改良透明膠帶法在絲狀真菌形態(tài)觀察中的應(yīng)用

馮長海

(寧波美康盛德醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司，浙江寧波 315100)

改良透明膠帶法在絲狀真菌形態(tài)觀察中的應(yīng)用

馮長海

(寧波美康盛德醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司，浙江寧波 315100)

目的建立一種操作簡單且顯微成像效果較佳的絲狀真菌制片技術(shù)。方法將玻片的非毛玻璃端粘貼一層透明膠帶，其上垂直平貼粘有真菌的透明膠帶，真菌剛好鄰近兩條膠帶的交叉線，然后在膠帶交叉處側(cè)面滴加微量乳酸酚棉藍(lán)，待染液浸染真菌后，鏡下觀察真菌的形態(tài)特征。結(jié)果改良透明膠帶法制片觀察可見，真菌孢子形態(tài)、特征及孢子間、菌絲間、孢子和菌絲間位置排列較清晰，鏡檢效果尚佳。結(jié)論改良透明膠帶法與傳統(tǒng)透明膠帶法相比，乳酸酚棉藍(lán)染色鏡檢背景清晰、絲狀真菌完整的典型結(jié)構(gòu)較易獲得，但存在絲狀真菌有時不在同一平面導(dǎo)致成像模糊的缺陷，仍需進(jìn)一步研究。

透明膠帶法；絲狀真菌；形態(tài)學(xué)；顯微成像

透明膠帶法是微生物實驗室常用的形態(tài)學(xué)鑒定絲狀真菌方法，操作簡單，快速有效，在真菌形態(tài)學(xué)鑒定中發(fā)揮非常重要的作用[1-3]。但使用透明膠帶法鏡檢時常會出現(xiàn)真菌孢子間、菌絲間、孢子和菌絲間位置排列關(guān)系混亂，不易出現(xiàn)真菌的典型結(jié)構(gòu)，造成真菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果不可靠。本文將透明膠帶法進(jìn)行改良，從乳酸酚棉藍(lán)作為浮載液，試用于曲霉、毛霉等12種真菌，取得較好的顯微鏡檢效果，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1試劑 乳酸酚棉藍(lán)，馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基。

1.2耗材 透明膠帶(寬18 mm)，載玻片(一端為毛玻璃)，一次性無菌加樣槍頭。

1.3菌種 構(gòu)巢曲霉、煙曲霉、毛霉、橫梗霉、根霉、多育賽多孢、申克孢子絲菌、白僵菌、明臍霉、彎孢霉、斷發(fā)毛癬菌、紅色毛癬菌，來源于美國病理學(xué)家協(xié)會(College of American Pathologists，CAP)的能力驗證活動(proficiency testing，PT)樣本，轉(zhuǎn)種PDA斜面、密封后室溫保存。

1.4方法 將實驗菌株接種在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)，待菌株成熟后備用。取一張95%乙醇浸洗后的潔凈玻片，毛玻璃端可標(biāo)記菌種編號，另一端覆蓋透明膠帶，稱為膠帶端(見圖1A)；另取一段透明膠帶，用無菌鑷子夾住膠帶兩端，使膠帶呈氣球狀，用氣球狀膠帶的頂端粘取真菌菌落(見圖1B)；將粘取真菌菌落的膠帶的一端粘貼于玻片的膠帶端，緩慢松開鑷子，使膠帶的另一端向玻片毛玻璃端平鋪(注意膠帶和玻片間盡量避免形成較大空隙)，而粘取的真菌剛好鄰近兩條膠帶垂直相交的交叉線(見圖1C)；用加樣槍取約5 μL乳酸酚棉藍(lán)(浮載液量可根據(jù)粘取菌量稍作調(diào)整)，沿膠帶交叉處側(cè)面緩慢加入(見圖1D)，待菌體充分浸染后鏡檢。

注：A，透明膠帶(箭頭所指)粘貼在玻片非毛玻璃端;B，透明膠帶粘取真菌菌落;C，粘有真菌的透明膠帶平鋪于玻片;D，兩條透明膠帶交叉處加入乳酸酚棉藍(lán)。1504為CAP2015年4號PT樣本分離的煙曲霉菌編號。

