L-谷氨酸氧化酶的研究進(jìn)展

于 爽，遲乃玉，張慶芳*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

L-谷氨酸氧化酶的研究進(jìn)展

于 爽1，2，遲乃玉1，2，張慶芳1，2*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

L-谷氨酸氧化酶是一種潛在的十分有用的工具酶，其輔酶是黃素腺嘌呤二核苷酸，是一種黃素蛋白酶類。以L-谷氨酸為底物，將其降解為過氧化氫、氨和α-酮戊二酸，具有高度底物特異性。該文從L-谷氨酸氧化酶的來源、應(yīng)用、克隆表達(dá)與分離純化進(jìn)行了闡述，并對其研究前景進(jìn)行了展望。

L-谷氨酸氧化酶；來源；應(yīng)用；克隆表達(dá)；純化；研究前景

L-谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase，GLOD）是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）為輔酶的L-氨基酸氧化酶，能在不添加外源性輔助因子的條件下氧化L-谷氨酸脫氨，生成α-酮戊二酸、氨和過氧化氫[1-2]。L-谷氨酸氧化酶對反應(yīng)底物具有高特異性和高親和力，反應(yīng)條件溫和，催化效率高，在食品、工業(yè)發(fā)酵及醫(yī)藥行業(yè)有廣泛的應(yīng)用。該酶自20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)以來，一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，是潛在的工具酶之一。研究至今，國內(nèi)外對L-谷氨酸氧化酶研究的熱點(diǎn)主要集中在兩方面，一是借助現(xiàn)階段觀察及測定方法研究酶的作用機(jī)制及結(jié)構(gòu)，二是繼續(xù)開發(fā)高產(chǎn)酶活性菌株及研究如何利用酶特性服務(wù)于人生活及工業(yè)應(yīng)用。

1 L-谷氨酸氧化酶的來源

L-氨基酸氧化酶來源豐富，在蛇毒液[3]、許多動物和微生物中均能分離到，微生物來源較為廣泛，但是其產(chǎn)酶能力均不高?，F(xiàn)研究階段，L-谷氨酸氧化酶多是從微生物中分離得到，其中鏈霉菌類產(chǎn)酶能力相比較其他菌種較強(qiáng)，其酶產(chǎn)量達(dá)到6.4 U/mL。L-谷氨酸氧化酶的首次發(fā)現(xiàn)是JURTSHUK和MEMANUS在維涅蘭德固氮菌的膜制備物中發(fā)現(xiàn)的，但是其并不具有底物特異性[4]；真正意義上的首次證實是1983年KAMEI T等[5]在淺紫鏈霉菌（Streptomyces violascens）發(fā)酵液中證實了L-谷氨酸氧化酶的存在，其相對分子質(zhì)量約為60 000，具有黃素蛋白特征的吸收光譜，不需要外源性輔助因子參與，但其專一性不強(qiáng)，對L-谷氨酸、L-谷氨酰胺及L-組氨酸均有作用。

20世紀(jì)90年代中國開始了對L-谷氨酸氧化酶的研究。1991年，徐水清等[6]在從土壤中分離出的放線菌中檢測到了L-谷氨酸氧化酶活性，并研究了其產(chǎn)酶的影響因素。1992年，李青山等[7]對產(chǎn)酶菌株進(jìn)行了選育誘變研究并成功得到一株高產(chǎn)酶菌株，固體發(fā)酵將其酶活提高了近25倍。而后又采用液體發(fā)酵優(yōu)化發(fā)酵條件，酶活達(dá)到1.84 U/mg，相比固態(tài)發(fā)酵酶活提升了1.72倍。

2013年，盧嬋等[8]將來自Streptomycessp.X-119-6的L-谷氨酸氧化酶基因與表達(dá)載體pET28a連接，導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)，L-谷氨酸氧化酶比酶活達(dá)到1.1 U/mg。隨后上3L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，重組菌BL21（DE3）/pET28a-LGOX產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶比酶活達(dá)到1.61 U/mg。近年來，國內(nèi)外科學(xué)家分別從土壤中分離出了能產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶的放線菌、鏈霉菌，完善了該酶發(fā)酵產(chǎn)酶體系，分離得到粗酶液，酶學(xué)性質(zhì)研究表明，能高度專一分解L-谷氨酸生成氨、α-酮戊二酸和過氧化氫。

