生物素化微細(xì)纖維肽修飾IGF—1對心肌梗死兔肌球蛋白基因表達(dá)的影響

胡云華+張明+梅志亮

[摘要]目的 研究生物素化微細(xì)纖維肽修飾IGF-1對心肌梗死兔肌球蛋白基因表達(dá)的影響。方法 將28只健康的雄性新西蘭白兔隨機(jī)分為對照組、實驗組1、實驗組2、實驗組3，每組7只。對照組開胸但不進(jìn)行冠狀動脈左前降支結(jié)扎，實驗組1、2、3建立兔心肌梗死模型。建模成功后，實驗組1注射生物素化微細(xì)纖維肽修飾的IGF-1，實驗組2注射未修飾的IGF-1，對照組（未結(jié)扎）與實驗組3（心肌梗死）注射同等劑量的生理鹽水。術(shù)后8周，測定心肌肌球蛋白基因表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，實驗組3心肌肌球蛋白基因的表達(dá)水平顯著降低，實驗組1、2心肌肌球蛋白基因的表達(dá)水平顯著提高（P<0.05），但實驗組1的心肌肌球蛋白基因表達(dá)水平又顯著高于實驗組2（P<0.05）。結(jié)論 急性心肌梗死會減弱兔心肌肌球蛋白的基因表達(dá)，IGF-1和生物素化微細(xì)纖維肽修飾IGF-1均能改善心肌梗死兔肌球蛋白的表達(dá)，但經(jīng)過生物素化微細(xì)纖維肽修飾的IGF-1比單純IGF-1的效果更優(yōu)。

[關(guān)鍵詞]生物素化微細(xì)纖維肽修飾IGF-1；心肌梗死；肌球蛋白；基因表達(dá)

[中圖分類號] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）10（a）-0033-03

[Abstract]Objective To study the influence of biotinylated microfibrinopeptide modified IGF-1 on myosin gene expression in rabbits with myocardial infarction.Methods A total of 28 healthy male New Zealand white rabbits were randomly divided into the control group，experimental group 1，experimental group 2，and experimental group 3，and there were 7 ones in each group.In the control group，rabbits were performed with thoracotomy but without ligation of left anterior descending branch of coronary artery.For experimental group 1，2，and 3，model of myocardial infarction in rabbits was established.After successful modeling，biotinylated microfibrinopeptide modified IGF-1 was injected in the experimental group 1.In the experimental group 2，biotinylated microfibrinopeptide IGF-1 without modification was injected.In the experimental group 3 （myocardial infarction） and control group （without ligation），the same dose of normal saline was injected.The gene expression of myosin was determined 8 weeks after surgery.Results Compared with the control group，theexpression level of myosingene in the experimental group 3 was significantly decreased，but in the experimental group 1 and 2，the gene expression level were greatly increased （P<0.05）.The expression level of myosin gene in the experimental group 1 was significantly higher than that in the experimental group 2.Conclusion Acute myocardial infarction will attenuate the gene expression of myosin in rabitts.Both IGF-1 and biotinylated microfibrinopeptide modified IGF-1 can improve gene expression of myosin in rabbits with myocardial infarction，but the effect is better in the latter.

[Key words]Biotinylated microfibrinopeptide modified IGF-1；Myocasrdial infarction；Myosin；Gene expression

近年來，急性心肌梗死的發(fā)病率和死亡率日漸提高，甚至已經(jīng)超過腫瘤性疾病躍居第一，目前主要治療方式有藥物、介入和冠脈搭橋手術(shù)以及心臟移植手術(shù)，雖然能有效地干預(yù)心血管系統(tǒng)的血運狀態(tài)，但僅是通過縮小心肌梗死的范圍，恢復(fù)缺血心肌的供血，延緩左室重構(gòu)改善預(yù)后[1]，對疾病的轉(zhuǎn)歸意義不大，因此迫切需要建立其他有效的療法。胰島素生長因子（IGF-1）是重要的心源性激素，參與整個動脈粥樣硬化（AS）形成的過程，對急性心肌梗死的發(fā)展有重大的臨床意義[2]。本實驗采用MichmeIE.Davis所設(shè)計的自我組裝的微細(xì)纖維肽來延長IGF-1的生理活性，比較其與單純IGF對心肌梗死兔肌球蛋白基因表達(dá)的影響，為其在臨床上治療急性心肌梗死提供理論依據(jù)。endprint

1材料與方法

1.1 材料

健康的雄性新西蘭白兔28只，體重2.5～3.5 kg（本院動物實驗室提供），心電圖機(jī)（Kohden 92C），DH150型動物呼吸機(jī)（常州德社精密儀器有限公司）， 戊巴比妥鈉（北京普博斯生物），青霉素（華北制藥股份有限公司），RT PCR引物（北京華大中生科技發(fā)展有限公司）；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（日本takara），免疫組化abc試劑盒（武漢博士德公司），瓊脂糖（美國promega）PE480熱循環(huán)儀（廣州立諾自動化設(shè)備有限公司），Pharma-cia LKB UltroScan XL 掃描儀（美國LKB公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立心肌梗死模型

