CYP450、GSTs、UGT基因多態(tài)性與抗結(jié)核藥物肝損傷的關(guān)系

孫淑豐，李標(biāo)，崇英之，杜瑩

(華北理工大學(xué)，河北唐山063210)

CYP450、GSTs、UGT基因多態(tài)性與抗結(jié)核藥物肝損傷的關(guān)系

孫淑豐，李標(biāo)，崇英之，杜瑩

(華北理工大學(xué)，河北唐山063210)

目的探討細(xì)胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)基因多態(tài)性及其交互作用與抗結(jié)核藥物性肝損傷(ADLI)發(fā)生的關(guān)系。方法選擇接受抗結(jié)核化療6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)肝損傷的漢族結(jié)核病患者207例納入病例組，以同期治療中未出現(xiàn)肝功能異常的結(jié)核病患者207例為對(duì)照組。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法觀察CYP1A2 734C/A、CYP3A4 18B-20232G/A、CYP3A5 3-6986A/G、CYP2C19 681G/A、GSTA1 -69C/T、GSTM3缺失突變、UGT2B7-268A/G、UGT2B7 802C/T位點(diǎn)的多態(tài)性。采用單因素、多因素Logistics回歸分析法分析CYP450、GSTs、UGT基因多態(tài)性與ADLI發(fā)生的關(guān)系。采用多因子降維法分析CYP450、GSTs、UGT基因多態(tài)性位點(diǎn)之間的交互作用與ADLI發(fā)生的關(guān)系。結(jié)果CYP1A2 734C/A的AA基因型、CYP3A4 18B-20232G/A的GA基因型、UGT2B7 -268A/G的AG基因型、UGT2B7 802C/T的TT基因型是ADLI的保護(hù)基因型，而CYP3A5 3-6986A/G的AG及GG基因型、GSTA1 -69C/T的TT基因型則是ADLI的危險(xiǎn)基因型。調(diào)整其他基因多態(tài)性的影響后，發(fā)現(xiàn)CYP3A4*18B -20232G/A、CYP3A5*3 -6986A/G、UGT2B7 -268A/G和UGT2B7 802C/T位點(diǎn)基因多態(tài)性與ADLI的發(fā)生有關(guān)。多因子降維法分析得到UGT2B7 -268A/G、CYP3A4 18B-20232G、CYP3A5 3-6986G組成的3因素模型為最佳模型，檢驗(yàn)樣本準(zhǔn)確度為61.29%，交叉驗(yàn)證一致性為10/10。最佳模型的估計(jì)結(jié)果顯示，與低?；蛐徒M合相比，高危基因型組合顯著增加ADLI的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)論CYP3A4*18B-20232G/A、CYP3A5*3 -6986A/G、UGT2B7 -268A/G、UGT2B7 802C/T位點(diǎn)基因多態(tài)性與ADLI的發(fā)生有關(guān)，且基因位點(diǎn)之間存在交互作用，其中UGT2B7 -268A/G、CYP3A4 18B-20232G、CYP3A5 3-6986G組合將顯著增加ADLI的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

結(jié)核??；抗結(jié)核藥；藥物性肝損傷；藥物代謝酶；細(xì)胞色素P450；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶；基因多態(tài)性

