氯胺酮通過改變Fos和Bcl-2表達(dá)減輕缺氧對大鼠海馬群峰電位的抑制*

彭 堅(jiān)， 陳 堃， 廖明鋒， 張志發(fā)， 徐 萍， 李 璐， 吳婭琴， 龍 思， 王學(xué)仁△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉學(xué)教研室，武漢 430030 2武漢市第三醫(yī)院麻醉科，武漢 430060 3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430022

氯胺酮通過改變Fos和Bcl-2表達(dá)減輕缺氧對大鼠海馬群峰電位的抑制*

彭 堅(jiān)1，2， 陳 堃1， 廖明鋒1， 張志發(fā)1， 徐 萍3， 李 璐1， 吳婭琴1， 龍 思1， 王學(xué)仁1△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉學(xué)教研室，武漢 4300302武漢市第三醫(yī)院麻醉科，武漢 4300603華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430022

目的通過觀察氯胺酮處理對缺氧引起的大鼠海馬誘發(fā)群峰電位、神經(jīng)元Fos、Bcl-2表達(dá)的影響，探討氯胺酮對神經(jīng)元缺氧性損傷保護(hù)作用機(jī)制。方法腦片以及培養(yǎng)細(xì)胞隨機(jī)分為3組：對照組(不進(jìn)行缺氧處理)、缺氧組和氯胺酮組(缺氧前于培養(yǎng)液中加入氯胺酮，終濃度為20 μmol/L，其它處理同缺氧組)。腦片記錄：成年雄性Wistar大鼠麻醉后取海馬切片，進(jìn)行CA3區(qū)Schaffer側(cè)支刺激，記錄CA1區(qū)椎體細(xì)胞誘發(fā)電位。新生大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7～11 d，分組處理后進(jìn)行免疫組化染色，計(jì)算Fos、Bcl-2陽性細(xì)胞率。結(jié)果氯胺酮預(yù)處理后，海馬腦片群峰電位開始減小和完全消失的時(shí)間延遲；培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞Fos表達(dá)陽性率、平均吸光度值與缺氧組比較明顯減少(均P<0.05)；海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)陽性率、平均吸光度值與缺氧組比較明顯增加(均P<0.05)。結(jié)論氯胺酮預(yù)處理對大鼠海馬群峰電位的保護(hù)作用可能是通過減少缺氧后Fos表達(dá)、增加Bcl-2表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

氯胺酮； 大鼠海馬神經(jīng)元； Fos； Bcl-2； 群峰電位; 缺氧

圍術(shù)期腦缺血缺氧可以導(dǎo)致暫時(shí)或永久性腦功能障礙，在一些特殊類型手術(shù)如心臟或者頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)，其發(fā)生率可以高達(dá)4%～5%[1-2]。有研究提示氯胺酮可減輕神經(jīng)元缺血缺氧性損傷，有神經(jīng)保護(hù)作用[3-4]。不同腦區(qū)的神經(jīng)元對缺氧損傷的敏感性有一定差異，海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞是對缺氧非常敏感的神經(jīng)元之一，因此海馬神經(jīng)元經(jīng)常被用于缺氧研究[5]。c-fos是一種即刻早期反應(yīng)基因，在神經(jīng)元活動(dòng)時(shí)表達(dá)活躍，被廣泛用作神經(jīng)元活動(dòng)的標(biāo)志物。缺氧可以刺激細(xì)胞c-fos表達(dá)，表達(dá)的Fos蛋白與Jun蛋白形成異源二聚體AP-1，AP-1與DNA特異性位點(diǎn)結(jié)合，對靶基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[6]。Bcl-2是一種線粒體的調(diào)節(jié)因子，調(diào)控線粒體外膜通透性，增加Bcl-2表達(dá)可以抑制缺氧損傷[7]。本研究擬探討氯胺酮處理對缺氧引起的大鼠海馬群峰電位、神經(jīng)元Fos、Bcl-2表達(dá)的影響，探討氯胺酮保護(hù)缺氧性神經(jīng)突觸抑制的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 大鼠海馬腦片制作

取雄性成年Wistar大鼠(同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重120～200 g)，麻醉下斷頭，取腦置于4 ℃、95% O2+5% CO2飽和的人工腦脊液中，仔細(xì)剝出雙側(cè)海馬，垂直于海馬長軸切成400 μm厚度的薄片。將全部腦片置于34℃人工腦脊液內(nèi)，通入95% O2+5% CO2混合氣，孵育1.5～2 h待用。

1.2 原代大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)

