竹瀝對慢阻肺大鼠肺組織中AQP1、AQP4、AQP5、TNF-α和IL-6的影響*

羅建江，馬紅霞

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院(烏魯木齊 830000)

竹瀝對慢阻肺大鼠肺組織中AQP1、AQP4、AQP5、TNF-α和IL-6的影響*

羅建江，馬紅霞△

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院(烏魯木齊 830000)

目的：觀察中藥竹瀝對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺組織中水通道蛋白1(AQP1)、4(AQP4)、5(AQP5)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)表達(dá)的影響，探討中藥竹瀝對慢性阻塞性肺病患者化痰療效的可能機(jī)制。方法：選用雄性Wistar大鼠30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白組、模型組、干預(yù)組,每組10只，除空白組外，其他組均采用香煙熏結(jié)合彈性蛋白酶氣管滴入法復(fù)制COPD大鼠模型，90 d后，干預(yù)組進(jìn)行鮮竹瀝口服液灌胃10 d，余兩組進(jìn)行生理鹽水灌胃10 d。干預(yù)結(jié)束后采用PCR法觀察AQP1、AQP4、AQP5的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定大鼠肺組織中TNF-α和IL-6的含量。結(jié)果：與空白組比較，模型組、干預(yù)組肺組織中AQP1、AQP4、AQP5濃度顯著下降(P<0.01)，TNF-α、IL-6濃度顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，干預(yù)組肺組織AQP1、AQP5濃度顯著升高(P<0.01)，AQP4、TNF-α和IL-6濃度顯著下降(P<0.01)，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：竹瀝對COPD的療效可能與調(diào)節(jié)水通道蛋白1、5(AQP1)、(AQP5)的轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)表達(dá)密切相關(guān)。

“龐大容量的肺”是對慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的最早描述，目前已經(jīng)認(rèn)識到氣道和肺組織對有害氣體或顆粒的異常炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是其重要特征[1]。其發(fā)病率高，對患者的活動能力、生活質(zhì)量構(gòu)成嚴(yán)重危害[2]。氣道粘液的高分泌是COPD患者氣道阻塞的主要原因，也是影響病情和預(yù)后評估的獨立危險因素[3]，本文通過對大鼠造模，中藥竹瀝進(jìn)行干預(yù)，對肺組織中水通道蛋白1(AQP1)、水通道蛋白4(AQP4)、水通道蛋白5(AQP5)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)進(jìn)行觀察，探索竹瀝對COPD臨床療效的作用機(jī)制，報道如下。

材料與方法

1 動 物 SPF級雄性Wistar成年大鼠30只，鼠齡8周，體質(zhì)量200 g±50 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

2 藥物與劑量 鮮竹瀝口服液 (成分：鮮竹瀝，國藥準(zhǔn)字：Z35020128)根據(jù)體重按體表面積換算200 g加減50 g大鼠的每日灌藥量為6.6 ml，分早晚兩次灌胃。

3 試劑與儀器 電子天平由中國上海天平儀器廠生產(chǎn)，-80 ℃低溫冰箱由德國 Thermo公司生產(chǎn)高速臺式離心機(jī)由德國Eppendorf公司生產(chǎn)，Milli-Q型純水系統(tǒng)由美國 Millipore公司生產(chǎn)，Elisa試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司(Rat IL-6 ELISA Kit No23035347 IL-6單位ng/L)

4 實驗分組及造模給藥 將30只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為三組，每組10只，即慢性阻塞性肺病模型組、慢性阻塞性肺病模型干預(yù)組和空白對照組。具體干預(yù)措施為：模型組和干預(yù)組在開始實驗后的第30天以0.8 ml/100 g的生理鹽水氣管滴注溶20 U彈性蛋白酶，并于第1天至第29天、第31天至第90天內(nèi)每天上下午進(jìn)行熏煙，每次10只大鼠持續(xù)1 h。在90 d熏煙后模型組和干預(yù)組分別進(jìn)行生理鹽水和鮮竹瀝口服液灌胃10 d?？瞻捉M于第30天采用與模型組同樣的方式在氣管內(nèi)進(jìn)行等體積生理鹽水的滴注，90 d后進(jìn)行生理鹽水灌胃10 d。

