S-烯丙基巰基半胱氨酸對乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用及其機(jī)制

閆金銀，張曉云，李寧，王鹿，張揚(yáng)，蔡海峰

(華北理工大學(xué)附屬唐山市人民醫(yī)院，河北唐山063000)

S-烯丙基巰基半胱氨酸對乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用及其機(jī)制

閆金銀，張曉云，李寧，王鹿，張揚(yáng)，蔡海峰

(華北理工大學(xué)附屬唐山市人民醫(yī)院，河北唐山063000)

目的觀察S-烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)對乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用，并探討其作用機(jī)制。方法將MCF-7細(xì)胞懸液接種于BALB/C雌性裸鼠右側(cè)腋下近上肢處成瘤，制作乳腺癌MCF-7細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型。將造模成功的裸鼠隨機(jī)分為對照組、低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組。對照組給予Nacl注射液，低劑量SAMC組給予150 mg/kg的SAMC，高劑量SAMC組給予300 mg/kg的SAMC，紫杉醇組給予10 mg/kg的紫杉醇。每周腹腔注射給藥3次，共給藥3周。末次給藥后第2天處死裸鼠，取移植瘤組織稱重，計(jì)算各組腫瘤抑瘤率；HE染色鏡下觀察腫瘤組織病理變化；采用免疫組化法檢測各組腫瘤組織中的VEGF、Caspase-3蛋白。結(jié)果低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組瘤重低于對照組(P均<0.05)。高劑量SAMC組腫瘤抑制率高于低劑量SAMC組(P<0.05)，但與紫杉醇組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤組織HE染色見低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞壞死，三組壞死面積和程度依次增大。對照組、低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組腫瘤組織中Caspase-3蛋白相對表達(dá)量依次升高，VEGF相對表達(dá)量依次降低(P均<0.05)。結(jié)論SAMC可抑制乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長，機(jī)制可能與Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)、VEGF蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

S-烯丙基巰基半胱氨酸；乳腺癌；血管內(nèi)皮生長因子；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3

乳腺癌是臨床最常見女性惡性腫瘤。流行病學(xué)研究[1，2]表明，乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，并且發(fā)病年齡趨于年輕化，預(yù)計(jì)到2030年，乳腺癌發(fā)病人數(shù)將達(dá)264萬，病死人數(shù)達(dá)170萬[3]。近年越來越多的研究表明，許多傳統(tǒng)中藥不僅具有明顯抗腫瘤療效，且毒性作用小，抗腫瘤的同時(shí)可提高機(jī)體免疫力。大蒜富含機(jī)體所需的多種微量元素及生物活性成分。S-烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)是大蒜水溶性有效活性成分之一，現(xiàn)已證實(shí)SAMC對結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌及白血病等許多惡性腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用[4～6]，然而在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察SAMC對乳腺癌作用的相關(guān)研究較少。紫杉醇可抑制細(xì)胞有絲分裂過程中紡錘體的形成，使腫瘤細(xì)胞有絲分裂過程停滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，目前已成為乳腺癌患者最常使用的化療藥物之一[7～9]。本研究建立了乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，以紫杉醇為陽性對照，觀察SAMC的抑瘤作用，并探討可能的作用機(jī)制，為SAMC應(yīng)用于乳腺癌臨床治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 MCF-7乳腺癌細(xì)胞系(百恩維生物科技有限公司)，4周齡BALB/C雌性裸鼠(北京維通利華公司)，SAMC(北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司)，紫杉醇注射液(深圳萬樂制藥有限公司)，DAB顯色試劑(上海生工生物工程股份有限公司)，VEGF、Caspase-3免疫組化試劑盒(北京中杉金橋有限公司)。

