普通煙草長葉柄突變性狀的遺傳分析

陳果，吳新儒，屈旭，晁江濤，向小華,3，胡軍華，陳浣，王新，劉貫山，王元英，王紹美

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點實驗室，青島266101；2 青島中煙種子有限責(zé)任公司 青島 266101；3 海南雪茄研究所，海南?？?571000

普通煙草長葉柄突變性狀的遺傳分析

陳果1，吳新儒1，屈旭2，晁江濤1，向小華1,3，胡軍華1，陳浣1，王新1，劉貫山1，王元英1，王紹美1

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點實驗室，青島266101；2 青島中煙種子有限責(zé)任公司 青島 266101；3 海南雪茄研究所，海南?？?571000

葉柄是煙草葉片的重要組成部分，煙草長葉柄性狀遺傳分析可用于研究煙草葉柄和葉片的發(fā)育。利用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變普通煙草烤煙品種中煙100和紅花大金元各獲得一個（極）長葉柄突變體（M48和M50），將兩個突變體分別與各自的野生型中煙100和紅花大金元及普通煙草烤煙品種革新三號雜交獲得F1，F(xiàn)1自交獲得F2群體，F(xiàn)1與其相應(yīng)的野生型親本回交獲得BC1F1群體。對各類型材料進行表型調(diào)查和統(tǒng)計分析結(jié)果顯示：F1均表現(xiàn)為（極）長葉柄突變表型，在F2群體和BC1F1群體中，經(jīng)χ2檢驗，（極）長葉柄突變表型與野生型表型的理論分離比均符合3:1和1:1，表明（極）長葉柄突變性狀由染色體上一對顯性單基因控制。上述結(jié)果為進一步定位和克?。O）長葉柄突變基因，揭示其在煙草葉柄和葉片發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。

普通煙草；EMS誘變；葉柄突變；遺傳分析

葉柄是煙草葉片的重要組成部分，其上端通過維管束與葉片相連，下端通過維管束與莖相連。葉片在發(fā)育過程中所需要的水、激素、營養(yǎng)物質(zhì)等均由葉柄運輸。光照和溫度等環(huán)境因素可調(diào)控葉柄的生長，光信號的調(diào)控和對糖響應(yīng)的調(diào)節(jié)在控制葉片和葉柄的差異形態(tài)建成中起重要作用[1]；菥蓂葉柄發(fā)育隨著光周期的延長而持續(xù)伸長[2]；不同溫度下大豆葉柄伸長都隨光周期增長而增加[3]。內(nèi)外源物質(zhì)可調(diào)控葉柄的生長，葉片生長初期葉柄對外源赤霉素敏感，外源赤霉素3（GA3）的抑制劑抑制菥蓂葉柄的增長[2]；擬南芥向地性生長和葉柄長度的增長與乙烯有關(guān)[4]；草莓葉柄生長受內(nèi)源激素控制[5]。相關(guān)基因也可調(diào)控葉柄的生長，如赤霉素（GA）生物合成基因GA20ox2可增加擬南芥myr1 myr2雙突變體葉柄長度[6]；擬南芥CLAVATA/ESR- RELATED 6（CLE6）基因在GA缺失突變體中異位過表達促進葉柄伸長[7]；花椰菜Or基因通過抑制釋放因子eRF1基因的表達控制葉柄伸長[8]；擬南芥rot3突變體植株的葉柄比野生型短[9]；擬南芥PHYB和ACL2基因只通過單個細胞的長度控制葉柄的長度，而GAI, GA1和ROT3基因似乎同時控制葉柄細胞的伸長和增殖[10]。

與葉柄相關(guān)的研究主要見于擬南芥和花椰菜。普通煙草長葉柄遺傳分析的相關(guān)研究未見報道。本研究用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變普通煙草烤煙品種中煙100[11]和紅花大金元[12]，獲得兩個（極）長葉柄突變體，并對這兩個突變體進行遺傳分析，確定其遺傳類型，為進一步研究煙草葉柄發(fā)育的分子機理、分離和鑒定煙草葉柄發(fā)育相關(guān)基因奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用的兩個（極）長葉柄突變體M48和M50分別來源于普通煙草烤煙品種中煙100（以下簡稱ZY）和紅花大金元（以下簡稱HD）經(jīng)甲基磺酸乙酯（EMS）誘變處理獲得的誘變2代（M2）分離群體。突變體經(jīng)自交后其（極）長葉柄性狀不發(fā)生分離，表明該突變性狀已經(jīng)穩(wěn)定存在，可以用于后續(xù)的遺傳分析。