造模成功的表現(xiàn)為：大鼠肺部組織顏色呈白色或灰白色，外觀體積增大膨脹，鏡下可見支氣管的管腔狹窄，黏膜充血水腫變形或異常增厚，杯狀細(xì)胞化明顯，大量炎性細(xì)胞聚集浸潤。呼吸性細(xì)支氣管管壁增生、肺泡膨大。細(xì)支氣管遠(yuǎn)端的氣囊腔不斷膨脹，最終破裂并融合成大的氣腔，因為回縮力降低，從而導(dǎo)致彈力纖維網(wǎng)破壞[4]。

5 指標(biāo)檢測 麻醉實驗大鼠取血的同時，開胸暴露胸腔，結(jié)扎右肺，切除后上中葉迅速放入-80 ℃冰箱，用PCR法對肺組織中AQP1、AQP4、AQP5進(jìn)行檢測。下葉采用ELISA法分別對IL-6、TNF-α的濃度分別進(jìn)行測定，實驗具體步驟按照試劑盒內(nèi)的說明書進(jìn)行操作。

6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并對相關(guān)實驗數(shù)據(jù)行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

樣本缺失說明：氣道滴注彈性蛋白酶進(jìn)行染毒過程中空白組死亡3只大鼠，染毒后熏煙造模過程中模型組、干預(yù)組各組死亡3只大鼠，有效樣本量21只，TNF-α、IL-6測試中采用單鼠雙肺測定，有效樣本量為24只。

1 實驗各組對模型大鼠肺部組織中AQP1、AQP4、AQP5表達(dá)高低的影響 表1結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組與干預(yù)組AQP1、AQP4、AQP5含量顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，干預(yù)組AQP1、AQP5顯著升高，AQP4顯著降低(P<0.01)。

表1 各組對大鼠肺組織中AQP1、AQP4、AQP5表達(dá)的影響

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較， *P<0.01

2 各組對大鼠肺組織中TNF-α、IL-6的影響 表2結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組與干預(yù)組TNF-α、IL-6顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，干預(yù)組TNF-α、IL-6顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組對大鼠肺組織中TNF-α、IL-6的影響

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較， *P<0.01

討 論

竹瀝，又名竹汁、淡竹瀝等，始載于東漢的《神農(nóng)本草經(jīng)》。自古有“痰家之圣劑”之美稱。常用于治療肺熱痰壅、咳嗽、大熱煩渴，驚風(fēng)等疾病，古籍中一些經(jīng)典方劑如“竹瀝達(dá)痰丸”、“竹瀝枳術(shù)丸”、“黃柏竹瀝膏”等均有對竹瀝的應(yīng)用記載。

慢性阻塞性肺病作為肺部損傷的常見慢性疾病，目前西醫(yī)多用抗感染、解痙平喘等手段治療，但效果并不理想，結(jié)合中醫(yī)辨證論治無論是疾病的穩(wěn)定期還是急性加重期都會提高COPD療效，改善肺功能[5-6]。中藥竹瀝可抑制痰液的分泌、減輕氣道的炎癥反應(yīng)，廣泛用于各類呼吸道、肺部感染所致的咳嗽、咳痰、胸悶氣憋[7]，有研究表明[8]西醫(yī)基礎(chǔ)治療聯(lián)合鮮竹瀝口服可增加COPD急性發(fā)作期療效，舒利迭聯(lián)合鮮竹瀝對治療穩(wěn)定期COPD患者安全有效，不僅能改善患者肺功能、同時還能減少激素吸入次數(shù)。其機(jī)制認(rèn)為可能與竹瀝含有大量巰基，可使分泌物中黏蛋白、糖蛋白的二硫鍵斷裂，起到稀釋痰液粘稠度，促進(jìn)纖維擺動等作用，其次與竹瀝中含豐富硒元素，可清除氧自由基，穩(wěn)定細(xì)胞膜等因素有關(guān)[9]。

