徐長卿-二妙散-三藤方對蛋白聚糖誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型小鼠血清中TNF-α和DKK-1含量的影響Δ

吳琪，周曉紅，楊德才，何敢想，任婕，胡燕芬（.湖北中醫(yī)藥大學(xué)臨床技能實訓(xùn)中心，武漢4006；.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，武漢4006；.湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，武漢4006）

徐長卿-二妙散-三藤方對蛋白聚糖誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型小鼠血清中TNF-α和DKK-1含量的影響Δ

吳琪1＊，周曉紅2，楊德才3，何敢想1#，任婕1，胡燕芬1（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)臨床技能實訓(xùn)中心，武漢430061；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，武漢430061；3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，武漢430061）

目的：研究徐長卿-二妙散-三藤方對關(guān)節(jié)炎模型小鼠血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）和骨化相關(guān)因子DKK-1含量的影響，探討該方治療關(guān)節(jié)炎的作用機制。方法：將60只BALB/c小鼠隨機分為正常組、模型組、柳氮磺吡啶組（陽性對照，9 mg/kg）和徐長卿-二妙散-三藤方低、中、高劑量組（以生藥量計分別為11.25、22.5、45 g/kg），每組10只。除正常組外的其余50只小鼠均采用完全弗氏佐劑+蛋白聚糖ip法建立關(guān)節(jié)炎模型。成模后，各給藥組小鼠ig相應(yīng)藥物，正常組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)20 d。給藥結(jié)束后，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組小鼠血清中TNF-α和DKK-1含量，透射電鏡下觀察小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜細胞超微病理結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：與正常組比較，模型組小鼠血清中TNF-α含量明顯升高、DKK-1含量明顯降低（P＜0.05）；鏡下可見小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜細胞發(fā)生增生肥大、胞質(zhì)內(nèi)細胞器變形、線粒體腫脹等病理損傷。與模型組比較，各給藥組小鼠血清中TNF-α含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），除柳氮磺吡啶組外的其余各給藥組小鼠血清中DKK-1含量均明顯升高（P＜0.05）；鏡下可見各給藥組小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜細胞的病理損傷均有不同程度減輕，且徐長卿-二妙散-三藤方組小鼠的病理損傷好轉(zhuǎn)程度較柳氮磺吡啶組更顯著。結(jié)論：徐長卿-二妙散-三藤方可能通過降低血清中TNF-α含量和升高DKK-1含量，從而抑制關(guān)節(jié)炎模型小鼠的骶髂關(guān)節(jié)炎癥和病理性骨化。

徐長卿-二妙散-三藤方；關(guān)節(jié)炎；腫瘤壞死因子α；骨化相關(guān)因子DKK-1；BALB/c小鼠

蛋白聚糖誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎（Proteoglycan-induced arthritis，PGIA）模型是目前研究強直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）的主要動物模型之一[1]。當(dāng)前治療AS的藥物如非甾體類抗炎藥（NSAIDs）、抗風(fēng)濕藥物（DMARDs）和腫瘤壞死因子（TNF）受體拮抗藥等，通常只能改善或控制癥狀，不能從根本上逆轉(zhuǎn)AS的自然病理演變過程[2]，并普遍存在很多副作用[3]，骨侵蝕與骨贅形成依然存在，且某些藥品價格昂貴也限制了其廣泛和長期使用[4]。因此，探索具有抗炎作用并能有效抑制病理性新骨形成、副作用小且價格低廉的方藥，是AS防治的重要課題。

