胃腺癌組織中TRAF2 mRNA、蛋白的表達(dá)變化及其意義

石曉虹，王明娟，程玉，齊潔敏

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000)

胃腺癌組織中TRAF2 mRNA、蛋白的表達(dá)變化及其意義

石曉虹，王明娟，程玉，齊潔敏

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000)

目的觀察胃腺癌組織中腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)mRNA、蛋白的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法取胃腺癌組織60例份(胃癌組)、癌旁正常胃黏膜組織55例份(對(duì)照組)。采用qRT-PCR法檢測(cè)兩組中的TRAF2 mRNA。分別采用免疫組化SP法和Western blotting法檢測(cè)兩組中的TRAF2蛋白。分析TRAF2 mRNA及蛋白表達(dá)與胃腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果胃癌組、對(duì)照組TRAF2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為6.36(2.05)、0.68(0.95)，胃癌組TRAF2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05)。胃癌組和對(duì)照組TRAF2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.70%、32.10%，TRAF2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.41±0.59、0.48±0.10，胃癌組TRAF2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P均<0.05)。胃腺癌組織中TRAF2 mRNA、蛋白表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及浸潤(rùn)深度有關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論胃腺癌組織中TRAF2 mRNA及蛋白表達(dá)增高，TRAF2異常高表達(dá)可能參與了胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

胃腫瘤；胃腺癌；腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2

對(duì)細(xì)胞凋亡的獲得性抵抗是惡性腫瘤的標(biāo)志之一[1]，抵抗細(xì)胞凋亡也是腫瘤逃脫免疫監(jiān)視的機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)主要有內(nèi)源性線粒體及外源性死亡受體兩種途徑。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)失調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡抵抗，其機(jī)制復(fù)雜。Karl等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌HeLa細(xì)胞中腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)可通過激活NF-κB通路及抑制Caspase-8活化來抵抗TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖。TRAF2是腫瘤壞死因子受體(TNFR)等死亡受體信號(hào)通路的重要因子，可介導(dǎo)調(diào)節(jié)TNFR家族的信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)NF-κB通路激活有重要作用[3]。NF-κB通路激活后可誘導(dǎo)某些抗凋亡基因表達(dá)，從而產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞凋亡的抵抗?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌[4]、宮頸癌[5]等組織中TRAF2表達(dá)異常，且TRAF2與惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)。本研究觀察了胃腺癌組織中TRAF2 mRNA、蛋白的表達(dá)變化，并分析其與胃腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討TRAF2在胃腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 收集胃癌手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本60例份(胃癌組)，術(shù)后經(jīng)病理檢查證實(shí)為胃腺癌組織；另取癌旁(距病灶邊緣>5 cm)正常胃黏膜組織55例份作為對(duì)照組。胃癌組患者中，男35例、女25例，年齡26～80歲；對(duì)照組患者中，男30例、女25例，年齡20～78歲。兩組一般資料具有可比性。

1.2 TRAF2 mRNA檢測(cè) 將所收集新鮮標(biāo)本從-80 ℃低溫冰箱內(nèi)取出，稱取約0.1 g組織放入經(jīng)過無RNA酶處理的勻漿器中，向新鮮組織中加入TRIzol，充分研磨提取組織總RNA，測(cè)RNA濃度，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定的cDNA，使用cDNA進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。TRAF2基因上游引物序列為5′-GATGGAGGCATCCACCTACGA-3′，下游引物序列為5′-GCCGTTCAGGTAGATACGCAGAC-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列為5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。按說明書將引物、cDNA等加入無酶八連排管中，每種cDNA設(shè)3個(gè)復(fù)孔，輕彈混勻后放入qRT-PCR儀中，反應(yīng)參數(shù)為95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共44個(gè)循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 TRAF2蛋白檢測(cè) ①免疫組化SP法：將所收集標(biāo)本制成蠟塊，切5 μm切片，隨后參照試劑盒說明書操作。將已知陽(yáng)性的切片設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照，空白對(duì)照切片以PBS代替一抗。以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為TRAF2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。依次在低倍、高倍顯微鏡下觀察每張切片，隨機(jī)選取每張切片的10個(gè)高倍視野，依據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比綜合判定結(jié)果。按染色強(qiáng)度計(jì)分，未著色計(jì)0分、淡黃色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分、棕褐色計(jì)3分；按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分，<5%計(jì)0分、5%～<25%計(jì)1分、25%～<50%計(jì)2分、≥50%計(jì)3分；上述兩項(xiàng)得分相乘，0～1為蛋白表達(dá)陰性，≥2為蛋白表達(dá)陽(yáng)性[6]。②Western blotting法：稱取約0.1 g新鮮組織置于勻漿器中，加入裂解液1 mL后置于冰上充分研磨、裂解，離心后取上清，測(cè)蛋白濃度，蛋白變性后取蛋白上樣量30 μg，經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜、封閉劑封閉后加入一抗。兔抗人TRAF2抗體濃度為1∶200，內(nèi)參β-actin抗體濃度為1∶3 000，4 ℃過夜。次日復(fù)溫、洗膜后加入二抗(1∶10 000)，搖床孵育，洗膜后ECL發(fā)光，采集圖像。用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組TRAF2 mRNA及蛋白表達(dá)比較 胃癌組、對(duì)照組TRAF2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為6.36(2.05)、0.68(0.95)，胃癌組TRAF2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05)。免疫組化染色顯示TRAF2蛋白陽(yáng)性表達(dá)為彌漫分布于胞膜和胞質(zhì)的棕黃色顆粒(圖1)。胃癌組和對(duì)照組TRAF2陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.70%(44/60)、32.10%(19/55)，胃癌組高于對(duì)照組(P<0.05)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示胃癌組和對(duì)照組TRAF2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.41±0.59、0.48±0.10，胃癌組TRAF2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05)。詳見圖2。

