MKP1對他莫昔芬耐藥MCF7細(xì)胞耐藥性的影響研究*

白靜靜,馬 剛△,何建軍,潘怡霞

1.陜西省人民醫(yī)院(西安 710068)，2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部(西安 710061)

MKP1對他莫昔芬耐藥MCF7細(xì)胞耐藥性的影響研究*

白靜靜1,馬 剛1△,何建軍2,潘怡霞2

1.陜西省人民醫(yī)院(西安 710068)，2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部(西安 710061)

目的：研究MKP1對他莫昔芬耐藥MCF7細(xì)胞耐藥性的影響及其分子機(jī)制。方法：應(yīng)用Real-time PCR和Western blot 分析MKP1在MCF7和他莫昔芬耐藥MCF7細(xì)胞中的表達(dá)變化；Western blot 分析MKP1 siRNA在他莫昔芬耐藥MCF7細(xì)胞中對他莫昔芬誘導(dǎo)MAPK成員活化的影響；MTT比色法分析細(xì)胞活力；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡；SP600125抑制JNK活化。結(jié)果：與MCF7細(xì)胞相比，MKP1在他莫昔芬耐藥MCF7細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)；MKP1 siRNA可增加他莫昔芬對耐藥MCF7細(xì)胞活力的抑制作用；MKP1 siRNA組與對照組相比，他莫昔芬介導(dǎo)的耐藥MCF7細(xì)胞的凋亡顯著增加；siRNA組與對照組相比，他莫昔芬誘導(dǎo)的JNK活化顯著增強(qiáng)；SP600125抑制JNK活化后，MKP1 siRNA 組他莫昔芬耐藥MCF7對他莫昔芬的耐藥性部分恢復(fù)。結(jié)論：MKP1通過抑制他莫昔芬誘導(dǎo)的JNK活化維持MCF7他莫昔芬耐藥細(xì)胞對他莫昔芬的耐藥性。

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐漸上升，且有年輕化趨勢[1]。乳腺癌可分為三種基本類型：ER陽性型，Her2基因擴(kuò)增型和三陰性型，其中ER陽性型乳腺癌約占總?cè)橄侔┌l(fā)病率的70%以上[2]。他莫昔芬是治療ER陽性型乳腺癌的經(jīng)典藥物，但ER陽性乳腺癌對他莫昔芬的耐藥限制了其應(yīng)用。已有研究顯示，他莫昔芬耐藥機(jī)制復(fù)雜多變[3]。因此，從分子水平探尋他莫昔芬耐藥機(jī)制，篩選新的分子指標(biāo)，為其耐藥的ER陽性乳腺癌提供新的分子治療靶標(biāo)，仍是目前乳腺癌研究的熱點(diǎn)之一。

MKP1是絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶家族(Mitogen-activated protein kinase phosphatase family,MKPs)成員。MKPs可將MAPKs共有模體TXY中的磷酸化酪氨酸和色/蘇氨酸殘基去磷酸化，從而負(fù)性調(diào)節(jié) MAPKs信號[4]。包括MKP1在內(nèi)的多個MKPs成員在腫瘤中存在表達(dá)異常，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究表明，MAPKs及其下游信號通路參與誘導(dǎo)ER陽性乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生他莫昔芬耐藥[5]。而作為MAPKs的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，MKP1在他莫昔芬耐藥機(jī)制中的作用尚未有人闡明。本研究發(fā)現(xiàn)MKP1在他莫昔芬耐藥MCF7細(xì)胞中表達(dá)增高；利用siRNA沉默MKP1基因表達(dá)，分析MKP1對他莫昔芬耐藥性的影響；觀察MKP1沉默后，他莫昔芬作用下MAPKs活化水平的變化，探討MKP1參與MCF7細(xì)胞他莫昔芬耐藥的分子機(jī)制。

材料與方法

1 材 料 人乳腺癌MCF7細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞庫，他莫昔芬耐藥的MCF7細(xì)胞系由北京中醫(yī)藥大學(xué)的陳信義教授惠贈[6]。無酚紅的DMEM培養(yǎng)基及活性炭處理過的胎牛血清購自PAA。4-hydroxy tamoxifen(TAM，H7904)，SP600125購自Sigma；逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時定量PCR試劑盒購自TAKARA； 轉(zhuǎn)染試劑TurboFect購自Fermentas；MKP1 siRNA pool(UGGAGCAUAUCGUGCCGAA；AAGAUAUGCUCGACGCCUU)， Scrambled siRNA(CGTACGCGGAATACTTCGA)購自Dharmacon；MKP-1(sc-370)多克隆抗體購自Santa Cruz；兔抗人MAPKs，p-MAPKs，p-c-jun，PARP單抗，均購自CST； CCK-8試劑盒購自同仁研究所；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo。