1.2 乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型建立 MCF-7細(xì)胞接種于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清、100 U/mL的鏈霉素、100 U/mL的青霉素)，在37 ℃、5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞用胰酶消化，離心，制成細(xì)胞懸液，將含1×107個(gè)細(xì)胞的懸液200 μL接種于裸鼠右側(cè)腋下近上肢處成瘤。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為裸鼠移植瘤長徑≥5 mm。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與SAMC用法 將造模成功的24只裸鼠隨機(jī)分為對照組、低劑量SAMC組、高劑量SAMC組和紫杉醇組。對照組給予0.9% NaCl注射液，0.2 mL/次；低劑量SAMC組給予150 mg/kg的SAMC；高劑量SAMC組給予300 mg/kg的SAMC；紫杉醇組給予10 mg/kg的紫杉醇。各組每周腹腔注射3次，隔2 d注射1次，每次注射前稱重，共給藥3周。干預(yù)期間觀察裸鼠生長狀態(tài)。

1.4 瘤重測量及腫瘤抑制率測算 各組于末次給藥后第2天采用0.2%水合氯醛麻醉取瘤，脫頸法處死全部裸鼠。完整分離腫瘤組織，稱瘤重，計(jì)算各組腫瘤抑制率，腫瘤抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組瘤重/對照組瘤重)×100%。

1.5 腫瘤組織病理觀察 將腫瘤組織蠟塊固定于切片機(jī)上進(jìn)行切片，然后進(jìn)行脫蠟及水化、蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色、脫水透明及封片，鏡下觀察各組切片中腫瘤組織病理變化，拍照。

1.6 腫瘤組織中VEGF、Caspase-3蛋白檢測 將石蠟包埋的腫瘤標(biāo)本做4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟水化，微波修復(fù)抗原，3%H2O2室溫孵育7 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加10%山羊血清封閉，加1∶100稀釋的一抗，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS洗滌后加二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記)，DAB顯色2～4 min，蘇木素復(fù)染，樹脂封片，鏡下觀察拍照。圖片收集后用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白陽性表達(dá)區(qū)域的積分密度值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組瘤重和腫瘤抑制率比較 SAMC干預(yù)后裸鼠皮下移植瘤的生長速度減緩，并隨SAMC濃度的升高移植瘤生長速度受抑制越明顯。對照組、低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組瘤重分別為(3.05±0.26)、(2.36±0.18)、(2.09±0.14)、(1.92±0.16)g，低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組瘤重低于對照組(P均<0.05)。低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組抑瘤率分別為22.62%±0.28%、31.48%±0.23%、37.05%±0.12%，高劑量SAMC組腫瘤抑制率高于低劑量SAMC組(P<0.05)，但與紫杉醇組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組腫瘤組織病理變化 對照組腫瘤組織細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞體積增大形態(tài)不規(guī)則。低劑量SAMC組中組織細(xì)胞排列疏松，出現(xiàn)較為分散的小面積的細(xì)胞壞死。高劑量SAMC組出現(xiàn)較大面積的細(xì)胞壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失。紫杉醇組細(xì)胞壞死更為徹底，壞死區(qū)呈均質(zhì)紅染。見圖1。

注：A為對照組；B為低劑量SAMC組；C為高劑量SAMC組；D為紫杉醇組。

圖1各組腫瘤組織病理變化(箭頭指示壞死區(qū))

2.3 各組腫瘤組織中Caspase-3、VEGF蛋白表達(dá)比較 鏡下觀察到Caspase-3蛋白表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)及部分胞膜，陽性表達(dá)產(chǎn)物染色后呈現(xiàn)棕黃色(見圖2)。VEGF表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，鏡下見棕黃色顆粒，呈團(tuán)塊狀或片狀分布(見圖3)。對照組、低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組腫瘤組織中Caspase-3蛋白相對表達(dá)量分別為9 763±814、13 626±912、16 732±631、18 955±738，VEGF蛋白相對表達(dá)量分別為8 810±625、6 979±780、4 945±537、3 231±569。對照組、低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組腫瘤組織中Caspase-3蛋白相對表達(dá)量依次升高，VEGF相對表達(dá)量依次降低(P均<0.05)。

