hTERC基因在預(yù)測宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸中的價(jià)值

葛運(yùn)貞

【摘要】 目的：探討hTERC基因在預(yù)測宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸中的價(jià)值，為臨床預(yù)測宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸提供理論依據(jù)。方法：選取本院2011年12月-2016年12月收治的206例宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級（CINⅠ）進(jìn)行分析，隨訪后根據(jù)病理學(xué)確診情況分為進(jìn)展組、持續(xù)組和轉(zhuǎn)歸組，采用Fish技術(shù)檢測不同組的hTERC基因擴(kuò)增情況。結(jié)果：206例宮頸石蠟包埋病理標(biāo)本，所有患者均成功雜交，其中56例進(jìn)行了二次雜交，雜交成功率100%。206例CINⅠ組患者隨訪后發(fā)現(xiàn)，hTERC基因擴(kuò)增陽性114例，其中進(jìn)展組67例、持續(xù)組30例、轉(zhuǎn)歸組17例。在進(jìn)展組中hTERC基因擴(kuò)增陽性67例，占100%，持續(xù)組中基因擴(kuò)增陽性30例，占49.18%，轉(zhuǎn)歸組中基因擴(kuò)增陽性17例，占21.79%；經(jīng)Fisher確切概率法，三組轉(zhuǎn)歸陽性率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)Fisher確切概率法，三組hTERC基因擴(kuò)增異常信號比的細(xì)胞比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：hTERC基因或可成為預(yù)測CINⅠ病程進(jìn)展程度的一種生物學(xué)指標(biāo)，可為臨床醫(yī)師診斷和治療提供依據(jù)，從而更大程度地做到對患者的早診、早治，避免對患者造成更大的傷害。

【關(guān)鍵詞】 宮頸癌； 宮頸上皮內(nèi)瘤變； 人類染色體端粒酶RNA基因； 熒光原位雜交技術(shù)； 石蠟包埋切片

【Abstract】 Objective：To explore the value of hTERC gene in predicting the progression and outcome of cervical intraepithelial neoplasia grade Ⅰ，and to provide theoretical basis for predicting the progression and outcome of cervical intraepithelial neoplasia grade Ⅰ.Method：A total of 206 cases of cervical intraepithelial neoplasia （CINⅠ ） were selected in our hospital from December 2011 to December 2016.The patients were divided into progress group，continuous group and control group，according to the pathologic diagnosis，F(xiàn)ish technique was used to detect the hTERC gene amplification in different groups.Result：206 cases of cervical paraffin embedded pathological specimens，all patients were successfully hybridized，of which 56 cases were secondary hybridization，hybridization success rate of 100%.206 patients with CINⅠ were followed up and found that 114 cases of hTERC gene amplification were positive，including 67 cases in the progress group，30 cases in the continuous group and 17 cases in the control group.In the progress group，the positive rate of hTERC gene amplification was 67 cases（100%），the continuous group was positive in 30 cases（49.18%），and the control group was 17 cases （21.79%），by Fisher exact test method，the difference between the three groups was statistically significant（P<0.05）.The Fisher exact test，the proportion of cells in the abnormal signal amplification of hTERC gene than the three groups compared，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion：The hTERC gene may be a biological indicator for predicting the progression of CINⅠ，which can provide a basis for the diagnosis and treatment of clinicians，so as to achieve a greater degree of early diagnosis and early treatment of patients，to avoid causing greater harm to patients.

【Key words】 Cervical cancer； Cervical intraepithelial neoplasia； Human chromosome telomerase RNA gene； Fluorescence in situ hybridization； Paraffin-embedded sectionsendprint

First-authors address：The Peoples Hospital of Linyi Economic and Technological Development Zone，Linyi 276023，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.21.008

隨著環(huán)境和社會壓力的增加，目前女性宮頸癌的發(fā)病率占據(jù)女性惡性腫瘤的第2位，據(jù)現(xiàn)有的流行病學(xué)調(diào)查顯示，在我國每年大約有53萬新發(fā)病例，死亡人數(shù)約30萬，嚴(yán)重威脅婦女的健康，降低了患者的生活質(zhì)量[1]。文獻(xiàn)[2-3]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌進(jìn)展一般需要10～20年的時間，病變從HPV感染最終發(fā)展成宮頸癌，由此可認(rèn)為宮頸癌是一種可預(yù)防的惡性腫瘤。目前對于宮頸癌的檢查大部分采用三階段進(jìn)行篩查，主要包括宮頸細(xì)胞學(xué)檢查、人類乳頭狀病毒DNA的檢測以及陰道鏡的檢測。但各種檢測方法有著自己的局限性，存在敏感率低，或特異性不高的現(xiàn)象。因此需要探索一種新的臨床指標(biāo)來預(yù)測宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展并協(xié)助上述檢查方法[4]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前研究發(fā)現(xiàn)，hTERC基因可阻止細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，是宮頸癌的發(fā)病機(jī)制之一[5]。本研究探討hTERC基因在預(yù)測宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸中的價(jià)值，為臨床預(yù)測宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2011年12月-2016年12月收治的206例宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級（CINⅠ）進(jìn)行分析，年齡38～58歲，平均（43.2±5.1）歲，所有患者均無急性陰道炎、宮頸炎以及就診前24 h內(nèi)無性生活，無長期性激素暴露史，非月經(jīng)期、妊娠期和哺乳期；獲取標(biāo)本前接受過物理或化學(xué)治療的患者。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的制作 所有患者均進(jìn)行宮頸組織的取材，且進(jìn)行石蠟包埋，然后進(jìn)行厚度為2 μm的連續(xù)切片6張，并將玻片經(jīng)70 ℃的過夜烘烤。

