參慈膠囊聯(lián)合順鉑對(duì)A549/DDP肺腺癌組織MDR1、MRP1、LRP表達(dá)的影響

于禮建　徐立群　李志陽　鄔曉東　梁昆　韋伊兒　鄒瑩

【摘要】 目的：探討參慈膠囊對(duì)人肺腺癌A549/DDP裸鼠體內(nèi)多藥耐藥相關(guān)基因的影響。方法：將50只C57BL/6小鼠接種人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP細(xì)胞懸液建立實(shí)體瘤模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、參慈膠囊組、參慈膠囊+順鉑組、順鉑組，各10只。對(duì)照組予等量生理鹽水，其余各組荷瘤小鼠均用藥21 d，斷頸處死取腫瘤組織，采用FQ-PCR技術(shù)檢測人肺腺癌A549/DDP肺癌組織MDR1、MRP1、LRP mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果：MDR1 mRNA、MRP1 mRNA、LRP1 mRNA在各組均有表達(dá)，各治療組的MDR1 mRNA、MRP1 mRNA、LRP1 mRNA均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；參慈膠囊+順鉑組的MDR1 mRNA、MRP1 mRNA、LRP1 mRNA的表達(dá)均明顯低于參慈膠囊組和順鉑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：通過降低MDR1、MRP1、LRP多藥耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，可能是參慈膠囊逆轉(zhuǎn)人肺腺癌A549/DDP裸鼠體內(nèi)多藥耐藥的作用機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】 肺癌； 參慈膠囊； 順鉑； 多藥耐藥基因1； 人多藥耐藥相關(guān)蛋白1； 肺耐藥相關(guān)蛋白

The Effect of Shenci Capsule Combined with Cisplatin on the Expression of MDR1，MRP1 and LRP in A549/DDP Lung Adenocarcinoma Tissues/YU Li-jian，XU Li-qun，LI Zhi-yang，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（24）：001-004

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Shenci Capsule on human lung adenocarcinoma A549/DDP nude mice multidrug-resistant genes in the body.Method：50 C57BL/6 mice were injected with human lung adenocarcinoma DDP-resistant cell sublines A549/DDP cell suspension to establish solid tumor models and randomly divided into control group，Shenci Capsule group，Shenci Capsule + Cisplatin group，and Cisplatin group，10 mice in each group.The control group was treated with the same amount of normal saline，each group of the rest with tumor-burdened mice were treated with drugs.After 21 d all mice were sacrificed by broken neck and transplanted tumor tissues were cut off，the expression of MDR1，MRP and LRP mRNA in human lung adenocarcinoma A549/DDP tissue were detected by the FQ-PCR technique.Result：MDR1 mRNA，MRP1 mRNA，LRP1 mRNA were expressed in all groups，the levels of MDR1 mRNA，MRP1 mRNA，LRP1 mRNA in the treatment groups were lower than those in the control group，the differences were statistically significant（P<0.01）；the expression of MDR1 mRNA，MRP1 mRNA，LRP1 mRNA in Shenci Capsule + Cisplatin group was lower than those in Shenci Capsule group and Cisplatin group，the differences were statistically significant（P<0.01）.Conclusion：By reducing the MDR1，MRP1 and LRP multi-resistant genes expression，which may is one of the mechanism of action Shenci Capsule reverse human lung adenocarcinoma DDP-resistant cell sublines A549/DDP nude mice multidrug-resistance in the body.

【Key words】 Lung cancer； Shenci Capsule； Cisplatin； Multi-drug resistance 1； Multidrug resistance-associated protein 1； Lung resistance-related protein

First-authors address：Affiliated Cancer Hospital & Institute of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510095，Chinaendprint

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.24.001

化療在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的治療手段中占據(jù)重要地位，但腫瘤多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是臨床化療失敗最常見和最難克服的問題之一，亦是復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因，由多種機(jī)制參與，尋找逆轉(zhuǎn)化療耐藥的潛在策略已成為肺癌防治的熱點(diǎn)[1-2]。參慈膠囊由名方“仙魚湯”化裁而來，對(duì)NSCLC具有較好的療效，配合化療具有減毒增效的作用[3]。文獻(xiàn)[4]研究顯示，參慈膠囊聯(lián)合順鉑能夠通過調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，改善人肺腺癌A549/DDP裸鼠體內(nèi)順鉑耐藥狀態(tài)。但多藥耐藥相關(guān)基因是否參與這一過程，目前尚缺乏實(shí)驗(yàn)研究。本項(xiàng)目根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，探討參慈膠囊聯(lián)合順鉑對(duì)多藥耐藥基因1（multi-drug resistance 1，MDR1）、人多藥耐藥相關(guān)蛋白1（Multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）、肺耐藥相關(guān)蛋白（lung resistance-related protein，LRP）表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 （1）參慈膠囊組成：黨參25 g、山慈菇10 g、仙鶴草15 g、貓爪草30 g、魚腥草30 g、山海螺30 g、田七片10 g、浙貝15 g、守宮5 g、天冬15 g、炙甘草5 g。由廣州一方制藥集團(tuán)提供免煎顆粒，經(jīng)濃煎、水提，乙醇沉淀，并進(jìn)一步濃縮而成。（2）順鉑（DDP）（批號(hào)：151102）江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，由本院藥房提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)4～6周齡BALB/c裸鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為No：44007200010919。