取當(dāng)天新生Wistar大鼠(同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，75%乙醇消毒，無菌條件下斷頭取腦，分離出雙側(cè)海馬并剪碎，0.125%胰蛋白酶37℃消化30 min。顯微鏡下觀察，細(xì)胞間連接透亮后終止消化，200 μm濾網(wǎng)篩除未消化的組織塊，收集濾液離心，吸棄上清夜，用種植培養(yǎng)液(DMEM/F12 80%、胎牛血清10%、馬血清10%、谷氨酰胺100 μg/mL，加入青鏈霉素使其終濃度為1%)稀釋細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、10% CO2培養(yǎng)箱，3～5 d后，加入細(xì)胞分裂抑制劑阿糖胞苷3 μg/mL，抑制非神經(jīng)細(xì)胞增殖，作用24 h更換飼養(yǎng)培養(yǎng)液(DMEM/F12 90%、馬血清10%、谷氨酰胺100 μg/mL，加入青鏈霉素使其終濃度為1%)，以后每3 d更換培養(yǎng)液1次，第7～11天備用。

1.3 腦片誘發(fā)電位記錄和實(shí)驗(yàn)分組

孵育后的腦片隨機(jī)分為3組(n=8)：對照組、缺氧組和氯胺酮組。腦片置于半浸式浴槽中，通入95% O2+5% CO2混合氣，流量200 mL/min。由三道電子刺激器(Kohden SEN7130，日本)輸出方波信號(hào)，波寬100 μm，電流強(qiáng)度0.1～0.4 mA。經(jīng)隔離器直徑40 μm的絕緣不銹鋼絲制成的雙極電極，進(jìn)行CA3區(qū)Schaffer側(cè)支刺激，記錄電極為自制玻璃微電極，內(nèi)充4 mol/L NaCl，電極電阻4～15 MΩ，電信號(hào)經(jīng)微電極放大器(Kohden MEZ8201，日本)放大后顯示在示波器(Kohden VC-10)上監(jiān)測，記錄CA1區(qū)椎體細(xì)胞誘發(fā)群峰電位(population spike，PS)，聯(lián)機(jī)存儲(chǔ)處理。對照組：不進(jìn)行缺氧處理；缺氧組：實(shí)驗(yàn)時(shí)通入90% N2+10% CO2200 mL/min混合氣置換，即開始缺氧；氯胺酮組：缺氧前于灌注液加入氯胺酮(批號(hào)：KH091201，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，終濃度為20 μmol/L，隨后處理同缺氧組。記錄群峰電位開始減小和完全消失的時(shí)間。

1.4 培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元免疫組織化學(xué)染色和實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞以5×105～1×106/mL的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組(n=12)：對照組、缺氧組和氯胺酮組。對照組：不進(jìn)行缺氧處理；缺氧組：于培養(yǎng)液中通入90% N2+10% CO250 mL/min缺氧5 min；氯胺酮組：缺氧前1 h，于培養(yǎng)液中加入氯胺酮(批號(hào)：KH091201，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，終濃度為20 μmol/L，隨后處理同缺氧組。按以下程序行免疫組織化學(xué)染色：0.03% H2O2甲醇室溫下孵育30 min，正常單血清1∶10 37 ℃作用1 h；加入羊抗Fos(n=6)或者兔抗Bcl-2(n=6)血清(1∶100)中4℃孵育72 h；生物素化兔抗羊IgG(1∶100)或羊抗兔IgG(1∶100)37 ℃作用1 h；鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(1∶100)37 ℃作用1 h，用葡萄糖氧化酶-硫酸鎳胺法顯色10 min。免疫組織化學(xué)圖像分析：隨機(jī)抽取50個(gè)相鄰視野，在顯微鏡下分別計(jì)數(shù)視野中Fos免疫反應(yīng)和Bcl-2免疫反應(yīng)陽性和陰性神經(jīng)元數(shù)目，計(jì)算陽性神經(jīng)元所占百分比。應(yīng)用TTTY-400TC真彩色細(xì)胞圖像分析儀對各組陽性神經(jīng)元進(jìn)行平均吸光度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮預(yù)處理對缺氧抑制海馬腦片群峰電位的影響