綜上所述，自然界中產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶的菌株很多，主要篩選到的菌株是放線菌及鏈霉菌。研究顯示鏈霉菌產(chǎn)酶能力較好，更適合應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)?，F(xiàn)階段的研究方向主要是對該酶基因進(jìn)行克隆并進(jìn)行表達(dá)，提高其產(chǎn)酶能力，為更加廣泛地應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

2 L-谷氨酸氧化酶的應(yīng)用

2.1 在生物傳感器上的應(yīng)用

L-谷氨酸在醫(yī)藥、食品添加劑、營養(yǎng)強(qiáng)化劑等領(lǐng)域具有十分廣泛的作用[9]，但是其人均日允許攝入量不超6 g/d，食用過量L-谷氨酸會出現(xiàn)十分明顯的中毒癥狀，表現(xiàn)在頭痛、眩暈及臉部大量出汗[10]等。因此對于食品及臨床樣品中L-谷氨酸含量的檢測是十分重要且必要的。L-谷氨酸常用的傳統(tǒng)檢測方法有電位滴定、華勃氏呼吸測定法和色譜分析[11]等，這些方法耗時耗力還需要高端精密設(shè)備[12]。因此考慮應(yīng)用生物傳感器來檢測L-谷氨酸[13-14]，生物傳感器具有快速、靈敏度高、設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)。

測定L-谷氨酸的生物傳感器常采用L-谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫羧酶及谷氨酸脫氫酶作為酶膜[15]。L-谷氨酸氧化酶具有高度底物特異性，且不存在可逆反應(yīng)等其他兩種酶不具有的優(yōu)勢，因此廣泛應(yīng)用于生物傳感器[16]，用于測定食品及臨床樣品中L-谷氨酸的含量及其偶聯(lián)反應(yīng)。

1989年WOLLENBERGER U等[17]打開了L-谷氨酸氧化酶在生物傳感器上的應(yīng)用開端，將L-谷氨酸氧化酶固定到過氧化氫電極上，該電極能穩(wěn)定使用10 d以上并測定超過500個樣品中0～0.14 g/L范圍內(nèi)的谷氨酸，測定時間僅為2 min。

1993年國內(nèi)開始了對L-谷氨酸氧化酶生物傳感器的研究，楊慶玲等[18]制成擴(kuò)散控制型電極，并且應(yīng)用該電極制備了流動注射分析系統(tǒng)，其方法是將L-谷氨酸氧化酶酶膜與過氧化氫探頭復(fù)合。將L-谷氨酸準(zhǔn)確測定范圍增大到1.0 g/L，響應(yīng)時間縮短20 s。2013年，懷紅霞等[19]將L-谷氨酸氧化酶與納米金材料固定到一起，納米金材料具有表面自由能高、比表面積高等特性，極大地提高了測量精度，使其能準(zhǔn)確測定0.2～2.0 g/L的谷氨酸含量。

谷氨酸生物傳感器最初的研究集中在酶電極的制作。盡管十幾年來人們不斷改進(jìn)固定工藝及應(yīng)用新的材料，但由于酶的穩(wěn)定性差及提取困難等弱點(diǎn)，其應(yīng)用受到了極大的限制。隨著微生物固定化技術(shù)的不斷進(jìn)步，以微生物活體為探測元的微生物電極應(yīng)運(yùn)而生，是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。

2.2 在測定轉(zhuǎn)氨酶活性上的應(yīng)用

臨床醫(yī)學(xué)上檢驗肝功能的重要指標(biāo)是肝臟細(xì)胞中谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）與谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的含量，作用反應(yīng)方程式[20]為：

檢測其含量與活性的常規(guī)方法是丙酮酸氧化酶法[21]和賴氏法[22]。L-谷氨酸氧化酶對L-谷氨酸具有高度底物特異性，而谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）與谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）與底物反應(yīng)會產(chǎn)生L-谷氨酸，因此將兩個反應(yīng)偶聯(lián)用于測定谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）與谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的活性與含量。

李青山等[23-24]利用L-谷氨酸氧化酶粗制品研究創(chuàng)立了利用分光光度計測定谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）與谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的方法。比色法測得谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）與谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的活性，顯色反應(yīng)為Trinder反應(yīng)[25]，即H2O2與4-氨基安替吡啉偶聯(lián)苯酚在過氧化物酶的催化下生成紅色化合物。1995年，馮德榮等[26]研究并制作了測定轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，將固定的L-谷氨酸氧化酶和過氧化氫電極結(jié)合，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）酶活力在4～106 U/L、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）酶活力在21～129 U/L范圍內(nèi)該裝置具有較好的精確性。