異煙肼、利福平和吡嗪酰胺等抗結(jié)核藥物引發(fā)的抗結(jié)核藥物性肝損傷(ADLI)發(fā)生率居藥物性肝損傷的首位[1,2]。既往研究表明，ADLI的發(fā)生存在明顯的個(gè)體差異，也是導(dǎo)致個(gè)體藥源性疾病風(fēng)險(xiǎn)升高的遺傳基礎(chǔ)之一。藥物在體內(nèi)代謝需借助Ⅰ相代謝酶和Ⅱ相代謝酶的酶解作用。細(xì)胞色素P450(CYP)家族屬于Ⅰ相代謝酶，完成了體內(nèi)60%以上藥物代謝毒物的清除，CYP家族基因CYP1A2、CYP2C19分別占肝臟藥物代謝酶的13%和20%[3]，二者與硫代乙酰胺、乙酰氨基酚、內(nèi)皮素受體拮抗劑等藥物性肝損傷有關(guān)[4～6]，推測(cè)二者可能參與異煙肼代謝。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)是參與藥物體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化與解毒過(guò)程的重要的Ⅱ相代謝酶。GSTA1、GSTM3是GSTs結(jié)合反應(yīng)的關(guān)鍵酶。除UGT1A6、UGT1A7以外[7,8]，UGT2B7的基因多態(tài)性對(duì)藥物代謝也具有重要影響[9]。本研究旨在探討CYP1A2、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C19、GSTA1、GSTM3、UGT2B7基因多態(tài)性及其交互作用與ADLI發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象選自2014年9月～2015年3月唐山市結(jié)核病醫(yī)院確診并接受規(guī)范抗結(jié)核治療的結(jié)核病患者。初治患者基本化療方案為2S(E)HRZ4HR(S為鏈霉素，E為乙胺丁醇，H為異煙肼，R為利福平，Z為吡嗪酰胺)，前2個(gè)月強(qiáng)化，后4個(gè)月鞏固，每日用藥。復(fù)治患者的基本化療方案為2S(E)HRZ4HR，隔日用藥。選擇治療前肝功能指標(biāo)正常，隨訪6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)肝損傷[10]且ALT高于正常值上限3倍的患者納入病例組，共207例。根據(jù)性別比例和城鄉(xiāng)居住地比例相同的原則，選擇隨訪6個(gè)月內(nèi)肝功能未出現(xiàn)異常的207例患者納入對(duì)照組。排除合并可引起肝功能異常的其他疾病或服用其他能引起肝功能異常藥物的患者。

1.2 資料收集 收集兩組患者的年齡、性別、身高、體質(zhì)量、婚姻情況、居住地、吸煙飲酒情況、文化程度、職業(yè)、既往疾病史及用藥情況、抗結(jié)核化療方案、歷次肝功能檢查結(jié)果等資料。收集EDTA抗凝靜脈血3 mL，-20 ℃凍存。

1.3 CYP450、GST、UGT基因多態(tài)性觀察 采用鹽析法提取兩組血細(xì)胞基因組DNA。根據(jù)文獻(xiàn)和基因庫(kù)中人類(lèi)基因序列特性，用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)8個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)(CYP1A2 734C/A、CYP3A4 18B-20232G/A、CYP3A5 3-6986A/G、CYP2C19 681G/A、GSTA1 -69C/T、GSTM3缺失突變、UGT2B7-268A/G、UGT2B7 802C/T)的引物。用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法觀察8個(gè)基因位點(diǎn)的多態(tài)性。以基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。建立最優(yōu)酶切體系，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析。CYP1A2 734C/A上游引物序列為5′-CTACTCCAGCCCCAGAAGTG-3′，下游引物序列為5′-GAAGGGAACAGACTGG GACA-3′，Apa Ⅰ酶切。CYP3A4 18B-20232G/A上游引物序列為5′-CACCCTGATGTCCAGCAGAAACT-3′，下游引物序列為5′-AATAGAAAGCAGATGAACCAGAGAA-3′，Rsa Ⅰ酶切。CYP3A5 3-6986A/G上游引物序列為5′-CATGACTTAGT AGACAGATGAC-3′，下游引物序列為5′-GGTCCAAACAGGGAAGAGATA-3′，Ssp Ⅰ酶切。CYP2C19 681G/A上游引物序列為5′-CAACCAGAGCTTGGCATATT-3′，下游引物序列為5′-TACGCAAGGCAGTCACATAAC-3′，Sma Ⅰ酶切。GSTA1 -69C/T上游引物序列為5′-TGTTGATTGTTTGCCTGAAATT-3′，下游引物序列為5′-GTTAAACGCTGTCACCGTCCT-3′，Hinf Ⅰ酶切。GSTM3缺失突變上游引物序列為5′-ACCCTGCCAT CCTCAAGTGAA-3′，下游引物序列為5′-ATGCTTAGGTCTGAGGAGTAGTAGCCTGCAGAGATAGAGAAG-3′，BamH Ⅰ酶切。UGT2B7-268A/G上游引物序列為5′-TCCAACTGATTGTTATGGTAGAT-3′，下游引物序列為5′-GCTGTT CCTTTCTGTCATTTCTC-3′，BgI Ⅱ酶切。UGT2B7 802C/T上游引物序列為5′-GACAATGGGGAAAGC TGACG-3′，下游引物序列為5′-GTTTGGCAGGTTTGCAGTG-3′，BseG Ⅰ酶切。全部酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker為參照，紫外燈下觀察DNA條帶數(shù)量和分子量大小來(lái)判定結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)錄入Excel2010數(shù)據(jù)表，進(jìn)行整理核對(duì)。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?；蛐头植嫉腍ardy-Weinberg遺傳平衡分析采用擬合優(yōu)度檢驗(yàn)?；蚨鄳B(tài)性與ADLI的關(guān)系采用單因素及多因素Logistics回歸法分析。基因多態(tài)性之間的交互作用分析采用多因子降維法(MDR)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡性分析結(jié)果 Hardy Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察值與理論值近似。對(duì)照組的CYP1A2 734C/A、CYP3A4 18B-20232G/A、CYP3A5 3-6986A/G、CYP2C19 681G/A、GSTA1 -69C/T、GSTM3缺失突變、UGT2B7 -268A/G和UGT2B7 802C/T位點(diǎn)的檢驗(yàn)結(jié)果χ2值分別為0.108、2.740、0.854、2.286、3.534、0.403、3.329和0.169，P均>0.05，提示對(duì)照人群處于平衡狀態(tài)，樣本人群代表性良好。