徐長卿-二妙散-三藤方為湖北省中醫(yī)院骨傷科熊昌源教授的經(jīng)驗方。熊昌源教授是全國第三、四批師帶徒名老中醫(yī)，從事中醫(yī)骨傷臨床教學(xué)科研40余年，在AS的診治方面積累了豐富的經(jīng)驗。AS的臨床辯證眾說不一，熊昌源教授從“濕、瘀、虛”論治AS，認為濕、瘀貫穿于AS發(fā)生發(fā)展的整個過程，采用徐長卿-二妙散-三藤方為基本方，可祛濕逐瘀、通督伸筋、兼顧補虛。現(xiàn)代藥理研究表明，徐長卿的主要有效成分丹皮酚具有與NSAIDs相似的藥理作用[5-7]，且副作用小。二妙散（由黃柏和蒼術(shù)組成）見于《丹溪心法》，主治濕熱下注證，臨床上治療濕熱痹阻型活動期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[8]和急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[9]療效較好。實驗研究表明，二妙散通過抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥細胞因子的作用發(fā)揮其抗炎效應(yīng)，并且以黃柏、蒼術(shù)比例為1∶1配伍時效果最明顯[10]。督脈夾脊抵腰中，行于背正中總督一身之陽，此脈一通，則百脈皆通，熊昌源教授認為腰骸胸背和外周骨節(jié)病變與督脈有密切關(guān)系。因藤能入絡(luò)，絡(luò)能通脈，雞血藤活一身之血絡(luò)，絡(luò)石藤通一身之筋脈，海風(fēng)藤祛一身之風(fēng)濕，“三滕”合用共奏通督伸筋之效。

本研究擬在給予PGIA模型小鼠徐長卿-二妙散-三藤方后，采用透射電鏡觀察各組小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜細胞超微病理結(jié)構(gòu)變化，并運用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測血清中炎癥相關(guān)細胞因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）和Wnt信號通路病理性骨化相關(guān)因子DKK-1的含量，從分子水平揭示該方治療AS的作用機制，為將該方廣泛應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HT-7700透射電鏡（日本日立高新技術(shù)公司）；C2500-R-230V微型高速離心機（美國Labnet公司）；ICV-450電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本Asone科學(xué)儀器公司）；Multiskan MK3全自動酶標(biāo)儀（美國Thermo科技公司）。

1.2 飲片、藥品與試劑

徐長卿（批號：160601）、黃柏（批號：170601）、蒼術(shù)（批號：160301）、雞血藤（批號：160501）、絡(luò)石藤（批號：160301）、海風(fēng)藤（批號：160101）飲片均購自湖北強康中藥飲片有限公司；柳氮磺吡啶腸溶片（上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號：H31020557，規(guī)格：每片0.25 g）；蛋白聚糖（PG，美國西格瑪奧德里奇公司，批號：D-8428，純度：＞99%）；完全弗氏佐劑（美國MP Bio公司，批號：642857，純度：99%）；小鼠TNF-α（批號：E-EL-M0049c）、小鼠DKK-1（批號：E-EL-M0024c）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

清潔級BALB/c小鼠60只，♂，鼠齡（20±4）周，體質(zhì)量（22±2）g，由武漢大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（鄂）2008-0004。

2 方法

2.1 徐長卿-二妙散-三藤方的制備

方藥組成：徐長卿20 g、黃柏12 g、蒼術(shù)12 g、雞血藤10 g、絡(luò)石藤10 g、海風(fēng)藤10 g。將以上5種中藥按2∶1.2∶1.2∶1∶1∶1的比例放置在套式恒溫器中，加入10倍量水，武火煮沸后，改文火煎煮1 h，濾出藥液；藥渣加8倍量水繼續(xù)煎煮1 h；合并2次濾液，將濾液濃縮至以生藥量計終質(zhì)量濃度分別為1.125、2.25、4.5 g/mL，各120 mL[11]，作為徐長卿-二妙散-三藤方給藥的低、中、高劑量藥液，密封滅菌，4℃冰箱冷藏，備用。