2.3 在測定肌酐上的應(yīng)用

血肌酐的含量是臨床用于檢測腎功能的參數(shù)之一。肌氨酸氧化酶法[27]和堿性苦味酸法[28]常用于測定肌酐的含量，測定反應(yīng)方程式為：

1993年，RUI C S等[29]利用L-谷氨酸氧化酶創(chuàng)立了流動注射系統(tǒng)測定血肌酐的含量。其特色性的采用雙通路測定來避免血液中內(nèi)源性谷氨酸和氨對測定的影響。第一響應(yīng)為內(nèi)源性氨谷氨酸和肌酸酐的總和響應(yīng)；第二響應(yīng)為內(nèi)源性氨和谷氨酸的響應(yīng)，其測量范圍分別達(dá)到為2 mmol/L和3 mmol/L。該系統(tǒng)具備良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，與化學(xué)方法獲得的化驗結(jié)果中肌酐的含量呈良好的相關(guān)性。

3 L-谷氨酸氧化酶的克隆表達(dá)及酶分離純化研究

L-谷氨酸氧化酶的發(fā)酵生產(chǎn)受到很多因素的影響，其中最大的影響因素是至今為止所篩選到的菌株產(chǎn)酶能力不強(qiáng)，其次就是發(fā)酵條件及分離純化技術(shù)的影響。

3.1 L-谷氨酸氧化酶的克隆表達(dá)

L-谷氨酸氧化酶距工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)還有很大的距離，很大程度上限制了其應(yīng)用。因此需要進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶能力，充分發(fā)揮菌株的生產(chǎn)能力，顯著提高發(fā)酵產(chǎn)量。

L-谷氨酸氧化酶研究至今，國內(nèi)外所見報道中L-谷氨酸氧化酶產(chǎn)酶能力均不強(qiáng)，極大的限制了其應(yīng)用，因此采用基因工程的方法構(gòu)建工程菌來提高產(chǎn)酶能力是十分重要且常見的手段。2001年，CHEN C Y等[30]對灰色鏈霉菌（Streptomyces platensis）NTU3304的L-谷氨酸氧化酶基因進(jìn)行了克隆研究，他們將產(chǎn)酶基因克隆重組在變鉛青鏈霉菌中。研究結(jié)果顯示，該產(chǎn)酶基因全長2 130 bp，由710個密碼子組成，前體分子質(zhì)量大小為78 ku，成熟后分子質(zhì)量大小為76 ku，由三個亞基組成。

2013年，盧嬋等[31]將Streptomycessp.X-119-6的L-谷氨酸氧化酶基因克隆重組，并在原核表達(dá)載體大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)。研究結(jié)果顯示L-谷氨酸氧化酶比酶活達(dá)到1.1U/mg；而后又進(jìn)行了3L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶研究，結(jié)果顯示重組產(chǎn)酶菌產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶比酶活達(dá)到1.61U/mg。

目前，美國Sigma公司已利用基因工程技術(shù)，以大腸桿菌為宿主菌構(gòu)建了產(chǎn)酶工程菌，極大提高了產(chǎn)酶能力和穩(wěn)定性，并將其應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)，為其進(jìn)一步研究應(yīng)用創(chuàng)造了條件。

3.2 L-谷氨酸氧化酶的分離純化研究

最近幾十年，L-谷氨酸氧化酶因為其實用性收到了廣泛的關(guān)注，但至今商業(yè)化用酶國內(nèi)仍沒有實現(xiàn)量產(chǎn)，主要依靠國外進(jìn)口，價格昂貴，主要原因是酶的分離純化困難，極大限制了應(yīng)用。目前，L-谷氨酸氧化酶的主要分離純化方法仍是一些常規(guī)柱層析方法，常見的包括離子交換層析、高壓液相層析、親和層析、凝膠過濾層析等。

KAMEI T等[32]最早開始了對L-谷氨酸氧化酶純化的研究，他們將粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀透析后，經(jīng)過L-谷氨酸氧化酶-瓊脂糖凝膠6B層析柱、L-谷氨酰胺-瓊脂糖凝膠6B層析柱、羥基磷灰石柱，葡萄糖G-100層析柱純化后獲得純化酶。純化后比酶活達(dá)到60.3 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)914倍，回收率為27.5%。