2.2 CYP450、GST、UGT基因多態(tài)性與ADLI發(fā)生的關(guān)系單因素分析結(jié)果 除性別、城鄉(xiāng)居住地兩個(gè)匹配因素外，兩組婚姻狀況(χ2=3.451，P=0.077)、文化程度(χ2=1.583，P=0.812)、職業(yè)(χ2=0.937，P=0.919)、體質(zhì)量指數(shù)(χ2=1.561，P=0.435)、吸煙情況(χ2=0.060，P=0.841)、飲酒情況(χ2=0.296，P=0.580)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不能認(rèn)為上述因素與ADLI的發(fā)生有關(guān)。非條件Logistics回歸分析結(jié)果顯示，病例組CYP1A2 734C/A的AA基因型、CYP3A4 18B-20232G/A的GA基因型、UGT2B7 -268A/G的AG基因型、UGT2B7 802C/T的TT基因型分布頻率高于對(duì)照組，CYP3A5 3-6986A/G的AG及GG基因型、GSTA1 -69C/T的TT基因型分布頻率低于對(duì)照組(P均<0.05)；CYP1A2 734C/A的AA基因型、CYP3A4 18B-20232G/A的GA基因型、UGT2B7 -268A/G的AG基因型、UGT2B7 802C/T的TT基因型是ADLI的保護(hù)基因型，而CYP3A5 3-6986A/G的AG及GG基因型、GSTA1 -69C/T的TT基因型則是ADLI的危險(xiǎn)基因型。詳見(jiàn)表1～3。

表1 病例組與對(duì)照組CYP450基因多態(tài)性比較(例)

注：以CC基因型為參照，與對(duì)照組比較，*P<0.05，OR為0.460，95%CI為0.251～0.811；以GG基因型為參照，與對(duì)照組比較，#P<0.05，OR為0.570，95%CI為0.358～0.866；以AA基因型為參照，與對(duì)照組比較，△P<0.05，OR分別為4.317、7.120，95%CI分別為1.979～9.378、3.409～15.356。

表2 病例組與對(duì)照組GSTs基因多態(tài)性比較(例)

注：以CC基因型為參照，與對(duì)照組比較，*P<0.05，OR為1.765，95%CI為1.132～2.855。

表3 病例組與對(duì)照組UGT基因多態(tài)性比較(例)

注：以AA基因型為參照，與對(duì)照組比較，*P<0.05，OR為0.389，95%CI為0.245～0.588；以CC基因型為參照，與對(duì)照組比較，#P<0.05，OR為0.458，95%CI為0.234～0.834。

2.3 CYP450、GST、UGT基因多態(tài)性與ADLI發(fā)生的關(guān)系多因素分析結(jié)果 將單因素研究中有意義的危險(xiǎn)因素引入多因素非條件Logistics回歸模型，因變量為服用抗結(jié)核藥后是否發(fā)生肝損傷，自變量為單一藥物代謝酶基因型，協(xié)變量為單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的其他藥物代謝酶基因型。結(jié)果顯示，在調(diào)整其他基因多態(tài)性的影響后，CYP3A4*18B -20232G/A、CYP3A5*3 -6986A/G、UGT2B7-268A/G和UGT2B7 802C/T位點(diǎn)基因多態(tài)性與ADLI的發(fā)生有關(guān)。詳見(jiàn)表4。