2 細(xì)胞培養(yǎng) MCF7 細(xì)胞培養(yǎng)于含胎牛血清100ml/L，青霉素100 U/ml，鏈霉素100μg/ml的DMEM培養(yǎng)基中。他莫昔芬耐藥的MCF7細(xì)胞(MCF7-TR)在含5μmol/L TAM(溶媒為DMSO)的培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)8月。所有細(xì)胞置于37℃、50ml/L CO2及飽和濕度條件下長期培養(yǎng),2～3d 換液，細(xì)胞融合至 80%～90%時傳代。

3 MTT吸光度實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/ml，接種于 96 孔板內(nèi)，200μl/孔，置于37℃、50ml/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育過夜后更換培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組加入藥物，每個藥物濃度設(shè) 6 個復(fù)孔；溶媒對照組加入含等體積溶媒的培養(yǎng)基；以無血清培養(yǎng)液作空白調(diào)零。細(xì)胞活力檢測：將細(xì)胞培養(yǎng)48h后，每孔加入含有10ml/L CCK-8的培養(yǎng)液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)2h后酶標(biāo)儀檢測450nm波長處各孔吸光度(OD)值。細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。生長曲線：各組細(xì)胞平行培養(yǎng) 1、3、5、7d后，如上法檢測450nm波長處各孔吸光度(OD)值，繪制細(xì)胞生長曲線。

4 Annexin-PI染色檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期細(xì)胞以細(xì)胞數(shù)2×106個/孔接種于6cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h后加入TAM使終濃度分別為0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)48h后胰酶消化為單細(xì)胞懸液，置入10ml離心管，預(yù)冷PBS洗滌2次，1000r/min離心5min收集細(xì)胞。棄上清，加入500μl Binding Buffe→5μl Annexin V-FITC→5 μl Propidium Iodide。室溫避光反應(yīng)5～15min，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

5 MKP1 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞 按照TurboFect轉(zhuǎn)染說明書，MCF7-TR細(xì)胞用無抗生素含活性炭濾過胎牛血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于96或6孔板中，于37℃培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)過夜后，將MKP1 siRNA pool和Scrambled siRNA瞬時轉(zhuǎn)染MCF7-TR 細(xì)胞，6h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后備用。

6 Real-time PCR檢測MKP1 mRNA表達(dá) Trizol 法提取總RNA,取總RNA 1.0μg利用TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。設(shè)計(jì)人MKP1 序列實(shí)時定量PCR引物，MKP1引物：上游5’-GGGACGCGCGGTGAAG-3’，下游5'-GATCTTGTGCGGTTTTTTGTGG-3’；18S引物，上游5’-TCTCAAAGATTCGCCATG-3’，下游5’-TCACCAACGGAGACCTT-3’。實(shí)時定量擴(kuò)增條件：94℃ 90s；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃60s，30個循環(huán)；60℃延伸5min。2-ΔΔCt法對實(shí)時定量PCR結(jié)果進(jìn)行相對定量統(tǒng)計(jì)。

7 Western blot 細(xì)胞由RIPA裂解液冰上裂解。離心去除沉淀，加5×SDS Loading Buffer后100℃水浴5min。各取等量蛋白在100g/L的SDS-PAGE 膠上電泳，半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用含50g/L BSA的PBST室溫封閉 1 h，一抗4℃孵育過夜后PBST洗膜，二抗室溫孵育 1 h，PBST 洗膜。加入發(fā)光劑，于ChemiDocTM MP成像系統(tǒng)檢測并拍照。應(yīng)用該系統(tǒng)自帶的條帶分析軟件計(jì)算條帶積分吸光度值并進(jìn)行半定量分析。

結(jié) 果

1 MKP1在他莫昔芬敏感和耐藥的MCF7細(xì)胞系中的表達(dá) 比較MCF7 和MCF7-TR細(xì)胞經(jīng)TAM處理后的生長曲線，提示MCF7-TR細(xì)胞對TAM耐藥(t3d=-16.817，P3d<0.01；t5d=-31.224，P5d<0.01；t7d=-56.764，P7d<0.01)(圖1A)。與MCF7細(xì)胞相比，MCF7-TR中MKP1 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)(t=-9.196，P<0.01)(圖1B)；MKP1蛋白表達(dá)也明顯升高(圖1C)。

2 MKP1敲低對MCF7-TR細(xì)胞他莫昔芬敏感性的影響 利用MKP1 siRNA轉(zhuǎn)染MCF7-TR細(xì)胞后，Western blot 檢測MKP1敲低水平(圖2A)。MTT法檢測不同濃度TAM(5μmol/L,10μmol/L)處理48h后，MKP1敲低組和對照組MCF7-TR細(xì)胞的存活率(圖2B)。結(jié)果顯示在5μmol/L、10μmol/L TAM濃度組別中，MKP1敲低組MCF7-TR細(xì)胞存活率均較對照組顯著降低(F1=40.908，P1<0.01；F2=58.153，P2<0.01)。說明MKP1改變能影響MCF7-TR細(xì)胞的TAM敏感性。

