二氯乙酸對膀胱癌細(xì)胞株T24增殖、凋亡的影響及其機(jī)制探討

謝智彬，付偉金，陸春宇，楊小麗，李佳桐，趙東

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021；2廣西醫(yī)科大學(xué))

二氯乙酸對膀胱癌細(xì)胞株T24增殖、凋亡的影響及其機(jī)制探討

謝智彬1，付偉金1，陸春宇1，楊小麗2，李佳桐2，趙東2

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021；2廣西醫(yī)科大學(xué))

目的觀察二氯乙酸(DCA)對膀胱癌細(xì)胞株T24增殖、凋亡的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。方法培養(yǎng)T24細(xì)胞并隨機(jī)分成4個(gè)組，其中實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組和實(shí)驗(yàn)3組分別加入含5、10、20 mmol/L DCA的培養(yǎng)基，對照組加入等量含0.1% DMSO的培養(yǎng)基。分別于給藥24、48、72 h后采用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力。給藥48 h后，行Hoechst33258熒光染色觀察并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，采用JC-1染色法檢測細(xì)胞線粒體膜電位，采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞中的Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白。結(jié)果實(shí)驗(yàn)1、2、3組給藥24、48、72 h細(xì)胞增殖能力均低于對照組，且隨著DCA作用時(shí)間濃度增大、給藥時(shí)間延長，細(xì)胞增殖抑制越明顯(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)1、2、3組凋亡細(xì)胞數(shù)均高于對照組，線粒體膜電位均低于對照組(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)1、2、3組細(xì)胞中Bax、Caspase-3相對表達(dá)量高于對照組，Bcl-2相對表達(dá)量低于對照組(P均<0.05)。結(jié)論DCA可抑制膀胱癌細(xì)胞株T24的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，推測作用機(jī)制與線粒體膜電位降低、Bcl-2表達(dá)下調(diào)及Bax、Caspase-3表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

二氯乙酸；膀胱癌；膀胱癌細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；線粒體膜電位

在歐美地區(qū)，膀胱癌是泌尿系腫瘤中最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均居泌尿系腫瘤首位[1]。在我國，膀胱癌發(fā)病率也有逐步上升的趨勢[2]。膀胱癌的主要治療方法是經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切除(TURB-t)，術(shù)后輔助化療。但傳統(tǒng)化療會(huì)引起患者局部及全身一系列不良反應(yīng)，如膀胱刺激、過敏反應(yīng)及骨髓抑制等。因此尋找低毒、廉價(jià)、高效的新型化療替代藥是當(dāng)前抗膀胱癌研究的熱點(diǎn)。二氯乙酸(DCA)是一種小分子代謝調(diào)節(jié)劑，臨床上主要用于治療乳酸中毒和線粒體遺傳性疾病[3]。DCA通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶，激活丙酮酸脫氫酶，促使更多丙酮酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化磷酸化[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)DCA能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5～8]，但有關(guān)DCA對膀胱癌的作用目前報(bào)道較少。2016年5～12月，我們觀察了不同濃度DCA對膀胱癌T24細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 DCA、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、PBS、Hoechst33258染料、JC-1試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、BCA試劑盒購自Sigma公司；β-actin、Bax、Bcl-2及Caspase-3兔抗人多克隆抗體購自美國abcam公司。CKX41倒置顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 膀胱癌細(xì)胞株T24購于中國科學(xué)院。T24細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液的RPMI1640培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的T24細(xì)胞，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)1、2、3組和對照組。

1.3 DCA對T24細(xì)胞增殖能力的影響觀察 采用MTT法。將T24細(xì)胞以4×103/孔均勻接種于96孔板，終體積為200 μL/孔。恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)1、2、3組分別加入含5、10、20 mmol/L二氯乙酸的培養(yǎng)基，對照組加入等量含0.1% DMSO的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后按20 μL/孔將5 mg/mL的MTT溶液加入培養(yǎng)孔。將培養(yǎng)板置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液。每孔加入200 μL的DMSO，室溫避光震蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測定490 nm波長處各孔的光密度值(OD值)，以此表示細(xì)胞的增殖能力。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取均值。