1.3 細(xì)胞來源 人肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 主要試劑和儀器 胰蛋白酶（美國Sigma公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒及Trizol（TakaRa公司），PCR擴(kuò)增儀（美國AB公司產(chǎn)品）。

1.5 引物設(shè)計(jì) 引物序列根據(jù)Genebank人類各目的基因cDNA序列，由廣州華銀醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司合成。MDR1：上游引物：TTGGCTGACTTTGCGAAGGA，下游引物：GCAGCGAGAGTTCCCAGAAT，擴(kuò)增片段大小217 bp。MRP1：上游引物：ACTGTGCTCACGATTGCTCA，下游引物：CGTAGGTTTCCAGGGTTGCT，擴(kuò)增片段大小242 bp。LRP：上游引物：GCTTCAGCCTGGGAAGTGAT，下游引物：AGCGCGTGGATTCATAAGGT，擴(kuò)增片段大小422 bp。β-actin：上游引物：CTTCCTTCTTGGGTATGGAATCC，下游引物：GGAGCAATGATCTTGATCTTCATG，擴(kuò)增片段大小205 bp。

1.6 造模 根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]在無菌條件下取下荷瘤裸鼠瘤塊，切成約1 mm3通過穿刺針刺入裸鼠的右前腋下，進(jìn)行造模。

1.7 分組與處理 根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]接種人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP瘤塊7 d后除去未生成瘤塊和瘤塊過大的裸鼠，隨即分成四組（對(duì)照組、參慈膠囊組、順鉑組、參慈膠囊+順鉑組），每組10只。藥物濃度根據(jù)小鼠公斤體重?fù)Q算法，其中對(duì)照組予以0.2 mL生理鹽水灌胃，參慈膠囊組予參慈膠囊藥液0.2 mL（110 g/kg）灌胃，順鉑組單純予順鉑0.02 mg/（20 g·d）腹腔注射，參慈膠囊+順鉑組以參慈膠囊藥液0.2 mL（110 g/kg）灌胃，同時(shí)予順鉑0.02 mg/（20 g·d），腹腔注射。各組連續(xù)用藥并觀察5周后脫頸處死，分離腫瘤組織，并行病理鑒定。

1.8 檢測方法 用熒光定量PCR（FQ-PCR）技術(shù)檢測MDR1、MRP1、LRPmRNA的表達(dá)情況。A549/DDP肺癌組織100 mg勻漿后加入Trizol試劑提取總RNA。使用PE7000全自動(dòng)熒光定量PCR儀進(jìn)行目的基因檢測，計(jì)算每1 μL cDNA所含的基因的拷貝數(shù)與1 μL cDNA所含β-actin的拷貝數(shù)的比值，進(jìn)行半定量比較。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

MDR1 mRNA、MRP1 mRNA、LRP1 mRNA在各組均有表達(dá)，各治療組的MDR1 mRNA、MRP1 mRNA、LRP1 mRNA均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；參慈膠囊+順鉑組的MDR1 mRNA、MRP1 mRNA、LRP1 mRNA的表達(dá)均明顯低于參慈膠囊組和順鉑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3 討論

肺癌發(fā)病率和死亡率居全球惡性腫瘤首位，雖然近20年來隨著分子靶向藥物的迅速發(fā)展，肺癌患者從以前的平均生存期由只有7個(gè)月左右，提高到2～3年，部分甚至是10年。但最終還是會(huì)出現(xiàn)耐藥，使得腫瘤復(fù)發(fā)、進(jìn)展，其5年生存率仍未見顯著提高，約為15%[6-7]。其療效卻已達(dá)“平臺(tái)期”，究其原因，肺癌細(xì)胞的多藥耐藥（MDR）不容忽視，尋找肺癌化療耐藥逆轉(zhuǎn)劑，逆轉(zhuǎn)MDR是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。中藥活性廣泛而顯著，高效小毒，多靶點(diǎn)逆轉(zhuǎn)MDR，臨床藥效逐步得到肯定，但明確的逆轉(zhuǎn)機(jī)制尚待研究[8]。

