RRM2基因過(guò)表達(dá)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的構(gòu)建及對(duì)順鉑敏感性觀察

王中山，張夢(mèng)，張冬梅，楊新慧

(1徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州221004；2徐州市中心醫(yī)院)

·基礎(chǔ)研究·

RRM2基因過(guò)表達(dá)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的構(gòu)建及對(duì)順鉑敏感性觀察

王中山1，張夢(mèng)2，張冬梅2，楊新慧2

(1徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州221004；2徐州市中心醫(yī)院)

目的構(gòu)建核糖核苷酸還原酶亞基M2(RRM2)基因過(guò)表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，并觀察RRM2基因過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。方法提取SKOV3細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以其為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得RRM2基因。通過(guò)酶切(XhoⅠ、BamHⅠ)連接的方法，將RRM2基因插入慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-ZsGreen1中，得到重組質(zhì)粒pLVX-IRES-RRM2。利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，包埋病毒。將SKOV3細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染pLVX-IRES-RRM2慢病毒，96 h后測(cè)算慢病毒感染效率。對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用Western blotting法檢測(cè)兩組細(xì)胞中的RRM2蛋白；流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組凋亡細(xì)胞與死亡細(xì)胞，反映細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。結(jié)果重組質(zhì)粒pLVX-IRES-RRM2經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證，各片段大小符合預(yù)期，測(cè)序結(jié)果顯示RRM2基因序列正確。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞中RRM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.280±0.055、0.102±0.022，RRM2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.582±0.049、0.228±0.032，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，說(shuō)明RRM2基因過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組凋亡細(xì)胞比例分別為0.39%±0.08%、9.60%±1.20%，死亡細(xì)胞比例分別為26.65%±2.20%、44.96%±2.80%，實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞比例和死亡細(xì)胞比例均低于對(duì)照組(P均<0.01)。結(jié)論成功構(gòu)建了RRM2基因過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞，RRM2基因過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低。

卵巢癌；卵巢癌細(xì)胞株；核糖核苷酸還原酶家族成員2；順鉑；藥物耐受性；藥物敏感性

卵巢癌是常見(jiàn)的婦科腫瘤，病死率位居?jì)D科惡性腫瘤之首[1]，多數(shù)(85%)為上皮性卵巢癌(EOC)[2]。卵巢癌主要的治療手段為最大程度的減瘤術(shù)繼之以鉑類為主的化療[3,4]。但卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑等化療藥物存在耐受性[5]，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)率高，患者3年生存率較低[6]。順鉑耐藥的一個(gè)重要因素是DNA損傷修復(fù)。順鉑誘發(fā)的DNA損傷以30 nt單鏈的形式被從基因組切除[7，8]，隨后單鏈間隙由聚合酶填補(bǔ)，形成完整無(wú)錯(cuò)的DNA。為了修復(fù)損傷的DNA，細(xì)胞將通過(guò)p53調(diào)控核糖核苷酸還原酶(RNR)增加脫氧核糖核苷酸(dNTP)的合成[9,10]。RNR由兩個(gè)核糖核苷酸還原酶家族成員(RRM)1大亞基和兩個(gè)RRM2小亞基組成，能催化核糖核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)閐NTP，為DNA復(fù)制和修復(fù)提供原料[11,12]。RRM1在不同的細(xì)胞周期均穩(wěn)定表達(dá)，且表達(dá)量超過(guò)RRM2；而RRM2表達(dá)量則隨著細(xì)胞周期波動(dòng)較大，并決定了RNR活性[11～16]。因此，RRM2在DNA損傷的修復(fù)過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用，其在所有物種中高度保守，表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控[17,18]。本研究構(gòu)建了RRM2基因慢病毒過(guò)表達(dá)載體，包埋病毒，感染卵巢癌細(xì)胞SKOV3，觀察RRM2基因過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑藥物敏感性的變化，為闡明RRM2參與卵巢癌細(xì)胞耐藥的機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、293FT、大腸桿菌DH5α、pLVX-IRES-ZsGreen1、psPAX2和pMD2.G病毒載體均為本實(shí)驗(yàn)室保持。pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ購(gòu)自Fermentas公司。RRM2一抗(兔源)和二抗(羊抗兔IgG)、GAPDH一抗和二抗均購(gòu)自Abcam公司。凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Beyotime公司。引物合成與測(cè)序由金唯智(蘇州)公司完成。所用試劑均為分析純。