1.4 DCA對T24細(xì)胞凋亡的影響觀察 采用Hoechst33258熒光染色法。取對數(shù)生長期的T24細(xì)胞均勻接種于底面鋪有無菌蓋玻片的6孔板中，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后各組按“1.3”的方法添加藥物繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，PBS潤洗后加入4%多聚甲醛常溫固定10 min，再用配置好的Hoechst33258工作液避光孵育10 min，PBS潤洗，取出蓋玻片，用抗熒光淬滅封片。熒光顯微鏡下(200×)觀察細(xì)胞核變化，計(jì)算凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 DCA對T24細(xì)胞線粒體膜電位的影響觀察 收集“1.4”培養(yǎng)48 h后的各組細(xì)胞，PBS清洗3次，加入500 μL的JC-1工作液，于37 ℃、5% CO2避光孵育20 min，棄去上清液，PBS潤洗3次，熒光顯微鏡下觀察，用白光、488 nm激光、530 nm激光三通道中速掃描細(xì)胞，采集圖片。當(dāng)細(xì)胞線粒體膜電位水平升高時(shí)，JC-1主要以聚合體形式存在，呈紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位水平降低時(shí)，JC-1主要以單體形式存在，呈綠色熒光。用Image Pro Plus6.0軟件分析細(xì)胞內(nèi)紅色、綠色熒光強(qiáng)度，以紅色熒光與綠色熒光強(qiáng)度的比值代表線粒體膜電位水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.6 DCA對T24細(xì)胞中Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)的影響觀察 采用Western blotting法。收集“1.4”培養(yǎng)48 h后的4組細(xì)胞，PBS潤洗后加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，4 ℃裂解30 min,高速離心后取上清液。按BCA試劑盒說明書測定總蛋白濃度后加入適量蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱10 min使蛋白變性后分裝，-20 ℃保存。取60 μg總蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST潤洗后分別加β-actin、Bax、Bcl-2和Caspase-3抗體4 ℃孵育過夜，抗體稀釋度均為1∶1 000。TBST潤洗5 min×5次，常溫?fù)u床下孵育二抗(1∶5 000)1 h；TPBS溶液洗膜5 min×5次，用雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃膜。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 實(shí)驗(yàn)1、2、3組給藥24、48、72 h細(xì)胞增殖能力均低于對照組，且隨著DCA作用時(shí)間濃度增大、給藥時(shí)間延長，細(xì)胞增殖抑制越明顯(P均<0.05)。詳見表1。

表1 兩組細(xì)胞OD值比較

注：與對照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組同時(shí)點(diǎn)相比，△P<0.05；與實(shí)驗(yàn)2組同時(shí)點(diǎn)相比，△△P<0.05；與同組給藥24 h時(shí)相比，#P<0.05；與同組給藥48 h時(shí)相比，##P<0.05。

2.2 各組凋亡細(xì)胞數(shù)比較 實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、對照組給藥48 h后T24細(xì)胞凋亡數(shù)分別為(9±1.83)、(26.5±5.8)、(48.75±2.99)、(3.25±0.96)個(gè)/HP，實(shí)驗(yàn)1、2、3組凋亡細(xì)胞數(shù)均高于對照組(P均<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞線粒體膜電位比較 實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、對照組細(xì)胞線粒體膜電位分別為1.32±0.21、0.87±0.13、0.53±0.16、1.73±0.12，實(shí)驗(yàn)1、2、3組線粒體膜電位均低于對照組(P均<0.05)。

2.4 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)1、2、3組細(xì)胞中Bax、Caspase-3相對表達(dá)量高于對照組，Bcl-2相對表達(dá)量低于對照組(P均<0.05)。詳見表2、圖1～3。

表2 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3相對 表達(dá)量比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

圖1 各組細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)情況

圖2 各組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)情況

圖3 各組細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)情況

3 討論

膀胱癌是源于膀胱黏膜上皮的惡性腫瘤，多以移行細(xì)胞癌為主，發(fā)病因素多與長期吸煙、職業(yè)暴露、感染等有關(guān)[9]。膀胱癌早期癥狀不典型，臨床上早期診斷困難，治療效果欠佳，且易復(fù)發(fā)，預(yù)后差。目前膀胱癌TURB-t術(shù)后輔行膀胱化療，但常規(guī)化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)引起患者局部及全身一系列不良反應(yīng)，如過敏反應(yīng)、骨髓抑制及膀胱刺激等，嚴(yán)重?fù)p害患者生活質(zhì)量，甚至影響治療進(jìn)程。DCA是一種用于治療新陳代謝紊亂癥的小分子代謝調(diào)節(jié)劑，為丙酮酸脫氫酶激酶的抑制劑，可使丙酮酸脫氫酶激活，促進(jìn)更多丙酮酸進(jìn)入線粒體，抑制糖酵解，減少乳酸堆積，使微環(huán)境不利于腫瘤生存[10]；同時(shí)大量釋放大量自由基降低膜電位，啟動(dòng)線粒體介導(dǎo)的凋亡通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。DCA對多種惡性腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤效應(yīng)，如腎癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌等[5～8]，但對健康細(xì)胞卻無損害。本研究結(jié)果顯示，DCA對膀胱癌T24細(xì)胞具有顯著的增殖抑制效應(yīng)，且呈時(shí)間和劑量依賴性。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞程序性死亡，凋亡調(diào)控異常在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中占有重要地位。凋亡信號(hào)通路是目前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)[12]。細(xì)胞凋亡主要包括線粒體/細(xì)胞色素C介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)途徑和膜死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞外凋亡途徑[13]。Bax、Bcl-2是調(diào)控線粒體凋亡通路的關(guān)鍵凋亡蛋白。Bcl-2是抗凋亡基因，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，Bax蛋白卻可抑制Bcl-2的活性。Bax和Bcl-2可通過改變線粒體膜通透性和細(xì)胞色素C的釋放，影響下游區(qū)Caspase-3的活性從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14，15]；當(dāng)細(xì)胞受外信號(hào)刺激后，促使膜死亡受體與Caspase-3家族前體蛋白結(jié)合，啟動(dòng)Caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3，降解細(xì)胞內(nèi)蛋白而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，DCA能誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡，且隨DCA濃度升高，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，呈劑量依賴性，與MTT結(jié)果相符。上述結(jié)果提示DCA是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制T24細(xì)胞增殖。