1.2 雜交組合配制與遺傳群體構(gòu)建

以（極）長葉柄突變體M48和M50的自交第5代為父本，分別與各自的野生型親本ZY和HD，及普通煙草烤煙品種革新三號[13]（以下簡稱G3）雜交獲得F1。F1自交獲得F2群體，F(xiàn)1與其相應(yīng)的野生型親本回交獲得BC1F1群體。

1.3 表型調(diào)查與統(tǒng)計分析

田間種植（極）長葉柄突變體M48和M50，野生型親本ZY、HD和G3，以及相應(yīng)的F1、F2和BC1F1群體，待煙草大田生育期到達團棵期至旺長期，（極）長葉柄性狀發(fā)育完全時，按單株調(diào)查（極）長葉柄性狀與正常野生型性狀的表型分離情況，并歸類統(tǒng)計各表型株數(shù)。用卡方檢驗驗證F2和BC1F1群體性狀的理論分離比。

2 結(jié)果與分析

2.1 （極）長葉柄突變體的表型描述

（極）長葉柄突變體在苗期突變性狀不表現(xiàn)，生長至團棵期才逐漸表現(xiàn)（極）長葉柄性狀，旺長期至開花期（極）長葉柄突變性狀表現(xiàn)最為穩(wěn)定和典型。

（極）長葉柄突變體主要表現(xiàn)為整株葉片均為（極）長葉柄突變性狀表型，突變?nèi)~片是自連接主莖的葉基部起葉耳退化消失，退化消失部位延伸至葉片中部，僅剩主脈與已退化葉耳的葉柄形成一長葉柄性狀，未退化部分仍形成正常葉片，葉片整體表現(xiàn)為與野生型帶葉耳性狀不同的無葉耳畸形葉性狀。圖1為中煙100野生型與其極長葉柄突變體M48的中部葉片比較。從照片中可見，M48突變體的葉柄長度超過葉片總長的2/3，界定為極長葉柄突變性狀。圖2為紅花大金元野生型與其長葉柄突變體M50的中部葉片比較。從照片中可見，M50突變體的葉柄長度超過葉片總長的1/3，界定為長葉柄突變性狀。此外，與其相應(yīng)對照葉片的相同部位比較，（極）長葉柄突變體的葉片有明顯的褶皺。從M48與M50的中部葉片照片看，兩突變體葉柄長度有明顯差異。對突變體M48和M50與其野生型和革新三號雜交F1和F2后代群體及相應(yīng)的BC1F1分離群體的觀察發(fā)現(xiàn)：每個雜交F1表型全部為穩(wěn)定無分離的原（極）長葉柄突變表型；每個（極）長葉柄突變體的F2，BC1F1分離群體只分離出與其原突變體（極）長葉柄表型穩(wěn)定相同的和與分離群體所用野生型有葉耳無葉柄表型穩(wěn)定相同的兩種類型。圖3為長葉柄突變表型的單株照片。

圖1 中煙100和M48的中部葉比較Fig.1 Comparison between Zhongyan 100 and M48 middle leaf

圖2 紅花大金元和M50的中部葉比較Fig.2 Comparison between Honghuadajinyuan and M50 middle leaf

圖3 長葉柄突變單株Fig.3 Mutant plant of long petiole

2.2 （極）長葉柄突變體的遺傳分析

2.2.1 （極）長葉柄突變體與野生型雜交的F1表型觀察

為明確（極）長葉柄突變性狀的遺傳規(guī)律，對M48、M50野生型親本及其相應(yīng)的F1、F2和BC1F1群體進行了表型調(diào)查與統(tǒng)計分析。由表1可知，M48與中煙100和革新三號的F1全部表現(xiàn)為與M48相同的極長葉柄表型；由表2可知，M50與紅花大金元和革新三號的F1全部表現(xiàn)為與M50相同的長葉柄表型。F1表型觀察結(jié)果表明，兩個突變體的（極）長葉柄突變性狀為顯性性狀。

表1 M48及相關(guān)實驗材料的表型統(tǒng)計與分析Tab. 1 Phenotypic statistics and analysis of M48 and related experimental materials

表2 M50及相關(guān)實驗材料的表型統(tǒng)計與分析Tab. 2 Phenotypic statistics and analysis of M50 and related experimental materials