圖1 改良透明膠帶法制片流程

2 結(jié)果

改良后的透明膠帶法試用于曲霉、毛霉等菌株取得較好的顯微成像效果，實驗菌株鏡下均出現(xiàn)完整的特征結(jié)構(gòu)。見圖2。

圖2 實驗菌株乳酸酚棉藍(lán)染色后鏡檢效果

3 討論

傳統(tǒng)的透明膠帶法是將浮載液先滴加于玻片上，然后將粘有真菌的透明膠帶平貼于玻片上，真菌和浮載液接觸后再和玻片接觸。絲狀真菌的形態(tài)特征在接觸浮載液、平鋪固定于玻片的過程中會出現(xiàn)改變：浮載液接觸真菌時的表面張力和液體的流動力以及膠帶的平鋪力均可破壞真菌孢子排列方式，如曲霉鏡下孢子散亂，難見典型的曲霉頭完整結(jié)構(gòu)或曲霉頭結(jié)構(gòu)不清晰，很難獲得背景清晰，結(jié)構(gòu)典型完整的圖像。改良透明膠帶法是將粘有絲狀真菌的膠帶直接平鋪于玻片上，即將懸空的絲狀真菌固定于膠帶后再用浮載液浸染；2張膠帶間形成的微小空隙也限制了浸染真菌的浮載液量及染液擴(kuò)散速度。雖然這種固定真菌形態(tài)的方法也并不牢固，浮載液作用后也可見零亂的孢子，但采用此法后，顯微鏡下較易獲得背景清晰，結(jié)構(gòu)典型完整的圖像，說明浮載液浸染對真菌形態(tài)破壞力較弱，真菌形態(tài)特征能夠較好維持。

同透明膠帶法一樣，改良方法也存在諸多缺點，如制片需在生物安全柜中處理，蠟樣菌落形態(tài)及難見氣生菌絲的真菌制片后顯微成像效果不佳，乳酸酚棉藍(lán)染色后的玻片放置過久會出現(xiàn)染液混濁、鏡下視野模糊不清現(xiàn)象，鏡下視野中也會出現(xiàn)氣泡，膠帶和玻片間若空隙較大會出現(xiàn)如文中明臍霉菌體不在一個水平面的現(xiàn)象等，推測是兩膠帶形成的空隙間喪失了鏡下對焦平面，大多數(shù)結(jié)構(gòu)可能不在一個對焦平面上，肉眼觀察影響不大，但拍照時有難度。由于改良方法使用的是浸染技術(shù)，真菌接觸的乳酸酚棉藍(lán)染液量較少，有些真菌可能會出現(xiàn)不著色或著色淺現(xiàn)象，如文中申克孢子絲菌和白僵菌；有些真菌可能會因為兩片交叉膠帶形成的微小斜面導(dǎo)致背景色深、圖像模糊，如文中斷發(fā)毛癬菌和紅色毛癬菌。以上缺點的解決還需繼續(xù)研究，改變膠帶的成分和/或優(yōu)化染液的質(zhì)量可能是研究的方向。

由于本法屬開放式作業(yè)，操作時需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，待絲狀真菌浸染充分后，用乳酸酚棉藍(lán)浸潤初始加染液端的對側(cè)，即粘有絲狀真菌膠帶兩側(cè)均浸有染液，可起到殺抑真菌，保護(hù)實驗室工作人員的作用；不可直接在玻片兩端都加入染液，否則會導(dǎo)致膠帶中央出現(xiàn)較大氣泡，影響染色成像效果。

[1]Hughes AD，Lorusso GD，DL Greer. The ′double-layer tape prep′: an improvement to a standard technique[J]. J Med Microbiol, 2004, 53(Pt5):455.

[2]陳東科，孫長貴. 實用臨床微生物學(xué)檢驗與圖譜[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2011:626-655.

[3]P.R.默里，E.J.巴倫，M.A.特諾維，等.臨床微生物手冊[M].北京：科學(xué)出版社, 2005：1827-1830.

2017-06-07)

(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.07

馮長海，1970年生，男，副主任技師，碩士，從事真菌的形態(tài)學(xué)鑒定，細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。

R446.5

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