1.2 RRM2基因過(guò)表達(dá)慢病毒的制備 RRM2基因上游引物序列為5′-CGTCCTCGAGATGCTCTCCCTCCGTGTCCC-3′，下游引物序列為5′-CGTCGGATCCTTAGAAGTCAGCATCCAAGGTAAAA-3′。TRIzol試劑提取卵巢癌細(xì)胞株SKOV3總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到RRM2基因，并在基因兩端插入XhoI、BamHI酶切位點(diǎn)。通過(guò)酶切連接的方法將RRM2基因插入慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-ZsGreen1(Clontech)中，得到重組質(zhì)粒pLVX-IRES-RRM2。重組子質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定后送測(cè)序。于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)板接種293FT細(xì)胞，在細(xì)胞匯合度為80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pLVX-IRES-RRM2、psPAX2和pMD2.G，96 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，隨后用濃縮管在4 000 g、4 ℃下離心濃縮并進(jìn)行滴度測(cè)定，分裝成小份于-80 ℃保存。

1.3 RRM2基因過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞的構(gòu)建 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3用含有10%小牛血清的RMPI1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶壁的80%～90%，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍，去除細(xì)胞碎片及殘余培養(yǎng)基，加入胰酶。將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓，加入含血清培養(yǎng)液終止胰酶消化。反復(fù)輕輕吹打細(xì)胞，傳代，分裝。將重懸液轉(zhuǎn)入離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入PBS重懸細(xì)胞、離心，重復(fù)3遍，洗凈胰酶及血清。加入PBS重懸細(xì)胞，并將懸液移入無(wú)菌EP管中，離心棄上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩KOV3細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLVX-IRES-RRM2，并于轉(zhuǎn)染96 h后，利用表達(dá)載體中的報(bào)告基因(EGFP)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察卵巢癌細(xì)胞的慢病毒感染效率。對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用RT-PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞中RRM2 mRNA。RRM2基因上游引物序列為5′-CGCTTTGTCATCTTCCC-3′，下游引物序列為5′-CATAAAGTCAAATGGGTTCT-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，下游引物序列為5′-GCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。采用Western blotting法檢測(cè)兩組細(xì)胞中的RRM2蛋白：使用胰蛋白酶消化、并離心收集細(xì)胞，棄上清液，細(xì)胞沉淀中加入裂解液重懸，獲得SKOV3細(xì)胞總蛋白；通過(guò)SDS-PAGE分離不同分子量的蛋白質(zhì)，然后通過(guò)半干轉(zhuǎn)/濕轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；將膜用含有5%脫脂奶粉的PBS室溫孵育2 h，加入一抗于4 ℃孵育過(guò)夜，隨后PBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育1 h，PBST再次洗膜；加入發(fā)光液，X線片曝光、顯影、定影，掃描圖像，采用Image J軟件分析圖像，得出RRM2蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 RRM2基因過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性觀察 將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞分別以3 μg/mL的順鉑處理48 h，按照Annexin V-FITC試劑盒進(jìn)行操作：將收集的細(xì)胞用4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液洗2次，再重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管內(nèi)；用400目篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，除去細(xì)胞碎片及成團(tuán)細(xì)胞；1 000 r/min離心5 min，去上清；1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×106個(gè)/mL；取300 μL的細(xì)胞懸液于流式管中；加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；上機(jī)前5 min再加入5 μL的碘化丙錠溶液(PI)染色。上機(jī)前，補(bǔ)加200 μL的1×結(jié)合緩沖液，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

2 結(jié)果

重組質(zhì)粒pLVX-IRES-RRM2經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoI和BamHI雙酶切驗(yàn)證，各片段大小符合預(yù)期(圖1)，測(cè)序結(jié)果顯示RRM2基因序列正確。RRM2基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 170 bp，編碼389個(gè)氨基酸，其蛋白質(zhì)分子量為44.8 kD。熒光顯微鏡觀察SKOV3細(xì)胞的慢病毒感染效率達(dá)到40%，可應(yīng)用于后續(xù)研究。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞中RRM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.280±0.055、0.102±0.022，RRM2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.582±0.049、0.228±0.032，兩組相比，P均<0.01。說(shuō)明RRM2基因過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞構(gòu)建成功。見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組凋亡細(xì)胞比例分別為0.39%±0.08%、9.60%±1.20%，死亡細(xì)胞比例分別為26.65%±2.20%、44.96%±2.80%，實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞比例和死亡細(xì)胞比例均低于對(duì)照組(P均<0.01)。

