迅速在冰上冷卻2 min。向反應(yīng)體系中加入1 μl 逆轉(zhuǎn)錄酶TIAN Script M-MLV，混勻。42 ℃ 反應(yīng)50 min后95 ℃ 加熱5 min終止反應(yīng)。PCR：取cDNA 2 μl,加入上游引物F1 1 μl、下游引物R2 1 μl、2x Taq mix 25 μl、ddH2O 21 μl至總體系為50 μl。置于PCR儀上按以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃ 變性5 min，PCR循環(huán)溫度分別為：95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，共30個(gè)循環(huán)，終延伸為72 ℃ 7 min。如果第1輪PCR產(chǎn)物凝膠電泳條帶顯示DNA量足夠，可直接測(cè)序，否則需進(jìn)行二次PCR。二次PCR：取第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物2 μl，其他條件同上PCR所述，共25個(gè)循環(huán)，終延伸為72 ℃ 7min，4 ℃ 保存，待進(jìn)一步瓊脂糖凝膠電泳鑒定和DNA測(cè)序分析。

1.3.3 DNA測(cè)序與分型：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20 μl,送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。將所得測(cè)序結(jié)果與NCBI Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中各標(biāo)準(zhǔn)HCV基因型進(jìn)行比對(duì)，確定HCV基因型及亞型。

1.4丙型肝炎患者血清HCV-RNA定量使用廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的HCV核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)丙型肝炎患者血清中HCV-RNA含量。實(shí)驗(yàn)操作依照試劑盒說(shuō)明，在ABI 7300 Real-time PCR system實(shí)時(shí)定量?jī)x上進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS21.0和Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或率表示，計(jì)量資料的正態(tài)性檢驗(yàn)采用“Kolmogorov-Smirnov Test”方法。多組間病毒計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn), 計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HCV5′非編碼區(qū)RT-PCR產(chǎn)物的電泳鑒定

取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，得到長(zhǎng)度為213 bp目的DNA擴(kuò)增片段。以抗-HCV陰性志愿者血清RNA提取物作為PCR陰性對(duì)照；HCV基因組C區(qū)全序列質(zhì)粒為PCR陽(yáng)性對(duì)照的模板。HCV基因組C區(qū)全序列質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存[11]。

2.2HCV基因分型結(jié)果應(yīng)用HCV的5′NCR通用特異性PCR引物．經(jīng)PCR及核苷酸測(cè)序分析，60例抗-HCV陽(yáng)性血清標(biāo)本，均有明確的HCV基因型/亞型，可分型率為100%?；蚍中徒Y(jié)果如表1所示，該研究人群HCV感染分別屬于3個(gè)基因型，5個(gè)亞型。各基因亞型感染率依次分別為1b 型48.3%(29/60)，3a 型23.3%(14/60)、1a 型16.7%(10/60)和2a型10%(6/60)，另外，檢出一例較為少見(jiàn)的2c亞型。本研究人群未發(fā)現(xiàn)4、5和6型。各基因型HCV感染者在性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HCV 1型(1a+1b)在本研究感染人群中的比率顯著高于2型和3型的感染率(P<0.01)，1b亞型在本研究人群中顯著高于1a、2a和3a亞型的感染率(P<0.05)。

表1 HCV基因分型與血清HCV-RNA含量平均水平

2.3HCV基因分型與血清HCV-RNA含量的結(jié)果本研究感染人群中4種亞型血清HCV-RNA含量的結(jié)果如表1所示，HCV各亞型平均血清HCV-RNA含量的對(duì)數(shù)值是1a型5.46 log10(IU/ml)、1b型6.22 log10(IU/ml)、2a型5.47 log10(IU/ml)和3a型5.38 log10(IU/ml)。4個(gè)基因亞型組的血清HCV-RNA含量經(jīng)方差分析，結(jié)果顯示，1b亞型組的平均血清HCV-RNA含量最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步采用t檢驗(yàn)，對(duì)各基因亞型組之間血清HCV-RNA含量進(jìn)行兩兩比較，1b亞型組與1a、2a和3a各亞型之間t檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1(均P<0.05)。1a、2a和3a各亞型組，兩組之間血清HCV-RNA含量比較結(jié)果均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