2.2PGIA小鼠模型的制備

將60只小鼠隨機分為正常組、模型組、柳氮磺吡啶組（陽性藥物）和徐長卿-二妙散-三藤方低、中、高劑量組，每組10只。除正常組外，其余50只小鼠均復(fù)制PGIA模型，即將完全弗氏佐劑100 μL和PG 100 μL混合后，分別在實驗第0、3、6周分3次注入小鼠腹腔。在第3次抗原注射結(jié)束后，每周觀察3次關(guān)節(jié)炎發(fā)病情況，主要觀察免疫后小鼠足趾、踝關(guān)節(jié)紅腫程度和關(guān)節(jié)功能受限程度。按照0～4分/爪對小鼠進行外周關(guān)節(jié)進行評分[12]：無任何炎性腫脹為0分，單個爪受累腫脹為1分，大于1個爪受累為2分，關(guān)節(jié)活動受限為3分，踝關(guān)節(jié)腫脹僵直為4分，總評分在0～16分之間。

2.3 分組與給藥

從造模成功的第1天起開始給藥，正常組和模型組小鼠ig等體積蒸餾水，氮磺吡啶組小鼠ig 9 mg/kg的氮磺吡啶蒸餾水溶液（相當(dāng)于成人臨床用量的等效劑量），徐長卿-二妙散-三藤方低、中、高劑量組小鼠ig按生藥量計分別為11.25、22.5、45 g/kg的中藥溶液（分別按成人臨床用量的6、12、24倍換算），每天給藥1次，連續(xù)20 d。

2.4 ELISA法檢測小鼠血清中TNF-α和DKK-1含量

給藥結(jié)束后，于小鼠眼眶后靜脈叢取血并分離血清，采用ELISA法檢測血清中TNF-α和DKK-1，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

2.5 小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜細胞超微結(jié)構(gòu)的觀察

將小鼠處死，取雙側(cè)骶髂關(guān)節(jié)面約2 mm厚的滑膜組織標(biāo)本，以2.5%戊二醛前固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液（PBS）漂洗3次，1%鋨酸后固定，梯度酒精（50%、70%、80%、95%、100%）脫水2次，每次15 min；環(huán)氧樹脂包埋，純丙酮脫水2次，每次15 min；環(huán)氧樹脂包埋劑EPON812-丙酮（1∶1）浸透30 min，純包埋液浸透1 h，純包埋液在37℃固化24 h后，升溫至60℃再固化48 h；超薄切片機切片，鈾、鉛（醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛）染色后，透射電鏡觀察滑膜細胞超微結(jié)構(gòu)變化。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況和外周關(guān)節(jié)變化

在第2次抗原免疫后（實驗第4周），各造模組小鼠出現(xiàn)進食量減少、體型消瘦、皮毛無光澤并伴輕微脫毛、易怒的情況；在第3次抗原免疫后（實驗第6周），各造模組小鼠的上述表現(xiàn)加重，并出現(xiàn)脊柱活動受限的情況。在整個實驗期間，造模小鼠均未出現(xiàn)踝、足趾關(guān)節(jié)紅腫等外周關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)。

3.2 小鼠血清中TNF-α和DKK-1含量變化

與正常組比較，模型組小鼠血清中TNF-α含量明顯升高，DKK-1含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，徐長卿-二妙散-三藤方低、中、高劑量組小鼠血清中TNF-α含量均明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），DKK-1含量均明顯升高（P＜0.05），且作用效果與該方劑量無明顯相關(guān)性；柳氮磺吡啶組小鼠血清中TNF-α含量較模型組明顯降低（P＜0.05），而DKK-1含量較模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠血清中TNF-α和DKK-1含量的測定結(jié)果（±s，n＝10，ng/mL）Tab1 Determination results of the contents of TNF-α and DKK-1 in serum of mice in each group（±s，n＝10，ng/mL）

表1 各組小鼠血清中TNF-α和DKK-1含量的測定結(jié)果（±s，n＝10，ng/mL）Tab1 Determination results of the contents of TNF-α and DKK-1 in serum of mice in each group（±s，n＝10，ng/mL）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

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3.3 小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜細胞超微病理結(jié)構(gòu)變化