2.2.2 （極）長葉柄突變體與野生型雜交的F2群體表型觀察與統(tǒng)計分析

為明確（極）長葉柄突變性狀受幾個基因控制，對兩個突變體相應(yīng)的F2群體進行了表型調(diào)查與統(tǒng)計分析。由表1可知，M48與中煙100和革新三號的F2分離群體中，極長葉柄突變型表型單株分別為94棵和94棵，而野生型表型單株分別為28棵和32棵，其各自的F2觀測分離比分別為3.36：1和2.94：1，通過 χ2（χ2值 ＜ χ20.05=3.841）檢驗驗證：0.273＜3.841和0.011＜3.841，均符合理論分離比3:1。由表2可知，M50與紅花大金元和革新三號的F2分離群體中，長葉柄突變型表型單株分別為92棵和66棵，野生型表型單株分別為29棵和20棵，其各自的F2觀測分離比分別為 3.17：1和 3.30：1，通過 χ2（χ2值 ＜χ20.05=3.841）檢驗驗證：0.069＜3.841和0.140＜3.841，均符合理論分離比3:1。結(jié)果表明，兩個突變體的（極）長葉柄突變性狀皆由一對顯性基因控制。

2.2.3 （極）長葉柄突變體與野生型雜交后再回交的BC1F1群體表型觀察與統(tǒng)計分析

為進一步驗證兩個（極）長葉柄突變體的突變性狀由一對顯性基因控制，將F1用其相應(yīng)的野生型親本回交獲得的BC1F1群體進行了表型調(diào)查與統(tǒng)計分析。由表1可知，M48與中煙100和革新三號的BC1F1分離群體中，極長葉柄突變型表型單株分別為48棵和47棵，而野生型表型單株分別為46棵和37棵，其各自的BC1F1觀測分離比分別為1.04：1和1.27：1，通過 χ2（χ2值 ＜ χ20.05=3.841）檢驗驗證：0.043＜3.841和1.190＜3.841，均符合理論分離比1:1。由表2可知，M50與紅花大金元和革新三號的BC1F1分離群體中，長葉柄突變型表型單株分別為42棵和47棵，而野生型表型單株分別為48棵和37棵，其各自的BC1F1觀測分離比分別為0.86：1和1.27：1，通過χ2（χ2值 ＜ χ20.05=3.841） 檢 驗 驗 證：0.400＜3.841和1.190＜3.841，均符合理論分離比1:1。結(jié)果進一步表明，兩個突變體的（極）長葉柄突變性狀確實皆由一對顯性基因控制。

3 討論

本研究所用的經(jīng)EMS誘變普通煙草烤煙品種中煙100和紅花大金元獲得的兩個（極）長葉柄突變體的“長葉柄”性狀是可遺傳特性。在自交后代中選擇與突變表型相似的穩(wěn)定自交系是可行的，可以用作遺傳分析。

本研究根據(jù)各類型實驗材料田間表型分離觀測提供的數(shù)據(jù)表明，無論突變基因是純合或者雜合的，分離為（極）長葉柄突變表型的單株都與原突變體表型相同，即突變體的（極）長葉柄性狀，且對于同一個突變體分離的突變表型，表現(xiàn)葉柄長度穩(wěn)定；分離為野生型表型的單株與野生型的有葉耳無葉柄性狀相同。在分離群體中，（極）長葉柄突變表型和野生型的性狀表型不存在連續(xù)的性狀變化，雜交后代可明確分為兩組，兩個性狀可以用孟德爾的分離定律來分析，符合質(zhì)量性狀的定義。因此，這兩個表型相似的（極）長葉柄突變性狀均由染色體上一對顯性單基因控制。

普通煙草葉柄有無以往多數(shù)研究認為主要受兩對累加效應(yīng)的基因決定[12]。有葉柄曬煙品種與無葉柄烤煙品種雜交，F(xiàn)1大多數(shù)表現(xiàn)有葉柄，說明有葉柄為無葉柄的顯性或部分顯性[12]。向日葵羅馬尼亞Fundulea自交系O-7657中發(fā)現(xiàn)的“短葉柄”突變體至少由兩對具有累加效應(yīng)的顯性基因所控制[14]；大豆短葉柄材料NJ90L-1SP和D76-1609與長葉柄材料構(gòu)建9組分離群體，遺傳分析證明兩個短葉柄遺傳材料分別受2對隱性重疊基因控制，且相互不等位，葉柄長度至少受兩兩重疊的四對基因控制，一些組合中只表現(xiàn)單基因的差異[15-16]。本研究所用的兩個（極）長葉柄突變體均來自于普通煙草烤煙品種，對其構(gòu)建分離群體進行遺傳分析的野生型品種也是普通煙草烤煙品種，研究結(jié)果證明兩個（極）長葉柄突變體的突變基因均由顯性單基因控制。