注：M為Marker；1為pLVX-IRES-RRM2質(zhì)粒的XhoⅠ單酶切產(chǎn)物；2為pLVX-IRES-RRM2質(zhì)粒的XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切產(chǎn)物；3為RRM2基因的PCR產(chǎn)物。

圖1RRM2病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證情況

注：A為RRM2蛋白檢測(cè)結(jié)果；B為RRM2 mRNA檢測(cè)結(jié)果；M為Marker；1為實(shí)驗(yàn)組；2為對(duì)照組。

圖2實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中RRM2蛋白、mRNA表達(dá)情況

3 討論

多年來(lái)，盡管惡性腫瘤相關(guān)研究取得了很大的進(jìn)展，但卵巢癌患者的5年生存率仍保持在30%左右，對(duì)順鉑等化療藥物的耐受可能是卵巢癌患者死亡的重要因素。因此，闡明卵巢癌耐藥的分子機(jī)制，尋找耐藥相關(guān)基因?qū)τ诼殉舶┑呐R床治療具有重要意義。

RRM2基因編碼的蛋白質(zhì)亞基是DNA合成和修復(fù)的限速單位，在RNR催化核糖核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)閐NTP過(guò)程中必不可少，而dNTP是DNA復(fù)制和修復(fù)的原料。RRM2表達(dá)量則隨著細(xì)胞周期波動(dòng)較大，調(diào)控了RNR的催化活性。正因?yàn)槌休d著這種至關(guān)重要的功能，RRM2在細(xì)胞增殖和DNA損傷的修復(fù)過(guò)程中具有舉足輕重的作用。

順鉑是腫瘤治療常用的一線化療藥物，其主要是通過(guò)結(jié)合到DNA的雙分子鏈上，抑制DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等功能，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。順鉑損傷DNA后，腫瘤細(xì)胞本身將啟動(dòng)切除修復(fù)等機(jī)制，剪切掉順鉑結(jié)合的DNA區(qū)域，消除順鉑對(duì)細(xì)胞的殺傷作用，而切除后的DNA鏈則亟需dNTP原料進(jìn)行修復(fù)，所以RRM2在順鉑所造成的DNA損傷修復(fù)過(guò)程中也是必需的。RRM2基因很可能在卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥過(guò)程中扮演著重要角色。

前期研究證實(shí)，RRM2在耐藥卵巢癌患者的組織和血液中均高表達(dá)[19,20]，而RRM2表達(dá)與患者的5年生存率呈負(fù)相關(guān)，即RRM2表達(dá)量越高則患者可能因耐藥等因素導(dǎo)致的死亡發(fā)生越早[2]。為了深入研究RRM2在卵巢癌順鉑耐藥機(jī)制中的作用，我們構(gòu)建了RRM2基因慢病毒過(guò)表達(dá)載體，感染卵巢癌細(xì)胞SKOV3，結(jié)果顯示，感染慢病毒后SKOV3細(xì)胞中RRM2蛋白表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明慢病毒載體的構(gòu)建和病毒包埋都是成功的，這也為后續(xù)RRM2的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果還顯示，RRM2基因過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性明顯降低。在同樣濃度的順鉑作用下，實(shí)驗(yàn)組死亡細(xì)胞比例和凋亡細(xì)胞比例均低于對(duì)照組，說(shuō)明RRM2過(guò)表達(dá)在卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥過(guò)程中發(fā)揮了重要作用?？紤]到RRM2的主要功能是參與dNTP的合成，我們推測(cè)，RRM2基因過(guò)表達(dá)能夠提高卵巢癌細(xì)胞內(nèi)dNTP水平，為順鉑所造成的DNA損傷的修復(fù)過(guò)程提供充足原料；DNA損傷修復(fù)以后，卵巢癌細(xì)胞的凋亡和死亡趨勢(shì)得到緩解，從而降低了順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

總之，本研究成功構(gòu)建了RRM2過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞，并初步證實(shí)RRM2過(guò)表達(dá)能夠使卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明RRM2基因參與卵巢癌細(xì)胞耐藥的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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