1.2.2 熒光原位雜交技術(shù)（FISH）檢測 將事先制作好的標(biāo)本置于二甲苯中進(jìn)行脫蠟處理，15 min/次，共2次；隨后放入100%乙醇中，10 min；然后將玻片在室溫下依次經(jīng)100%乙醇3 min、85%乙醇

3 min、75%的乙醇3 min；將其放入滅菌純化水中室溫洗滌3 min，取出玻片，再將其放入滅菌純化水中100 ℃煮片20 min進(jìn)行復(fù)水；復(fù)水后將玻片置于2×氯化鈉檸檬酸鈉清洗緩沖液中漂洗玻片

5 min，室溫晾干，進(jìn)行松解和消化；將玻片放置37 ℃的雜交儀器中，滴加適量的蛋白酶K工作液，消化10 min，室溫下于2×氯化鈉檸檬酸鈉清洗緩沖液中漂洗玻片2次，5 min/次；將玻片依次置于70%、85%和100%乙醇中各脫水3 min，自然干燥玻片[6]。Fish檢測步驟包括（1）離心：從-20 ℃冰箱中取出雜交液，混勻后進(jìn)行離心[6-7]；（2）雜交：加入10 μL的雜交液，蓋上22 mm×22 mm的蓋玻片，用封片膠沿蓋玻片邊緣封片，用將玻片放在83 ℃的雜交儀上，變性5 min，42 ℃復(fù)性16 h；（3）洗滌：將玻片取出，用鑷子輕輕撕去橡皮膠，移去蓋玻片，玻片放入47 ℃的2×氯化鈉檸檬酸鈉清洗緩沖液中洗滌5 min，然后放入47 ℃的0.1% NP-40和2×氯化鈉檸檬酸鈉清洗緩沖液中洗滌

5 min，將玻片室溫下浸泡在70%乙醇中脫水3 min，自然干燥玻片；（4）觀察：滴加10 μL DAPI復(fù)染劑到載玻片的組織中，蓋上蓋玻片，輕壓，避免產(chǎn)生氣泡，在暗處存放，在熒光顯微鏡下選擇適合的濾光片進(jìn)行觀察。

1.2.3 FISH結(jié)果的判斷 用FISH分析軟件進(jìn)行圖像分析。每例樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，計(jì)算顯示異常信號細(xì)胞數(shù)所占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比。雜交結(jié)果標(biāo)記顏色綠∶紅[8]，正常信號細(xì)胞為綠色及紅色信號各2個，即2∶2；擴(kuò)增異常信號細(xì)胞為綠色信號≥2個，紅色信號>2個，即2∶3、2∶4、3∶3、4∶4以及高拷貝型（N：≥5，即綠色信號≥2個，紅色信號≥5個）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。三組間的陽性率比較采用Fisher確切概率法，其檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為α=0.05；兩兩比較采用Fisher確切概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為α=0.05/3=0.017。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hTERC基因擴(kuò)增陽性情況與CINⅠ進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸的關(guān)系 本研究中206例宮頸石蠟包埋病理標(biāo)本，所有患者均成功雜交，其中56例進(jìn)行了二次雜交，雜交成功率100%。206例CINⅠ組患者隨訪后發(fā)現(xiàn)，hTERC基因擴(kuò)增陽性114例，其中進(jìn)展組67例、持續(xù)組30例、轉(zhuǎn)歸組17例，見表1。