SUKHACHEVA M V等[33]先將粗酶液經(jīng)過硫酸銨沉淀，而后經(jīng)過用DEAE纖維素柱和葡聚糖凝膠G-25凝膠過濾獲得純化酶，純化后酶液比酶活達(dá)到50.8 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)907倍。徐水清[34]將0.041 4 U/mg的粗酶液經(jīng)過硫酸銨沉淀，DEAE纖維素柱，葡聚糖凝膠G-25處理后，酶活達(dá)到4.11 U/mg，純化倍數(shù)為99倍。他們所使用的分離純化方法和SUKHACHEVA M V等[33]相同。沈群[35]采用的分離純化方法更為方便，但是其純化效果不是特別理想，其將L-谷氨酸氧化酶粗酶液經(jīng)過硫酸銨沉淀后直接用聚丙烯酰胺葡聚糖S-200-HR分子篩過濾。結(jié)果顯示，粗酶液比酶活為0.009 5 U/mg，經(jīng)純化后，獲得酶活為0.087 U/mg的酶液，純化倍數(shù)為9.2倍，回收率為2.7%。李玲等[36]利用華美鏈霉菌（Streptomycessplendeds）4.66發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶，而后對酶進(jìn)行了分離純化研究。其采用的方法更為完善，首先將粗酶液進(jìn)行高速冷凍離心，后進(jìn)行硫酸銨分級沉淀，而后用SephadxG-25進(jìn)行脫鹽，然后進(jìn)行MonoQ離子交換、SuperdexG-200凝膠層析及冷凍干燥等步驟得到純化的L-谷氨酸氧化酶。純化后的L-谷氨酸氧化酶比酶活為176U/mg，純化倍數(shù)為926倍，回收率為12.95%。盧嬋等[31]將粗酶液經(jīng)過高速離心后進(jìn)過硫酸銨沉淀，HisTrapTMFF親和層析后獲得單一的L-谷氨酸氧化酶蛋白條帶，純化后L-谷氨酸氧化酶比酶活為2.1 U/mg，蛋白純化倍數(shù)為1.9倍。

4 前景與展望

21世紀(jì)注定是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展的時代，酶制劑作為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的中流砥柱發(fā)展十分迅速。究其原因，其應(yīng)用范圍十分廣泛，在食品、造紙、醫(yī)藥、臨床醫(yī)學(xué)、工業(yè)發(fā)酵等行業(yè)均有十分重要的作用。近幾十年許多工業(yè)生產(chǎn)工藝的革新，對酶制劑的需求提高導(dǎo)致我國酶制劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展更為迅猛，每年酶制劑產(chǎn)量達(dá)上百萬噸，經(jīng)濟(jì)產(chǎn)值巨大。

L-谷氨酸氧化酶作為一種較新的實用工具酶，目前國內(nèi)仍未能實現(xiàn)酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)；另外其作用機(jī)制及蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)罕見報道。希望在不久的將來，隨著生物技術(shù)及分子生物技術(shù)的進(jìn)步，研究者們能夠闡明其作用機(jī)理，構(gòu)建出更適用于工業(yè)生產(chǎn)的工程菌，使其能夠得到更加廣泛的應(yīng)用，造福于人類的生產(chǎn)與生活。

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Research progress on L-glutamate oxidase

YU Shuang1,2,CHI Naiyu1,2,ZHANG Qingfang1,2*
(1.School of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,China;2.Liaoning Technology of Marine Microbiological Engineering Research Center,Dalian 116622,China)

L-glutamate oxidase is a potentially useful tool enzyme,and it is a flavoprotein with FAD as coenzyme.Using L-glutamate as substrate,L-glutamate oxidase catalyzes L-glutamic acid into hydrogen peroxide,ammonia and α-ketoglutaric acid with high substrate specificity.In this overview,the L-glutamate oxidase sources,application,cloning and expression,isolation and purification were summarized,and the research prospects of the L-glutamate oxidase were proposed.

L-glutamate;source;application;cloning and expression;purification;research prospects

Q554

0254-5071（2017）10-0009-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.003

2017-03-04

遼寧省教育廳高等教育內(nèi)涵發(fā)展專項資金項目；遼寧省教育廳生物工程培養(yǎng)模式改革專業(yè)項目（GM201418）

于 爽（1986-），女，實驗師，碩士，研究方向為微生物與酶工程。

*通訊作者：張慶芳（1965-），女，教授，博士，研究方向為微生物與酶工程。