28只健康的雄性新西蘭白兔，隨機(jī)分為對照組、實驗組1、實驗組2、實驗組3，每組7只，對照組開胸后用5-0絲線在左冠狀動脈前降支根部下方5 mm處穿過，但不進(jìn)行結(jié)扎，實驗組1、2、3建立心肌梗死模型。所有白兔術(shù)前6～8 h禁飲食，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1 ml/kg）進(jìn)行麻醉，麻醉后將兔仰臥固定在手術(shù)臺，胸前區(qū)及上腹部備皮，保持自主呼吸，碘伏消毒，鋪巾。從胸骨正中剪開胸骨至頸靜脈，暴露縱隔和心臟，將心包固定于胸骨，縱行剪開心包，用棉簽慢慢抬起心臟，游離第1、2對角支之間的左冠狀動脈前降支，用5-0絲線在左冠狀動脈前降支根部下方5 mm處結(jié)扎[3-6]。術(shù)中靜脈滴注 50 g/L葡萄糖生理鹽水加利多卡因 30 mg/（kg·h），防止發(fā)生室顫。手術(shù)完成后耳緣靜脈注射給予青霉素80 0000 U，防止發(fā)生感染，術(shù)后6～8 h記錄V1-6的導(dǎo)聯(lián)心電圖，21只大白兔有ST段抬高明確[7]，表明其心肌梗死模型建立成功，手術(shù)后2 d開始進(jìn)食，正常飼養(yǎng)。

1.2.2 梗死后注射IGF-1

建模 3 d后開胸，用微量注射器分4點在梗死心肌周圍進(jìn)行IGF-1植入，實驗組1給予生物素化微細(xì)纖維肽修飾的IGF-1 80BPS（200 ng/ml IGF-1），實驗組2給予未修飾的IGF-1 80BPS（200 ng/ml IGF-1），對照組和實驗組3均給予同等劑量的生理鹽水。關(guān)胸，經(jīng)耳緣靜脈給予青霉素 80 0000 U防止感染，送回籠中正常飼養(yǎng)。

1.2.3 肌球蛋白基因表達(dá)的測定

1.2.3.1 總RNA的提取 采用異硫氫酸胍一步法[8]。

1.2.3.2 反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng) 肌球蛋白上游引物序列：5′GCA GAC CAT CAA GGA CCT 3'；下游引物序列：5′GTT GGC CTG TTC CTC CGC 3′，提取心肌組織總RNA，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，向得到的總RNA中加入15 μl RT液，加入1 μl AMV，混勻，42℃保溫30 min。取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物置500 μl 薄壁管中，加入20 μl PCR液及80 ng上下游肌球蛋白引物，再加入1 μl Taq 酶及適量石蠟油。94℃，45 s，55℃，45 s，72℃，1 min，在PE480熱循環(huán)儀上進(jìn)行35個循環(huán)。取15 μl產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果用Pharma-cia LKB UltroScan XL掃描儀作光密度掃描[7-8]。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 11.0分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

肌球蛋白基因表達(dá)結(jié)果：對照組為（0.79619±0.11147），實驗組1為（1.34612±0.21981），實驗組2為（1.11578±0.22063），實驗組3為（0.63714±0.22063）。與對照組比較，實驗組3的肌球蛋白基因表達(dá)顯著降低，說明急性心肌梗死會導(dǎo)致心肌細(xì)胞中肌球蛋白表達(dá)顯著降低；實驗組1、實驗組2肌球蛋白基因表達(dá)水平顯著提高（P<0.05），說明IGF-1和生物素化的微細(xì)纖維肽修飾的IGF-1均可改善心肌梗死后肌球蛋白的基因表達(dá)，但實驗組1的肌球蛋白基因表達(dá)水平又顯著高于實驗組2，說明生物素化的微細(xì)纖維肽修飾的IGF-1治療效果優(yōu)于單純IGF-1。

3 討論

IGF-1是一個非常有效的心肌增長和存活因子，存在于人體的許多器官，能促進(jìn)梗死心肌的血管生成[9]，減輕心肌壞死程度，維持心肌結(jié)構(gòu)，刺激心臟纖維細(xì)胞的增生及纖維粘連蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，從而阻止心室過度擴(kuò)張[10-13]。但是IGF-1是一種微量蛋白，容易彌散通過組織，使其作用信號過遠(yuǎn)而不能持續(xù)表達(dá)[14-15]，為了使IGF-1 在局部微環(huán)境能達(dá)到穩(wěn)態(tài)以發(fā)揮最大作用，本實驗采用MichmeIE.Davis所設(shè)計的自我組裝的微細(xì)纖維肽來延長IGF-1的作用，自我組裝肽是一種寡肽，由交替的親水性和疏水性的氨基酸組成，在生理性滲透壓和pH值環(huán)境下可以迅速組裝成極小的微細(xì)纖維結(jié)構(gòu)，注射到心肌中會形成3D的細(xì)胞微孔環(huán)境。通過生物素化微細(xì)纖維肽的修飾使IGF-1處于穩(wěn)態(tài)，在特定的局部微環(huán)境中發(fā)揮持久的作用，從而增強(qiáng)肌球蛋白的表達(dá)。肌球蛋白活性是決定心肌收縮力大小的一個至關(guān)重要的因素，當(dāng)肌球蛋白活性降低，心肌收縮時對ATP的水解作用減弱，會造成心肌收縮速度減慢，心肌收縮力降低。實驗結(jié)果表明生物素化微細(xì)纖維肽修飾的IGF-1較單純IGF-1對改善心肌梗死心肌細(xì)胞的活性效果更優(yōu)，這不但優(yōu)化了IGF-1作用不能持久的缺陷，又增強(qiáng)了IGF-1具備的生物活性，為其以后在臨床的應(yīng)用提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2017-07-14 本文編輯：許俊琴）endprint