2.2 hTERC基因擴(kuò)增陽性情況與CINⅠ進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸的關(guān)系 在進(jìn)展組中hTERC基因擴(kuò)增陽性67例，占100%（67/67），持續(xù)組中基因擴(kuò)增陽性30例，占49.18%（30/61），轉(zhuǎn)歸組中基因擴(kuò)增陽性17例，占21.79%（17/78）；經(jīng)Fisher確切概率法，三組轉(zhuǎn)歸陽性率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 hTERC基因擴(kuò)增異常信號細(xì)胞及異常信號比類型與CINⅠ進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸的關(guān)系 206例宮頸石蠟包埋病理標(biāo)本，每例計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，進(jìn)展組67例中hTERC基因擴(kuò)增異常信號細(xì)胞數(shù)3371個，擴(kuò)增異常信號細(xì)胞比例為50.31%；持續(xù)組30例，hTERC基因擴(kuò)增異常信號細(xì)胞數(shù)678個，擴(kuò)增異常信號細(xì)胞比例為22.60%；轉(zhuǎn)歸組17例，hTERC基因擴(kuò)增異常信號細(xì)胞數(shù)112個，擴(kuò)增異常信號細(xì)胞比例為6.59%；經(jīng)Fisher確切概率法，三組hTERC基因擴(kuò)增異常信號比的細(xì)胞比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。endprint

3 討論

盡管醫(yī)學(xué)診療技術(shù)的不斷進(jìn)步，但是宮頸癌仍然是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性疾病之一，其發(fā)病率較高，居惡性腫瘤發(fā)病率的第2位，僅次于乳腺癌，且全球發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，在發(fā)展中國家尤為突出。且目前宮頸癌發(fā)病有明顯年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命[1-9]。在發(fā)達(dá)國家，由于開展對宮頸癌的篩查，對宮頸癌實(shí)施早期的診斷和治療，目前死亡率已下降50%，而在發(fā)展中國家，大多數(shù)宮頸癌發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是晚期。這說明早期診斷和治療至關(guān)重要[2]。

現(xiàn)代細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究表明，人體大多實(shí)體腫瘤細(xì)胞一般表現(xiàn)為染色體的不穩(wěn)定性，其不僅數(shù)目異常，而且在某種程度上其染色體結(jié)構(gòu)也有著一定的異常表現(xiàn)。在對宮頸癌的研究中顯示，常見于染色體3q的增加和2、3、4、6P與11q的缺失[10-11]。文獻(xiàn)[12-14]研究表明，宮頸細(xì)胞由非典型性發(fā)育異常向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變的過程中幾乎都伴有3號染色體長臂擴(kuò)增。其中，人類染色體端粒酶基因（hTERC）作為端粒酶RNA成分的編碼基因，其異常擴(kuò)增可能為導(dǎo)致宮頸癌的因素之一。該基因的擴(kuò)增可阻止細(xì)胞凋亡，因而可導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生[15-17]。

熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)是目前檢測這一基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方法[18]。目前，F(xiàn)ISH檢測方法已廣泛地用于產(chǎn)前、產(chǎn)后遺傳病診斷及血液腫瘤、實(shí)體瘤等方面的檢測。其檢測樣本較為廣泛，主要包括羊水、絨毛、流產(chǎn)組織、外周血、骨髓、體液及各種腫瘤組織等[18-19]。

本研究通過FISH技術(shù)對宮頸脫落細(xì)胞TERC基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，206例CINⅠ組患者隨訪后發(fā)現(xiàn)，hTERC基因擴(kuò)增陽性114例，其中進(jìn)展組67例、持續(xù)組30例、轉(zhuǎn)歸組17例。且研究還發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)展組中hTERC基因擴(kuò)增陽性67例，占100%（67/67），持續(xù)組中基因擴(kuò)增陽性30例，占49.18%（30/61），轉(zhuǎn)歸組中基因擴(kuò)增陽性17例，占21.79%（17/78）；經(jīng)Fisher確切概率法，三組轉(zhuǎn)歸陽性率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

FISH技術(shù)操作相對簡單，重復(fù)性好、穩(wěn)定，并具有較好的靈敏性及特異性，并且不需要細(xì)胞培養(yǎng)，可以用于間期細(xì)胞[20-21]。本研究對宮頸上皮內(nèi)瘤變患者不同進(jìn)展的階段進(jìn)行FISH分析檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，206例宮頸石蠟包埋病理標(biāo)本，每例計(jì)數(shù)100個

細(xì)胞，進(jìn)展組67例中hTERC基因擴(kuò)增異常信號細(xì)胞數(shù)3371個，擴(kuò)增異常信號細(xì)胞比例為50.31%；持續(xù)組30例，hTERC基因擴(kuò)增異常信號細(xì)胞數(shù)678個，擴(kuò)增異常信號細(xì)胞比例為22.60%；轉(zhuǎn)歸組17例，hTERC基因擴(kuò)增異常信號細(xì)胞數(shù)112個，擴(kuò)增異常信號細(xì)胞比例為6.58%；經(jīng)Fisher確切概率法，三組hTERC基因擴(kuò)增異常信號比的細(xì)胞比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

綜上所述，hTERC基因或可成為預(yù)測CINⅠ病程進(jìn)展程度的一種生物學(xué)指標(biāo)，可為臨床醫(yī)師診斷和治療提供依據(jù)，從而更大程度的做到對患者的早診、早治，避免對患者造成更大的傷害。

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（收稿日期：2017-04-25） （本文編輯：張爽）endprint