MDR耐藥的原因涉及腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)障礙，藥物在細(xì)胞內(nèi)代謝增加，腫瘤細(xì)胞修復(fù)增強(qiáng)，藥物的作用靶點(diǎn)改變等復(fù)雜過程[9-10]。很多研究發(fā)現(xiàn)，MDR是由多種耐藥蛋白共同組成參與，并有多種耐藥相關(guān)蛋白一起參與的[11]。目前研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致肺癌多藥耐藥的基因有10余種，研究較多、較深入的有MDR1、MRP1、LRP等，其通過藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的改變，使化療藥物外排增加，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降，化療藥物難以發(fā)揮效果，與腫瘤多藥耐藥的發(fā)生有關(guān)。這些耐藥基因在非小細(xì)胞肺癌多藥耐藥中可單一發(fā)生作用，同時(shí)它們之間又有一定的相關(guān)性。endprint

MDR-1和其編碼的膜糖蛋白（P-gp）在腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥的主要原因之一，同時(shí)MDR-1與P-gp也是目前研究最廣泛最深的耐藥機(jī)制之一。當(dāng)MDR1在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，使位于細(xì)胞膜上的P-gp合成增加，P-gp作為一種能量依賴性“藥物泵”，可將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞外，許多化療藥物在細(xì)胞內(nèi)有效濃度下降，削弱其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用而導(dǎo)致耐藥的發(fā)生[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參慈膠囊+順鉑組較其他各組能夠明顯降低MDR1 mRNA的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。因此，參慈膠囊通過抑制MDR1的表達(dá)，增加順鉑在細(xì)胞內(nèi)蓄積，從而逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥。

MRP是定位于16號(hào)染色體P13.1，編碼一種分子量為190 kD的糖蛋白，即MRP蛋白，其導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的原理是將藥物分離成細(xì)胞內(nèi)的隔離小體，或者把細(xì)胞毒物直接排除于細(xì)胞外，從而使細(xì)胞的靶位點(diǎn)不能與藥物直接結(jié)合[14]。在肺癌中MRP表達(dá)最高的是腺癌，其次是鱗癌，小細(xì)胞肺癌的表達(dá)要低于非小細(xì)胞肺癌，與P-gp不同的是，腺癌中MRP的高水平表達(dá)多在低分化的類型中[15]。其中MRP1是研究較多的一種多藥耐藥基因。MRP1在人體組織中的表達(dá)差異性較大，在肺組織中表達(dá)最高，MRP1與肺癌多耐藥性的關(guān)系更為密切。MRP1可作為細(xì)胞膜上藥物輸出泵，可將化療藥物逆濃度外排，使化療藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度明顯下降，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥[16-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參慈膠囊+順鉑組較其他各組能夠明顯降低MRP1 mRNA的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。因此，參慈膠囊通過抑制MRP1的表達(dá)，增加順鉑在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度從而逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥。

LRP位于16號(hào)染色體P13.1～P11.2，編碼的肺癌耐藥性相關(guān)蛋白即LRP蛋白含896個(gè)氨基酸，分子量為110 kD，主要作用是清除外源性毒性物質(zhì)，使機(jī)體免受損害。LRP的過度表達(dá)與惡性腫瘤的耐藥發(fā)生有關(guān)，它是化療敏感性和生存的獨(dú)立預(yù)后因素，可以使細(xì)胞核為靶點(diǎn)的藥物不能通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，有些藥物即使進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)也會(huì)很快被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中并使細(xì)胞質(zhì)中藥物進(jìn)入運(yùn)輸囊泡，最終通過胞吐機(jī)制排到細(xì)胞外[18-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參慈膠囊+順鉑組較其他各組能夠明顯降低LRP mRNA的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。因此，參慈膠囊通過抑制LRP的表達(dá)，進(jìn)而抑制胞吐機(jī)制，增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥。

綜上所述，多藥耐藥相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)，是導(dǎo)致順鉑耐藥的重要原因，參慈膠囊通過影響多藥耐藥相關(guān)基因，通過抑制MDR1、MRP1、LRP基因的表達(dá)，以逆轉(zhuǎn)人肺腺癌A549/DDP裸鼠體內(nèi)鉑類耐藥的狀態(tài)，可能是參慈膠囊逆轉(zhuǎn)肺癌鉑類耐藥的作用機(jī)制之一。

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（收稿日期：2017-03-01） （本文編輯：張爽）endprint