孫潔等[16]通過Hoechst3342染色觀察發(fā)現(xiàn)，DCA可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡，且聯(lián)合順鉑用藥后則凋亡細(xì)胞明顯增多，認(rèn)為DCA的促凋亡作用與線粒體跨膜電位降低和Bcl-2表達(dá)下調(diào)等有關(guān)。Kinnaird等[7]研究發(fā)現(xiàn)DCA能夠抑制腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞株增殖，其可能機(jī)制是激活線粒體代謝功能(如增強(qiáng)細(xì)胞有氧呼吸、促進(jìn)三羧酸循環(huán)代謝、增加線粒體活性氧水平)同時(shí)增強(qiáng)p53的活性。DCA還可通過mTOR通路抑制腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬[17，18]。Tong等[19]研究發(fā)現(xiàn)DCA能協(xié)同5-FU抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，并通過線粒體凋亡通路下調(diào)Bcl-2表達(dá)、上調(diào)Bax、Caspase-3表達(dá)從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

研究[20]表明，線粒體膜電位降低是細(xì)胞凋亡的早期表現(xiàn)，即提示細(xì)胞凋亡的開始。我們用不同濃度的DCA作用于T24細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨DCA濃度增加，細(xì)胞線粒體膜電位依次降低，提示DCA可誘導(dǎo)T24細(xì)胞早期凋亡，這可能與DCA降低T24細(xì)胞線粒體膜電位作用有關(guān)。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，隨著DCA作用濃度升高，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量依次升高，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量依次降低，提示DCA對膀胱癌細(xì)胞的增殖抑制、促凋亡作用可能與Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

綜上所述，DCA可抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，推測其作用機(jī)制與降低線粒體膜電位、下調(diào)Bcl-2表達(dá)及上調(diào)Bax、Caspase-3表達(dá)有關(guān)。上述研究結(jié)果為DCA用于膀胱癌的治療提供了理論基礎(chǔ)。

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EffectsofdichloroacetateonproliferationandapoptosisofbladdercancerT24cells

XIEZhibin1,FUWeijin,LUChunyu,YANGXiaoli,LIJiatong,ZHAODong

(1TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

ObjectiveTo observe the effects of dichloroacetate (DCA) on the proliferation and apoptosis of bladder cancer cells T24 in vitro and to study the underlying mechanism.MethodsThe bladder cancer cells T24 were randomly divided into four groups: experimental group 1, experimental group 2, experimental group 3, and the control group. Cells in the experimental groups 1, 2, and 3 were added with 5, 10, and 20 mmol/L DCA, respectively; cells in the control group were added with 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO). The cell proliferation of T24 cells were detected by MTT assay at 24, 48, and 72 h after DCA treatment. At 48 h, the apoptosis was examined by Hoechst33258 staining, the mitochondrial membrane potential was detected by using JC-1 staining, and the expression levels of Bax protein, Bcl-2 protein and Caspase-3 protein were determined by Western blotting.ResultsThe cell proliferation in the experimental groups 1, 2, and 3 was lower than that of the the control group at 24, 48 and 72 h, and with the time and increasing concentrations of DCA, the inhibition of cell proliferation was more significant (allP<0.05). The number of apoptosis cells in the experimental groups 1, 2 and 3 was higher than that of the control group, and the mitochondrial membrane potential was lower than that of the control group (allP<0.05). Compared with the control group, the expression of Bax protein and Caspase-3 protein significantly increased, while the expression of Bcl-2 protein significantly decreased in the experimental groups 1, 2, and 3 (allP<0.05).ConclusionsDCA can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of bladder cancer cell line T24, which suggests that the mechanism may be related to the decrease of mitochondrial membrane potential level, up-regulation of Bax protein and Caspase-3 protein, and down-regulation of Bcl-2 protein.

dichloroacetate; bladder carcinoma; bladder carcinoma cells; cell proliferation; apoptosis; mitochondrial membrane potential

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.003

R737.14

A

1002-266X(2017)39-0011-04

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015GXNSFAA139180)。

謝智彬(1990-)，男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)榘螂装┑幕A(chǔ)和臨床。E-mail: 2970849596@qq.com

付偉金(1978-)，男，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)榘螂装┑幕A(chǔ)與臨床。E-mail: fuwj66@aliyun.com

2017-05-29)