由于海馬CA3區(qū)和CA1區(qū)椎體細(xì)胞之間具有突觸聯(lián)系，當(dāng)局部刺激CA3區(qū)側(cè)支通路時(shí)，在CA1椎體細(xì)胞層可記錄到一個(gè)幅度較大的群峰電位(population spike,PS)，系經(jīng)突觸傳遞誘發(fā)的椎體細(xì)胞群體的細(xì)胞外電位。在PS之前先出現(xiàn)一個(gè)小的去極化電位，為突觸前排放(presynaptic volley，PV)。與以前研究結(jié)果相似，缺氧可以使海馬腦片誘發(fā)電位迅速減小并逐漸消失[8]，我們的觀察發(fā)現(xiàn)缺氧2～3 min后PS波幅即開始降低，時(shí)程增加，波寬變大，隨后逐漸消失。PS消失后，PV隨之消失(圖1)。本研究首先觀察了20 μmol/L氯胺酮對正常海馬腦片群峰電位幅度的影響，具體方法是:以灌注加有氯胺酮的人工腦脊液前記錄的最后時(shí)間點(diǎn)的PS幅值為A1，灌注含有氯胺酮人工腦脊液10 min后記錄PS幅值為A2。以A1為100%進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)A2相對平均值為(99.43±3.36)%(n=10)，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步觀察氯胺酮對缺氧抑制海馬腦片群峰電位的影響發(fā)現(xiàn)：與缺氧組比較，氯胺酮預(yù)處理后，可以使海馬腦片群峰電位缺氧后開始減小和完全消失的時(shí)間均延遲(均P<0.05)，見表1。

A：開始缺氧前記錄的海馬腦片群峰電位；B：缺氧后群峰電位消失圖1 不同時(shí)間點(diǎn)記錄的海馬腦片群峰電位Fig.1 Population spikes measured in hippocampal slices

組別n群峰電位減小時(shí)間(min)消失時(shí)間(min)對照組8--缺氧組82.38±0.804.74±1.19氯胺酮組83.99±1.18#7.41±2.04#

與缺氧組比較，#P<0.05

2.2 氯胺酮預(yù)處理對缺氧條件下海馬神經(jīng)元Fos表達(dá)的影響

與對照組比較，缺氧組和氯胺酮組海馬神經(jīng)元Fos表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)明顯增多，其平均吸光度明顯增強(qiáng)(均P<0.05)；與缺氧組比較，氯胺酮組的培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞FOS表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)明顯減少，其平均吸光度明顯減低(P<0.05)，見圖2和表2。

A：對照組；B：缺氧組；C：氯胺酮組圖2 體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元Fos蛋白的表達(dá)變化(×400)Fig.2 Changes of Fos protein expression in cultured hippocampal neurons(×400)

組別Fos陽性細(xì)胞(%)平均吸光度值對照組3.32±1.510.11±0.03缺氧組78.82±9.61*1.24±0.16*氯胺酮組66.72±9.23*#0.98±0.15*#

與對照組比較，*P<0.05；與缺氧組比較，#P<0.05

2.3 氯胺酮預(yù)處理對缺氧條件下海馬神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)的影響

與對照組比較，缺氧組和氯胺酮組海馬神經(jīng)元Bcl-2陽性的細(xì)胞數(shù)明顯增多，平均吸光度明顯升高(均P<0.05)；與缺氧組比較，氯胺酮組的培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2陽性的細(xì)胞數(shù)明顯增多，平均吸光度明顯增強(qiáng)(P<0.05)，見圖3和表3。

組別Bcl-2陽性細(xì)胞平均吸光度值對照組13.38±2.510.12±0.03缺氧組66.47±9.02*0.66±0.25*氯胺酮組78.58±9.45*#0.99±0.18*#

與對照組比較，*P<0.05；與缺氧組比較，#P<0.05

3 討論

海馬是對缺氧最敏感的腦區(qū)之一，海馬細(xì)胞和纖維排列有序，海馬細(xì)胞易于分離、離體腦片制作簡單且方便觀察突觸功能，因此無論是培養(yǎng)海馬神經(jīng)元還是離體海馬腦片均被廣泛用于缺氧研究[8-9]。參考文獻(xiàn)[4，10]，并考慮到培養(yǎng)液內(nèi)血清白蛋白可結(jié)合部分氯胺酮分子，本研究氯胺酮濃度選擇為20 μmol/L。

缺氧后PS及隨后的PV消失分別是腦細(xì)胞突觸功能受阻和神經(jīng)元興奮性消失的特征。當(dāng)人工腦脊液中氧氣為氮?dú)馑鏁r(shí)，由于氧分壓急劇下降，大約75%神經(jīng)組織的氧分壓下降到0～2.67 kPa，在數(shù)分鐘內(nèi)氧分壓下降到激活突觸后神經(jīng)元的閾值之下，PS即被阻斷。研究認(rèn)為突觸傳遞抑制的主要原因是突觸前Ca2+通道失活，次要原因是突觸前Na+通道激活[11]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在不缺氧的情況下，氯胺酮使用前后腦片PS幅值無明顯變化，不抑制突觸傳遞。經(jīng)20 μmol/L氯胺酮預(yù)處理可以明顯延長腦片在缺氧時(shí)PS減小和消失時(shí)間。說明此濃度的氯胺酮可以保護(hù)缺氧引起的神經(jīng)突觸抑制。