通過遺傳分析，本研究已經(jīng)明確了兩個（極）長葉柄突變體突變性狀的遺傳規(guī)律，但是兩個突變體的葉柄長度存在明顯的差異。造成這種差異的原因可能是兩個（極）長葉柄突變體的遺傳背景不同——分別來自兩個遺傳背景不同的品種中煙100和紅花大金元；也可能是不同基因的不同突變造成的；還可能是同一基因的不同突變造成的，具體原因還需要通過進一步的實驗研究加以證明。本研究尚未對突變表型的發(fā)育過程進行精細觀察及突變?nèi)~柄切片做電鏡觀察，也未對兩個（極）長葉柄突變體做等位測驗，故不清楚M48和M50是否為同一個突變基因。進一步研究將應(yīng)用基因定位與克隆技術(shù)，利用煙草基因組序列已開發(fā)獲得的SSR分子標(biāo)記，對控制該突變性狀的基因進行定位，進而獲得調(diào)控?zé)煵荩O）長葉柄發(fā)育的關(guān)鍵基因。

4 結(jié)論

本研究中（極）長葉柄突變體與其來源的野生型在葉片的表型上有明顯差異，易于分辨，可以簡單有效地進行表型性狀觀測和數(shù)量統(tǒng)計。兩個（極）長葉柄突變體材料分別與野生型親本雜交獲得的F1均為突變體親本的（極）長葉柄表型，說明兩個（極）長葉柄突變性狀均為顯性突變；并且測交試驗表型性狀的觀測結(jié)果分離比符合孟德爾定律1:1的理論分離比也驗證了此結(jié)果；F2分離群體中兩個（極）長葉柄性狀的表型觀測分離比同樣符合孟德爾定律3:1的理論分離比，說明兩個突變體的（極）長葉柄突變基因均由顯性單基因控制。

[1]Kozuka T, Horiguchi G, Kim GT, et al. The different growth responses of the Arabidopsis thaliana leaf blade and the petiole during shade avoidance are regulated by photoreceptors and sugar [J]. Plant and Cell Physiology,2005, 46(1):213-223.

[2]Metzger J D. Gibberellins and light Regulated Petiole Growth in Thlaspi arvense L [J]. Plant Physiology, 1988,86(1):237-240.

[3]Thomas J F, Raper CD Jr. Internode and Petiole elongation of Soybean in response to photoperiod and end-of-day light quality [J]. Bot Gaz, 1985, 146(4):495-500.

[4]Millenaar F F, Cox M C, van Berkel Y E, et al. Ethylene-Induced Differential Growth of Petioles in Arabidopsis.Analyzing Natural Variation, Response Kinetics, and Regulation [J]. Plant Physiology, 2005, 137(3):998-1008.

[5]李燕. 草莓葉柄離體培養(yǎng)內(nèi)源激素變化與植株形態(tài)發(fā)生關(guān)系的研究[D]. 雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士畢業(yè)論文,2004.LI Yan. Studies on the Relation between Morphogenesis and Changes of Endogenous Hormones In Vitro Culture of Strawberry Petiole [D]. Ya'an: Master Thesis of Sichuan Agricultural University, 2004.

[6]ZHAO Chengsong, Hanada A, Yamaguchi S, et al. The Arabidopsis Myb genes MYR1 and MYR2 are redundant negative regulators of fl owering time under decreased light intensity [J]. The Plant Journal. 2011, 66(3):502-515.

[7]Bidadi H, Matsuoka K, Sage-Ono K, et al. CLE6 expression recovers gibberellin de fi ciency to promote shoot growth in Arabidopsis [J]. The Plant Journal, 2014, 78(2):241-252.

[8]ZHOU Xiangjun, SUN Tianhu, WANG Ning, et al. The cauliflower Orange gene enhances petiole elongation by suppressing expression of eukaryotic release factor 1 [J].New Phytologist, 2011, 190:89-100.

[9]Kim G T, Tsukaya H, Uchimiya H. The Rotundifolia3 gene of Arabidopsis thaliana encodes a new member of the cytochrome P-450 family that is required for the regulated polar elongation of leaf cells [J]. Genes & Development,1998, 12(15):2381-2391.

[10]Tsukaya H, Kozuka T, Kim GT. Genetic Control of Petiole Length in Arabidopsis thaliana [J]. Plant Cell Physiol.2002, 43(10):1221-1228.

[11]賈興華, 王元英, 佟道儒, 等. 烤煙新品種中煙100(CF965)的選育及其應(yīng)用評價[J]. 中國煙草學(xué)報,2006,12(2):20-25.JIA Xinghua, WANG Yuanying, TONG Daoru, et al.Development of a New Flue-cured Tobacco Variety Zhongyan100(CF965) and its Application Evaluation [J].Acta Tabacaria Sinica,2006, 12(2):20-25.