注：A為正常胃黏膜組織；B為高、中分化胃腺癌組織；C為低分化胃腺癌組織。

圖1胃癌組與對(duì)照組TRAF2蛋白表達(dá)情況(免疫組化法)

注：1為正常胃黏膜組織；2為高、中分化胃腺癌組織；3為低分化胃腺癌組織。

圖2胃癌組與對(duì)照組TRAF2蛋白表達(dá)情況(Westernblotting法)

2.2 TRAF2 mRNA及蛋白表達(dá)與胃腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 胃腺癌組織中TRAF2 mRNA及蛋白表達(dá)與患者性別、年齡無關(guān)(P均>0.05)，與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及浸潤(rùn)深度有關(guān)(P均<0.05)。詳見表1。

表1 TRAF2 mRNA及蛋白表達(dá)與胃腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：與高、中分化組織相比，*P<0.05；與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織相比，#P<0.05；與Ⅰ+Ⅱ期組織相比，△P<0.05；與浸潤(rùn)深度<漿膜層組織相比，☆P<0.05。

3 討論

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，盡管目前胃癌的診斷技術(shù)及治療水平不斷提升，胃癌發(fā)病人數(shù)及死亡病例逐年減少，但由于胃癌分化程度差、起病隱匿等特點(diǎn)，患者的預(yù)后仍不理想[7]。胃癌的病理分型有很多種，但目前臨床最常見的仍是胃腺癌。胃腺癌是來源于胃腺上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，分化程度低，預(yù)后不佳。胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程復(fù)雜，與環(huán)境、飲食、炎癥等均有關(guān)，還涉及多種分子機(jī)制及復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，其中重要的因素是腫瘤細(xì)胞的無限增殖和凋亡抵抗[8]。

細(xì)胞凋亡是一種程序化的死亡方式，可維持機(jī)體正常功能。研究[9]表明TRAF2蛋白是一個(gè)抗細(xì)胞凋亡因子，TRAF2蛋白是TRAF家族的重要成員，廣泛表達(dá)于各種組織。研究[10]發(fā)現(xiàn)TRAFs在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及惡性腫瘤浸潤(rùn)等過程中扮演重要角色。TRAF2蛋白可與其他蛋白如TNFR、Caspase-8和c-IAP1等相互結(jié)合，介導(dǎo)TNF等細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終調(diào)節(jié)NF-κB通路、JNK通路等的活化[11]。在上皮細(xì)胞癌中，TRAF2被認(rèn)為是激活NF-κB的原癌基因[12]。TRAF2還存在泛素化作用[13]，被認(rèn)為是細(xì)胞存活與凋亡平衡的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控分支點(diǎn)。有學(xué)者[14]在HCT116細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TRAF2通過泛素化降解Caspase-8，發(fā)揮抗凋亡功能。幽門螺旋桿菌(HP)感染被認(rèn)為與胃腺癌有關(guān)。研究[15]發(fā)現(xiàn)感染HP后的胃癌細(xì)胞可通過TRAF2途徑激活NF-κB通路，說明TRAF2與HP感染相關(guān)的胃腺癌發(fā)生有關(guān)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)TRAF2蛋白在乳腺癌、胰腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[16，17]，且與前列腺癌預(yù)后明顯相關(guān)[18]。

本研究觀察了胃腺癌組織中TRAF2 mRNA、蛋白的表達(dá)變化，并分析其與胃腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示，胃癌組TRAF2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，胃癌組TRAF2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，提示TRAF2過表達(dá)與胃腺癌的發(fā)病有關(guān)。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)TRAF2 mRNA在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)可能與DNA低甲基化有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，胃腺癌組織中TRAF2 mRNA及蛋白表達(dá)與胃腺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及浸潤(rùn)深度有關(guān)，進(jìn)一步提示TRAF2異常表達(dá)參與了胃腺癌的發(fā)生和進(jìn)展。

綜上所述，胃腺癌組織中TRAF2 mRNA及蛋白表達(dá)增高，TRAF2異常高表達(dá)可能參與了胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展。TRAF2有望成為評(píng)估胃腺癌預(yù)后的新指標(biāo)，但這需要更大樣本、更深入的研究來驗(yàn)證。關(guān)于TRAF2促進(jìn)胃腺癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制，以及TRAF2與Caspase-8、c-IAP1、NF-κB的相互作用關(guān)系，都需要做更進(jìn)一步的研究。

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1002-266X(2017)39-0048-03

河北省高校重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(冀教高2013-4)；承德醫(yī)學(xué)院校級(jí)重點(diǎn)課題項(xiàng)目(201711)。

齊潔敏(E-mail: qijiemin@126.com)

2017-07-17)