3 討論

慢性丙型肝炎是由HCV感染引起，主要經(jīng)血液、性和母嬰等方式傳播。HCV基因型/亞型的分布有明顯的地域性。流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國(guó)大部分地區(qū)流行的HCV 以1b型為主，其次是2a型[12]。不同地區(qū)的感染人群中HCV基因型分布差異較大，雷華等[13]對(duì)176份云南地區(qū)獻(xiàn)人群進(jìn)行HCV基因分型研究，結(jié)果顯示3b型感染為主，其次為3a和1b型。研究發(fā)現(xiàn)靜脈吸毒人群中3型和6型的流行率較高[14]。本研究隨機(jī)選取未經(jīng)抗病毒治療的抗-HCV抗體陽(yáng)性血清標(biāo)本60例，發(fā)現(xiàn)該人群中HCV感染以1型為主(占65%)，其次是3型。其中1a型感染率16.7%(10/60)、1b型48.3%(29/60)，2a型10%(6/60)，3a型 23.3%(14/60)，并檢出其他地區(qū)少見(jiàn)的2c 亞型1例。測(cè)序法仍然是HCV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究的HCV基因分型法采用了多型通用的特異性引物對(duì)，針對(duì)HCV 5′NCR的核苷酸測(cè)序，對(duì)丙型肝炎患者感染的HCV進(jìn)行基因分型，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作方法簡(jiǎn)便，且準(zhǔn)確性高，可檢出Simmonds分型法[6]的HCV主要的6個(gè)基因型和10個(gè)基因亞型[8]。60例標(biāo)本均有明確的基因型及亞型，可分型率為100%，表明該方法的靈敏度較高，但該方法不適合HCV多型別混合感染標(biāo)本的分型。有研究指出，由于HCV的5′NCR在各個(gè)基因型/亞型的核苷酸序列和結(jié)構(gòu)不同，而且5′NCR沒(méi)有病毒基因的重組，因此針對(duì)5′NCR進(jìn)行HCV基因分型和病毒定量的準(zhǔn)確性均高[8]。

血清中HCV-RNA含量是判斷病毒復(fù)制增殖和慢性丙型肝炎患者抗病毒療效的重要指標(biāo)，對(duì)HCV的基因分型與血清HCV-RNA含量關(guān)系的研究有助于了解病毒復(fù)制、疾病進(jìn)展的情況和相關(guān)危險(xiǎn)因素。Blatt等[9,15]大規(guī)模的研究了美國(guó)丙型肝炎患者HCV基因分型與血清HCV-RNA含量的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)1型HCV感染者血清HCV-RNA含量顯著高于2型和3型感染者血清HCV-RNA含量。Berg等[16]研究了德國(guó)379例丙型肝炎患者的HCV基因分型和血清HCV-RNA含量，也指出1型感染者的血清HCV-RNA含量顯著高于3a型。本研究分析了HCV基因型/亞型與血清HCV-RNA含量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者有相關(guān)性，經(jīng)單因素方差分析顯示，1型HCV感染者血清HCV-RNA含量顯著高于2型(2a)和3型(3a)感染者(P<0.05)，尤其是1b亞型感染者血清HCV-RNA含量顯著高于1a、2a和3a亞型 (P<0.05)。而1a、2a和3a各型之間，血清HCV-RNA含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究結(jié)果與美國(guó)和德國(guó)科研人員所做的大規(guī)模研究結(jié)果基本一致[9,15-16]。有學(xué)者指出，血清HCV-RNA檢測(cè)水平受眾多因素影響，例如血清的處理方式、貯存條件，以及患者丙型肝炎病程長(zhǎng)短等因素[17]。HCV是單鏈RNA病毒，血清標(biāo)本中的HCV RNA極易被RNA酶降解，因此所采集的血清標(biāo)本應(yīng)立即進(jìn)行HCV-RNA定量檢測(cè)。用于分型的HCV RNA應(yīng)及時(shí)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，否則血清標(biāo)本應(yīng)保存于-80 ℃，從而最大程度的保證HCV-RNA不被降解和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。近年來(lái)，有大量研究顯示，感染不同基因型HCV，臨床上表現(xiàn)出病情的嚴(yán)重程度不同，發(fā)現(xiàn)1型HCV感染者，尤其是1b亞型感染者較其他型別HCV感染在臨床上表現(xiàn)出較嚴(yán)重的肝炎[5,9]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，丙型肝炎患者對(duì)于抗病毒治療的反應(yīng)也部分取決于感染的HCV基因型，1型感染者不僅血清HCV-RNA含量水平高于其他型別的HCV感染者，而且發(fā)現(xiàn)HCV基因1型感染者對(duì)干擾素或干擾素聯(lián)合利巴韋林治療的SVR顯著低于2型和3型感染者的SVR，由此提出，針對(duì)1型HCV感染者的抗病毒治療應(yīng)該采用干擾素加利巴韋林的聯(lián)合治療，并持續(xù)至少48周[9-10]。因此，深入研究便于臨床應(yīng)用的、準(zhǔn)確的HCV基因分型方法，可能對(duì)預(yù)測(cè)丙型肝炎的預(yù)后和選擇抗病毒治療方案有一定的意義。