[12]佟道儒. 煙草育種學(xué) [M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1997:507,142.TONG Daoru. Tobocco Breeding [M]. Beijing: China Agriculture Press, 1997:507,142.

[13]王志德, 張興偉, 劉艷華. 中國煙草核心種質(zhì)圖譜[M].北京:科學(xué)技術(shù)文獻出版社, 2014:59.WANG Zhide, ZHANG Xingwei, LIU Yanhua. Atlas of Chinese Tobacco Core Collection [M]. Beijing: Scientific and Technical Documentation Press, 2014:59.

[14]Vranccanu A V, 鄭秀春. 向日葵短葉柄性狀的遺傳研究及其在育種中的利用[J]. 國外農(nóng)學(xué):向日葵, 1989:15-18.Vranccanu A.V., ZHENG Xiuchun. Genetic Studies on Sun fl ower short Petiole Trait and its utilization in Breeding[J]. Overseas agronomy:Sun fl ower,1989:15-18. (Translated from：Proceedings of the 12th International Sunflower Conference. 1988(2):355-360.)

[15] 趙團結(jié), 蓋鈞鎰, 游明安, 等. 大豆短葉柄性狀的遺傳分析[J]. 遺傳學(xué)報,1998,25(2): 162-170.ZHAO Tuanjie, GAI Junyi, YOU Ming'an, et al. Genetic Analysis of the short Petiole Trait in Soybeans [J]. Acta Genetica Sinica, 1998, 25(2):166-172.

[16]趙團結(jié), 邱家馴, 蓋鈞鎰. 大豆不同來源短葉柄性狀的遺傳和有關(guān)農(nóng)藝性狀表現(xiàn)[J]. 中國油料作物學(xué)報, 1999,21(3):19-22.ZHAO Tuanjie, QIU Jiaxun, GAI Junyi. Studies on the inheritance of short petiole trait of soybeans from di ff erent sources and their agronomic performances [J]. Chinese Journal of Oil Crop Science, 1999, 21(3):19-22.

：CHEN Guo, WU Xinru, QU Xu, et al. Genetic analysis of long petiole mutant traits in Nicotiana tabacum L. [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(2)

*Corresponding author.Email：wangshaomei@caas.cn

Genetic analysis of long petiole mutant traits in Nicotiana tabacum L.

CHEN Guo1, WU Xinru1, QU Xu2, CHAO Jiangtao1, XIANG Xiaohua1,3, HU Junhua1, CHEN Huan1, WANG Xin1,LIU Guanshan1, WANG Yuanying1, WANG Shaomei1*
1 Key Laboratory for Tobacco Genetic Resources/Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao, Shandong 266101, China;2 Qingdao Zhongyan Tobacco Seed Co., Ltd., Qingdao, Shandong 266101, China；3 Hainan Cigar Research Institute, Haikou 571000, China

Genetic analysis of long petiole traits of Nicotiana tabacum L. was conducted to study the development of tobacco petiole and leaf. A long and very long petioles mutants (M48, M50) whose wild type had no petioles was obtained respectively from Nicotiana tobacum L. varieties Zhongyan100 (ZY) and Honghuadajinyuan (HD) by EMS mutagenesis. The long petiole mutants were hybridized with their own wild type Zhongyan100 and Honghuadajinyuan respectively, as well as Nicotiana tobacum L. variety Gexinsanhao (G3),resulting in the formation of F1. The F1was self-crossed to obtain F2population and were then backcrossed to respective wild types to get BC1F1population. Phenotypic investigation and statistical analysis results of all materials showed that F1was all characterized by a (very)long petiole mutation phenotype. Theoretical separation ratio of mutant phenotypes and wild type phenotypes conformed to 3:1 and 1:1 by the chi square test in F2and BC1F1populations. It was suggested that the trait of (very) long petiole mutant was controlled by a pair of dominant single gene on the chromosome. These results laid solid foundation for further (very) long petiole mutant gene mapping and cloning, revealing its role in the development of tobacco petiole and leaf.

Nicotiana tobacum L.; EMS mutagenesis; petiole mutant; genetic analysis

陳果，吳新儒，屈旭，等. 普通煙草長葉柄突變性狀的遺傳分析[J]. 中國煙草學(xué)報，2017, 23（2）

國家煙草專賣局煙草基因組計劃重大專項項目[110201301005(JY-05)]

陳 果(1991—)，碩士研究生，專業(yè)方向：煙草突變體鑒定與利用，Tel: 0532-66715185，Email : 284687258@qq.com

王紹美(1973—)，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向為煙草分子育種，Tel: 0532-66715185，Email : wangshaomei@caas.cn

2016-08-17；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-02-13