注：A為對照組；B為低劑量SAMC組；C為高劑量SAMC組；D為紫杉醇組。

圖2各組腫瘤組織Caspase-3蛋白表達(dá)情況

注：A為對照組；B為低劑量SAMC組；C為高劑量SAMC組；D為紫杉醇組。

圖3各組腫瘤組織中VEGF蛋白表達(dá)情況

3 討論

目前天然植物提取物以其抗腫瘤效果好、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)成為抗惡性腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。大蒜中所含有的多種含硫化合物活性成分不僅可預(yù)防癌癥發(fā)生，還具有抗腫瘤作用。流行病學(xué)調(diào)查研究表明大蒜的攝入量與許多惡性腫瘤發(fā)病率呈反比[10]。SAMC作為大蒜主要活性成分之一，其抗腫瘤作用已得到廣泛證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)通過建立乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，應(yīng)用不同濃度劑量SAMC進(jìn)行干預(yù)，觀察其體內(nèi)抗腫瘤作用并探索可能的機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，對照組瘤重高于其余三組，高劑量SAMC組腫瘤抑制率高于低劑量SAMC組，但與紫杉醇組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；腫瘤組織HE染色見低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞壞死，三組壞死面積和程度依次增大。這初步證實(shí)了SAMC可顯著抑制乳腺癌裸鼠皮下移植瘤生長，提示SAMC在裸鼠體內(nèi)可發(fā)揮抗腫瘤作用。

為進(jìn)一步探討SAMC的抑瘤作用機(jī)制，我們采用免疫組化法檢測了腫瘤組織中的Caspase-3蛋白和VEGF蛋白。Caspase家族是一組半胱氨酸蛋白酶，特異性切割天冬氨酸，在細(xì)胞凋亡過程中有重要作用。目前研究[11，12]表明Caspase-3處于依賴Caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)的3條凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是最重要的細(xì)胞凋亡過程中的效應(yīng)分子。本研究結(jié)果顯示低劑量SAMC組、高劑量SAMC組及紫杉醇組Caspase-3蛋白表達(dá)水平均高于對照組，且高劑量SAMC組高于低劑量SAMC組，但低于紫杉醇組，提示SAMC可提高乳腺癌組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。同時(shí)，有研究表明SAMC可以通過上調(diào)p53、p21表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，觸發(fā)線粒體凋亡途徑等機(jī)制誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[13]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤的增殖、浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特性均以有效血液供應(yīng)為基礎(chǔ)[14]。新生小血管為腫瘤組織快速生長提供所需營養(yǎng)物質(zhì)[15]。VEGF作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可強(qiáng)烈促進(jìn)其有絲分裂，促使新血管形成，已被認(rèn)為是促進(jìn)惡性腫瘤血管生成的最強(qiáng)細(xì)胞因子[16，17]。研究表明，VEGF不僅可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性，還可上調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而間接起到促腫瘤細(xì)胞增殖及生長的作用[18，19]。近來相關(guān)研究提示VEGF可能參與了惡性腫瘤的演變過程，并且與乳腺癌惡性程度有一定的相關(guān)性[20]。本研究觀察了各組腫瘤組織中VEGF的表達(dá)變化，結(jié)果顯示低劑量SAMC組、高劑量SAMC組及紫杉醇組Caspase-3蛋白表達(dá)水平均低于對照組，高劑量SAMC組低于低劑量SAMC組，但高于紫杉醇組，提示SAMC可能通過下調(diào)乳腺癌組織中VEGF的表達(dá)，抑制組織內(nèi)新血管的生成能力，使腫瘤組織營養(yǎng)供給不足，進(jìn)而抑制其生長并促進(jìn)組織壞死。

綜上所述，SAMC可抑制乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長，機(jī)制可能與Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)、VEGF蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。在接下來的研究中，我們將進(jìn)一步深入探索SAMC抑制乳腺癌的相關(guān)分子機(jī)制，為研發(fā)新抗腫瘤藥物、探索抗腫瘤治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.010

R737.9

A

1002-266X(2017)39-0036-03

蔡海峰(E-mail: 13303050005@163.com)

2017-06-10)