2.4 CYP450、GST、UGT基因多態(tài)性位點(diǎn)交互作用與ADLI發(fā)生的關(guān)系 采用MDR法分析8個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)之間的交互作用，估計(jì)了所有2因素到8因素的交互作用模型，得到最佳交互作用模型為UGT2B7 -268A/G、CYP3A4 18B-20232G、CYP3A5 3-6986G組成的3因素模型。該模型的檢驗(yàn)樣本準(zhǔn)確度為61.29%，交叉驗(yàn)證一致性為10/10，經(jīng)1 000次置換檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。最佳模型的估計(jì)結(jié)果顯示，與低?；蛐徒M合相比，高?；蛐徒M合顯著增加ADLI的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。詳見(jiàn)表5。

表4 CYP450、GST、UGT基因多態(tài)性與ADLI發(fā)病的關(guān)系多因素分析結(jié)果

注：各基因位點(diǎn)均以等位基因型為參照。

表5 CYP450、GST、UGT基因多態(tài)性位點(diǎn)交互作用與ADLI發(fā)生的關(guān)系分析結(jié)果

3 討論

多數(shù)抗結(jié)核藥都需要肝臟的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶的催化作用來(lái)完成其代謝轉(zhuǎn)化過(guò)程，如N-乙酰轉(zhuǎn)移酶-2、GSTs、CYP450、UGT等。各種酶的基因表達(dá)均存在遺傳多態(tài)性，酶基因突變可造成其表達(dá)活性改變，導(dǎo)致酶代謝藥物能力改變，從而影響其對(duì)藥物的解毒作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A4*18B -20232G/A、CYP3A5*3 -6986A/G、UGT2B7 -268A/G和UGT2B7 802C/T基因多態(tài)性與ADLI的發(fā)生有關(guān)；CYP1A2 734C/A的AA基因型、CYP3A4 18B-20232G/A的GA基因型、UGT2B7 -268A/G的AG基因型、UGT2B7 802C/T的TT基因型是ADLI的保護(hù)基因型，而CYP3A5 3-6986A/G的AG及GG基因型、GSTA1 -69C/T的TT基因型則是ADLI的危險(xiǎn)基因型。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，多個(gè)基因中存在交互作用，由UGT2B7 -268A/G，CYP3A4 18B-20232G和CYP3A5 3-6986G組成的3因素最佳交互作用模型可增加ADLI的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

CYP450酶系是肝臟中參與藥物代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶系，其活性變化與ADLI的發(fā)生有關(guān)[11]。CYP1A2、CYP2C19作為人體肝臟中重要的氧化還原酶，其活性受藥物、基因等多因素的影響。CYP2C19基因突變對(duì)自身酶活性的影響頗大，我國(guó)漢族人群最常見(jiàn)的突變發(fā)生在681G/A位點(diǎn)，但本研究中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CYP2C19 681G/A位點(diǎn)的基因多態(tài)性與ADLI的發(fā)生有關(guān)，與Tang等[12]的研究結(jié)論基本一致。盡管種族不同，但該位點(diǎn)的遺傳易感性還是類(lèi)似的，提示CYP2C19 681G/A位點(diǎn)的基因突變可能對(duì)ADLI發(fā)病的影響不大。CYP3A5和CYP3A4亦為CYP家族中的重要成員，在藥物代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，CYP3A5*3和CYP3A4*18B基因多態(tài)性可影響藥代動(dòng)力學(xué)，根據(jù)CYP3A5基因型調(diào)整藥物劑量可減少肝移植患者排斥反應(yīng)的發(fā)生率[13]。

GST是肝臟中參與藥物代謝過(guò)程的Ⅱ相代謝酶。國(guó)內(nèi)外關(guān)于GSTM3與ADLI的研究并不多見(jiàn)。但對(duì)已有的GSTM家族與ADLI的關(guān)系，多項(xiàng)研究結(jié)論不一。如印度、中國(guó)臺(tái)北、中國(guó)大陸的研究結(jié)果顯示GSTM1基因多態(tài)性與ADLI的發(fā)生有關(guān)[14]，但在韓國(guó)及印度學(xué)者的研究中卻得到了相反的結(jié)論[15]。本研究尚未得出GSTA1、GSTM3基因多態(tài)性與ADLI的發(fā)生相關(guān)。