正常組小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜層由薄的細胞層和內(nèi)膜下層構(gòu)成，可見絨毛，內(nèi)含膠原性纖維；滑膜細胞有A、B兩型，均無異常；巨噬細胞樣A型細胞的細胞質(zhì)內(nèi)含豐富的線粒體、囊泡和溶酶體；成纖維細胞樣B型細胞含有高濃度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、少量線粒體和空泡。模型組小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜細胞增生肥大，細胞質(zhì)內(nèi)細胞器變形，線粒體腫脹明顯，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，可見少許散在溶酶體顆粒，胞核內(nèi)染色質(zhì)分布不均。柳氮磺吡啶組小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜層細胞性內(nèi)膜增生，B型細胞的細胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，有大量空泡形成，核周間隙增寬。徐長卿-二妙散-三藤方低、中、高劑量組小鼠滑膜細胞層無增厚，可見疏松平行排列的滑膜細胞；A型細胞的細胞質(zhì)內(nèi)線粒體輕度腫脹，初級溶酶體多見；B型細胞的細胞質(zhì)內(nèi)有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。各組小鼠滑膜細胞的電鏡圖見圖1。

圖1 各組小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜細胞超微結(jié)構(gòu)的電鏡圖（×5 000）Fig1 Electron micrographs of ultrastructure of sacroiliac joint synovial cells of mice in each group（×5 000）

4 討論

PGIA模型是目前唯一侵犯中軸骨系統(tǒng)的系統(tǒng)性自身免疫小鼠模型[13]，已成為脊柱關(guān)節(jié)炎動物模型研究的熱點。在本研究中，造模組小鼠在免疫后第2、4、8周均未出現(xiàn)踝、足趾關(guān)節(jié)紅腫等外周關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，說明AS發(fā)病隱匿，中軸關(guān)節(jié)炎癥及骨化的累積可能無明顯臨床表型，需借助病理及影像學(xué)方法進行觀察。這與臨床AS主要表現(xiàn)為中軸骨骼系統(tǒng)炎癥和過度骨化相符。

電鏡觀察滑膜細胞分為含有較多溶酶體、有吞噬能力的M細胞（Macrophage-like cells）和含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、可分泌黏蛋白和透明質(zhì)酸的F細胞（Fibroblast-like cells）[14]。本研究通過對各組A、B型滑膜細胞超微病理結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜細胞中分泌活性細胞器變形、分泌亢進；徐長卿-二妙散-三藤方低、中、高劑量組小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜細胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富、線粒體輕度腫脹，說明徐長卿-二妙散-三藤方可減輕骶髂關(guān)節(jié)滑膜細胞損傷。

研究表明，自身免疫介導(dǎo)的炎癥是AS發(fā)展的起始環(huán)節(jié)，骨贅形成是AS致殘的主要因素[15]。TNF-α是觸發(fā)AS“炎癥因子風(fēng)暴”級瀑布效應(yīng)的關(guān)鍵因子之一，其與AS韌帶骨化有密切的聯(lián)系[16]。Fujita K等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在調(diào)節(jié)成骨細胞功能及骨形成中發(fā)揮著重要作用，而DKK-1是Wnt信號的重要抑制因子[18]，阻斷DKK-1激活Wnt通路也可使骨破壞變?yōu)楣琴樕?。DKK-1介導(dǎo)的抑制作用減弱可能是成骨過度的主要機制。柳氮磺吡啶作為目前治療AS的主要藥物之一，在改善AS結(jié)構(gòu)破壞方面的作用并不確定[3]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，徐長卿-二妙散-三藤方低、中、高劑量組和柳氮磺吡啶組小鼠血清中TNF-α含量均明顯降低（P＜0.05），且低、中、高劑量徐長卿-二妙散-三藤方的作用優(yōu)于柳氮磺吡啶；低、中、高劑量徐長卿-二妙散-三藤方均能使小鼠血清中DKK-1含量明顯升高（P＜0.05），而柳氮磺吡啶對DKK-1含量無明顯影響（P＞0.05）。這提示徐長卿-二妙散-三藤方可通過上調(diào)血清中DKK-1的含量從而抑制Wnt信號通路介導(dǎo)的新骨形成，而柳氮磺吡啶可能沒有抑制AS病理性骨化的作用。