水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)作為細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在目前已發(fā)現(xiàn)的13種AQP中，有六種表達(dá)于肺，其中AQP1、AQP4、AQP5在肺水轉(zhuǎn)運(yùn)過程中有重要作用。有研究表明，AQP5基因敲除后可減弱肺部對細(xì)菌的清除能力，COPD患者中AQP4表達(dá)減少可導(dǎo)致其肺功能下降及氣道炎癥加重[10]。TNF-α、IL-6是機(jī)體內(nèi)兩種重要的多功能細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，可促進(jìn)肺部炎癥細(xì)胞的募集，包括COPD、哮喘在內(nèi)的慢性氣道炎癥性疾病，其急性加重期均有TNF-α、IL-6的參與[11]。

本研究對小鼠造模干預(yù)后發(fā)現(xiàn)：與空白組大鼠比較，模型組大鼠肺組織APQ1、APQ4、APQ5含量明顯下降， IL-6 及TNF-α含量明顯升高，表明在香煙煙霧及彈性蛋白的誘導(dǎo)下，肺內(nèi)水液轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，運(yùn)行失調(diào)，使水液儲留于氣道。與模型組比較，干預(yù)組可顯著增強(qiáng)肺組織中AQP1、AQP5的表達(dá)，降低TNF-α、IL-6的表達(dá)，這與方志全[12]等研究相一致，提示竹瀝可增強(qiáng)肺組織中水通道蛋白表達(dá)，以AQP1、AQP5為主，同時減輕炎性因子TNF-α、IL-6浸潤，減少氣道和肺粘液高分泌，緩解COPD患者痰液堵塞的狀況，其機(jī)制可能還與粘蛋白如MUC5AC，MUC5BC、以及其它水通道蛋白的表達(dá)有關(guān)，需進(jìn)一步研究論證。

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EffectofbamboojuiceonlungtissueofratswithCOPDinAQP1,AQP4,AQP5,TNF-andIL-6

Luo Jianjiang，Ma Hongxia.

The Fourth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (Urumqi 830000)

Objective: To observe the effect ofbamboo juice on lungtissue of rats with COPD in AQP1, AQP4, AQP5, TNF- and IL-6, To explore the possible mechanism of COPD patients with phlegm effect of juice.Methods: 30 male Wistar rats, fed after 1 weeks were randomly divided into control group, model group and intervention group, 10 rats in each group, except the blank group, other groups were treated with cigarette smoking combined with elastaseintratracheal instillation of COPD rats model was established, 90 days later, the intervention group in xianzhuli oral liquid gavage for 10 days, the two other groups were saline for 10 days. After the intervention, the expression of AQP1, AQP4 and AQP5 were observed by PCR method. The levels of TNF- and IL-6 in lung tissue were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results: Compared with the blank group, the concentrations of AQP1, AQP4 and AQP5 in the lung tissue of model group and intervention group were significantly decreased (P< 0.01), and the levels of TNF- and IL-6 were significantly higher (P< 0.01). Compared with the model group, the lung tissue AQP1 and AQP5 concentrations in the intervention group were significantly increased (P< 0.01), AQP4, TNF- and IL-6 concentrations were significantly decreased (P< 0.01), the difference was statistically significant.Conclusion: Bamboo juice have a curative effect of COPD may be related to the regulation of aquaporin 1 and aquaporin 5 (AQP1), (AQP5) transporter, inhibition of tumor necrosis factor alpha (TNF- alpha), interleukin 6 (IL-6) expression is closely related to.

Pulmonary disease, chronic obstructive/traditional Chinese medicine therapy Liquor phyllostachys Aquaporins Animal experimentation Rats

*新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(2015211C149)

△通訊作者

肺疾病, 慢性阻塞性 /中醫(yī)藥療法 竹瀝 水通道蛋白類 動物實驗 大鼠

R563

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.11.061

(收稿：2017-06-28)