本研究應(yīng)用特異性通用引物對(duì)，針對(duì)HCV的 5′NCR測(cè)序?qū)CV進(jìn)行基因分型，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，可檢出HCV主要的6個(gè)型別及10個(gè)基因亞型。本研究進(jìn)一步分析了HCV的基因型與血清HCV-RNA含量的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，1b亞型感染者血清HCV-RNA含量顯著高于1a, 2a和3a亞型的血清HCV-RNA含量，顯示丙型肝炎患者血清HCV-RNA含量與HCV基因型有相關(guān)性。這一結(jié)果提示可能1b亞型HCV在體內(nèi)的復(fù)制較強(qiáng)，這方面還需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)來(lái)加以證實(shí)。針對(duì)慢性丙型肝炎患者的抗病毒藥物治療，需進(jìn)一步研究HCV基因分型，并結(jié)合血清HCV-RNA定量分析，可能有助于科學(xué)的指導(dǎo)臨床抗病毒治療策略和方案的確定。

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2017-07-18)

(本文編輯：唐瀏英)

AnalysisofhepatitisCvirus5′non-codingregionforviralgenotypingandthelevelofviralreplication

WangYue,LeiJin′e,DuanWei,JiangXiao,MuLijun,HuiLingyun,ShiWenxin,ZhouCongya,DuYihua

DepartmentofPathogenicMicrobiologyandImmunology,SchoolofBasicMedicalSciences,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an710061,China[WangY(Graduatestudent),DuYH];DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710061,China(LeiJE,HuiLY);Xi′anCentralHospital,Xi′an710000,China(DuanW);SchoolofBasicMedicalSciences,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an710061,China. (JiangX,MuLJ,ShiWX,ZhouCY)WangYueandLeiJin′econtributedequallytothearticle

DuYihua,Email：ydu@mail.xjtu.edu.cn

ObjectiveTo investigate hepatitis C virus(HCV)genotyping and the serum HCV-RNA concentration in patients infected with different HCV genotypes and to provide information for evaluation of disease condition and anti-viral treatment efficacy.MethodsA total of 60 anti-HCV positive serum samples were collected before antiviral treatment. RT-PCR was performed for the 5′ non-cording region and was followed by nucleotide sequencing for HCV genotyping. Meanwhile, serum HCV-RNA concentration was detected by quantitative PCR. SPSS21.0 and Graphpad Prism 5.0 software were used for data analysis. Analysis of variance (ANOVA) was used for comparison among multi-groups and the t-test was used for comparison between two groups.ResultsThe frequencies of HCV genotypes 1b, 3a, 1a and 2a were 48.3% (29/60), 23.3% (14/60), 16.7% (10/60) and 10% (6/60), respectively. And, there is one subtype 2c was detected in this study. The mean serum viral concentration with standard deviation of HCV in genotype 1a, 1b, 2a, and 3 a were 5.46±1.19, 6.22±0.78, 5.47±0.65, and 5.38±0.98 log10(IU/ml) respectively.ConclusionsThe infection rate of HCV genotype 1 was significantly higher than that of genotype 2 and 3 (P<0.01). The statistical analysis showed the serum HCV-RNA concentration in patients with subtype 1b was significantly higher than that of the subtype group 1 a, 2 a, and 3 a (P<0.05). The study of the relationship between HCV genotypes and the serum HCV-RNA concentration may contribute to anti-viral treatment prescription for hepatitis C patients.

Hepatitis C Virus; 5′non-cording region; HCV genotyping; Serum HCV-RNA concentration

王越與雷金娥對(duì)本文有同等貢獻(xiàn)

杜憶華，Email： ydu@mail.xjtu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.008

丙型肝炎病毒；5′非編碼區(qū)；HCV基因分型；血清HCV-RNA含量

陜西省自然科學(xué)基金(2012JM4044)

FundprogramsNatural Science Foundation of Shaanxi Province(2012JM4044)