綜上所述，徐長卿-二妙散-三藤方能顯著降低PGIA小鼠血清中TNF-α含量、升高DKK-1含量，從而抑制PGIA小鼠骶髂關(guān)節(jié)炎癥和病理性骨化。

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Effect of Xuchangqing-ermiaosan-santeng Formula on the Contents of TNF-α and DKK-1 in Serum of Model Mice with Proteoglycan-induced Arthritis

WU Qi1，ZHOU Xiaohong2，YANG Decai3，HE Ganxiang1，REN Jie1，HU Yanfen1（1.Teaching and Demonstration Center of Clinical Skill，Hubei University of TCM，Wuhan 430061，China；2.College of Acupuncture and Orthopaedics-traumatology，Hubei University of TCM，Wuhan 430061，China；3.First Clinical College，Hubei University of TCM，Wuhan 430061，China）

OBJECTIVE：To study the effect of Xuchangqing-ermiaosan-santeng formula on the contents of tumor necrosis factor α（TNF-α）and ossification-related factor DKK-1 in serum of model mice with arthritis，and reveal its mechanism in the treatment of arthritis.METHODS：60 BALB/c mice were randomly divided into normal group，model group，sulfasalazine group（positive control，9 mg/kg）and Xuchangqing-ermiaosan-santeng formula low-dose，medium-dose，high-dose groups（calculated by crude drug as 11.25，22.5，45 g/kg），10 in each group.Except for normal group，other 50 mice were intraperitoneallly injected complete Freund’s adjuvant+proteoglycans to induce model with arthritis.After modeling，mice in each administration group were intragastrically administrated relevant medicines，mice in normal group and model group were intragastrically administrated equal volume of normal saline，once a day，for 20 d.After administration，enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the contents of TNF-α and DKK-1 in serum of mice in each group，and ultrastructural changes of sacroiliac joint synovial cells were observed by transmission electron microscopy.RESULTS：Compared with normal group，TNF-α content in serum in model group was obviously increased，DKK-1 content was obviously decreased（P＜0.05）；sacroiliac joint synovial cells showed hyperplasia，organellar deformation，mitochondrial swelling and other pathologic damage.Compared with model group，TNF-α contents in serum in each administration group were obviously decreased（P＜0.05 orP＜0.01）；except for sulfasalazine group，the DKK-1 content of mice in other administration groups were obviously increased（P＜0.05）.Pathologic damages of sacroiliac joint synovial cells in each administration group were reduced to varying degrees，and improvement degree in Xuchangqing-ermiaosan-santeng formula groups was higher than sulfasalazine group.CONCLUSIONS：Xuchangqing-ermiaosan-santeng formula may inhibit the sacroiliac arthritis and pathological ossification of model mice with arthritis by decreasing TNF-α content and increasing DKK-1 content in serum.

Xuchangqing-ermiaosan-santeng formula；Arthritis；Tumor necrosis factor α；Ossification-related factor DKK-1；BALB/c mice

R285.5

A

1001-0408（2017）31-4369-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.13

湖北省教育廳科學(xué)研究計劃資助項目（No.Q20162011）

＊高級實驗師，博士。研究方向：骨關(guān)節(jié)病的中醫(yī)藥防治。電話：027-68889070。E-mail：wuqi111@163.com

#通信作者：主任醫(yī)師，碩士。研究方向：中醫(yī)外科。電話：027-68889070。E-mail：25272965@qq.com

2017-03-30

2017-09-11）

（編輯：林靜）