UGT是外源物質(zhì)在生物體內(nèi)進(jìn)行Ⅱ相生物轉(zhuǎn)化最重要的代謝酶。UGT2B7主要表達(dá)于肝臟，與藥物解毒和代謝密切相關(guān)。UGT2B7基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)存在高度遺傳多態(tài)性，是決定個(gè)體遺傳易感性的重要基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)UGT2B7 -268、802位點(diǎn)的基因多態(tài)性與ADLI的發(fā)生顯著相關(guān)，UGT2B7基因268位點(diǎn)突變型雜合子AG和802位點(diǎn)突變型純合子TT攜帶者發(fā)生ADLI的危險(xiǎn)性明顯低于野生型攜帶者。

近年研究認(rèn)為，疾病的發(fā)生涉及到多個(gè)遺傳位點(diǎn)多態(tài)性的聯(lián)合作用，即存在基因-基因交互作用。MDR法主要通過(guò)交叉檢驗(yàn)和置換檢驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)交互因子的作用強(qiáng)度，再根據(jù)1/10檢驗(yàn)樣本的平衡檢驗(yàn)誤差、sign檢驗(yàn)的結(jié)果及交叉驗(yàn)證的準(zhǔn)確度來(lái)篩選多變量間的最佳聯(lián)合作用模型。本研究計(jì)算得到的MDR最佳聯(lián)合作用模型為UGT2B7-268A/G、CYP3A4 18B-20232G、CYP3A5 3-6986G的交互作用模型，這也是首次在我國(guó)漢族結(jié)核病人群中發(fā)現(xiàn)以上基因位點(diǎn)之間的交互作用與ADLI的相關(guān)性。

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RelationshipsofCYP450,GSTs,andUGTgenepolymorphismswithanti-tuberculosisdrug-inducedliverinjury

SUNShufeng,LIBiao,CHONGYingzhi,DUYing

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063210,China)

ObjectiveTo investigate the correlations of drug metabolic enzymes cytochrome P450 (CYP450), glutathione S-transferases (GSTs), and uridine diphosphate glycosyltransferase (UGT) gene single nucleotide polymorphisms (SNPs) with anti-tuberculosis drug-induced liver injury (ADLI).MethodsWe selected 207 cases of Han tuberculosis (TB) patients who experienced liver injury within 6 months of anti-TB chemotherapy treatment as the case group and 207 cases of TB patients with no abnormal liver function as the control group. Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was employed to identify the SNPs of CYP1A2 734C/A, CYP3A4 18B-20232G/A, CYP3A5 3-6986A/G, CYP2C19 681G/A, GSTA1 -69C/T, and GSTM3 deletion mutation, and UGT2B7-268A/G and UGT2B7 802C/T. We adopted univariate and multivariate logistic regression methods to discuss the relationships of CYP450, GSTs, and UGT gene SNPs with ADLI. Multifactor dimensionality reduction (MDR) method was used to explore the interaction between ADLI and SNPs.ResultsUnivariate and multivariate logistic regression analysis showed that the genotype AA of CYP1A2 734C/A, the genotype GA of CYP3A4*18B-20232G/A, the genotype AG of UGT2B7-268A/G, and the genotype TT of UGT2B7 802C/T were the protective genotypes of ADLI, and the mutant genotypes AG and GG of CYP3A5*3-6986A/G and the genotype TT of GSTA1-69C/T were the risk genotypes of ADLI. After adjusting the effects of other gene SNPs, we found that CYP3A4*18B-20232G/A, CYP3A5*3-6986A/G, UGT2B7-268A/G, and UGT2B7 802C/T were related to the occurrence of ADLI. A best model consisted of three factors UGT2B7 -268A/G, CYP3A4 18B-20232G, and CYP3A5 3-6986G, with the sample accuracy of 61.29% and the cross-validation consistency of 10/10, was obtained by MDR, and the high risk genotype combination could increase risk of ADLI.ConclusionsCYP3A4*18B-20232G/A, CYP3A5*3-6986A/G, UGT2B7-268A/G, and UGT2B7 802C/T gene SNPs are related to the occurrence of ADLI. Multifactor dimensionality reduction analysis shows that there are gene-gene interactions and the combination of UGT2B7-268A/G, CYP3A4*18B-20232G/A, and CYP3A5*3-6986A/G can increase the risk of ADLI.

tuberculosis; anti-tuberculosis drugs; drug-induced liver injury; drug metabolic enzymes;cytochrome P450; glutathione S-transferases; uridine diphosphate glycosyltransferase; gene polymorphisms

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.002

R575

A

1002-266X(2017)39-0006-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81041096)。

孫淑豐(1965-)，女，本科，主要研究方向?yàn)榧膊】祻?fù)治療。E-mail: sunshufeng@126.com

2017-07-09)