大多數(shù)種類的細(xì)胞在正常條件下，只有較低水平的Fos表達(dá)。缺氧可以刺激Fos表達(dá)，表達(dá)的Fos蛋白與Jun蛋白形成異源二聚體AP-1，AP-1與DNA特異性位點(diǎn)結(jié)合，對靶基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[6]。由于腦缺血缺氧誘導(dǎo)Fos在腦內(nèi)快速而短暫的表達(dá)，其mRNA及蛋白被認(rèn)為是細(xì)胞對缺血損傷的敏感標(biāo)記[12]。在本實(shí)驗(yàn)中對照組Fos表達(dá)水平低，缺氧組和氯胺酮組經(jīng)過缺氧處理后Fos表達(dá)水平明顯高于對照組，但是氯胺酮組Fos表達(dá)水平低于缺氧組，說明氯胺酮處理可以降低Fos表達(dá)水平。

Bcl-2蛋白是線粒體的調(diào)節(jié)因子，在腦缺血后抑制神經(jīng)元凋亡。Bcl-2在調(diào)控線粒體膜通透性中起著非常重要的作用，可以防止線粒體膜電位的耗散[13-14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氯胺酮預(yù)處理可以明顯增加Bcl-2的表達(dá)水平。

NMDA受體在介導(dǎo)缺氧后神經(jīng)突觸抑制和神經(jīng)元損傷發(fā)生中起到非常重要的作用。缺氧導(dǎo)致NMDA受體興奮，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，突觸前特定的鈣通道受阻，突觸傳遞終止。氯胺酮是NMDA受體阻滯劑[3-4]，可以通過非競爭性抑制NMDA受體減慢細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高速度，使得Fos表達(dá)降低可以改變Fos蛋白激活的下游機(jī)制，Bcl-2表達(dá)增加可以穩(wěn)定線粒體膜，防止線粒體功能喪失。這些因素共同延緩了缺氧時(shí)的神經(jīng)突觸功能的抑制。

綜上所述，氯胺酮預(yù)處理可以減輕缺氧性海馬神經(jīng)突觸功能抑制，其機(jī)制與氯胺酮阻止NMDA受體，降低Fos、增加Bcl-2表達(dá)相關(guān)。

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KetamineAlleviatesHypoxia-inducedInhibitionofPopulationSpikesofRatHippocampusbyChangingExpressionofFosandBcl-2

Peng Jian1，2，Chen Kun1，Liao Mingfeng1et al

1DepartmentofAnesthesiology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofAnesthesiology，WuhanNo.3Hospital，Wuhan430060，China

ObjectiveTo discuss the protective role of ketamine in hypoxia-induced damage of neurons by examining the effect of ketamine on population spikes in hypoxia and the expression of Fos and Bcl-2 in rat hippocampus.MethodsThe hippocampal slices and cultured hippocampal neurons were randomly divided into three groups：control group，in which no hypoxic treatment was given；hypoxia group and ketamine group.In the ketamine group，the slices and the neurons were treated with 20 μmol/L ketamine before inducement of hypoxia.The hippocampal slices were obtained from adult male Wistar rats after anesthetization.The Schaffer collaterals in CA3 area were stimulated and the evoked potentials were recorded in CA1 area.The hippocampal neurons of new-born rats were cultured for 7-11 days and staining was performed in neurons in different groups by using anti-goat Fos and anti-rabbit Bcl-2 serum，and the absorbance was detected.ResultsThe decrease in the population spikes and the total disappearance of the spikes were delayed in hippocampal slices pretreated with ketamine.The positive expression rate of Fos and the average absorbance value were significantly lower in ketamine group than in anoxic group(P<0.05)，whereas the positive expression rate of Bcl-2 expression and the average absorbance value were significantly higher in ketamine group than in hypoxia group(P<0.05).ConclusionPretreatment with ketamine alleviates hypoxia-induced inhibition of population spikes by decreasing Fos and increasing Bcl-2 expression.

ketamine； rat hippocampal neuron； Fos； Bcl-2； population spike； hypoxia

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81371251)

彭 堅(jiān)，男，1968年生，副主任醫(yī)師，E-mail：pengjian699@aliyun.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：xrwang@hust.edu.cn

R364.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.05.004

(2017-05-16 收稿)