A ：TAM作用下MCF7-TR細(xì)胞的生長曲線,與MCF7細(xì)胞比較，*P3d<0.01；★P5d<0.01； #P7d<0.01；B：MCF7-TR細(xì)胞中MKP1 mRNA表達(dá)，與MCF7細(xì)胞比較，*P<0.01；C：Western blot結(jié)果，E2，E2 50nmol/L組；TAM，TAM 5 μmol/L組

圖1 MKP1在人乳腺癌MC7和MCF7-TR細(xì)胞中的表達(dá)

與對照組比較，*P1<0.01， ** P2<0.01

3 MKP1敲低對他莫昔芬誘導(dǎo)MCF7-TR細(xì)胞凋亡的影響 應(yīng)用不同濃度TAM處理MKP1 siRNA轉(zhuǎn)染組與對照組MCF7-TR細(xì)胞48h后，采用 Annexin V+PI試劑盒在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡(圖3)。結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞相比，TAM 誘導(dǎo)MKP1敲低組細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例顯著增加(t1=-6.789，P1<0.01；t2=-9.611，P2<0.01)(圖4)。

4 MKP1敲低可增加TAM誘導(dǎo)的JNK活化 因MKP1可抑制MAPKs成員的磷酸化，所以我們利用Western blot檢測了MKP1 siRNA轉(zhuǎn)染組與對照組MCF7-TR細(xì)胞在不同濃度TAM處理24h和48h后，其MAPKs的磷酸化水平。結(jié)果顯示，敲低MKP1后，TAM誘導(dǎo)MAPKs活化增加，其中JNK活化增加尤其顯著(圖5)。

A:流式細(xì)胞術(shù)鑒定各組MCF7-TR細(xì)胞經(jīng)TAM處理后凋亡； B:各組細(xì)胞凋亡率比較，*P1<0.01， ** P2<0.01

圖3 TAM誘導(dǎo)各組MCF7-TR細(xì)胞凋亡比較

5 MKP1通過調(diào)節(jié)JNK活性保護(hù)細(xì)胞 為明確JNK活化是否與MKP1敲低的MCF7-TR細(xì)胞對TAM敏感性恢復(fù)相關(guān)，我們在用TAM處理細(xì)胞之前，用JNK特異性抑制劑SP600125預(yù)處理細(xì)胞3h。結(jié)果顯示SP600125顯著降低MKP1 siRNA轉(zhuǎn)染的MCF7-TR細(xì)胞的JNK信號通路的激活(圖6)；也顯著減少了TAM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(t=4.902，P<0.01)(圖6)。

圖4 各組細(xì)胞凋亡比較

A: Scrambled siRNA轉(zhuǎn)染的MCF7-TR細(xì)胞，蛋白上樣量50μg，15s；B: MKP1 siRNA轉(zhuǎn)染的MCF7-TR細(xì)胞，蛋白上樣量50μg

圖5 Western blot 檢測 TAM誘導(dǎo)各組MCF7-TR細(xì)胞p-MAPKs 表達(dá)

討 論

MAPKs信號通路是調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞生長和死亡的重要信號通路，有多種機(jī)制參與其活性的調(diào)控，MKPs即是此通路重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子[4]。MAPKs信號通路的失調(diào)與多種疾病相關(guān)，特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。累積的研究提示，MKPs與MAPKs信號失調(diào)相關(guān)，且其多個成員能夠通過對MAPKs信號的調(diào)節(jié)參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[7]。

A:各組細(xì)胞JNK通路活性及cleaved-PARP表達(dá)；B:JNK抑制劑處理后TAM誘導(dǎo)各組細(xì)胞凋亡比較，*P<0.01

圖6 JNK抑制劑對TAM誘導(dǎo)各組MCF7-TR細(xì)胞凋亡的影響

MKP-1是研究最多的MKP家族成員，其與腫瘤的相關(guān)性研究也最為深入。MKP-1在多種腫瘤中表達(dá)改變[8]。研究報(bào)道MKP1在早期前列腺癌、結(jié)腸癌和膀胱癌中呈過表達(dá)；但隨著腫瘤分級增高和出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，MKP1的表達(dá)呈進(jìn)行性丟失。在肝細(xì)胞肝癌、卵巢癌中，MKP1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)較正常細(xì)胞明顯下調(diào)。而在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌中，MKP1表達(dá)則明顯上調(diào)。本研究亦顯示，與母代MCF7細(xì)胞相比，他莫昔芬耐藥的MCF7細(xì)胞中MKP1的表達(dá)上調(diào)。由此可見，MKP1參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制復(fù)雜。在不同腫瘤中或腫瘤發(fā)展的不同階段，MKP1往往顯示出特異性的作用。

MKP-1與腫瘤耐藥的相關(guān)性研究的最多。最早的證據(jù)源于對順鉑耐藥的研究。順鉑殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制之一是誘導(dǎo)JNK介導(dǎo)的凋亡通路活化。而MKP-1卻能對JNK實(shí)施去磷酸化從而抑制JNK的活性，最終導(dǎo)致順鉑耐藥。當(dāng)利用siRNA敲低MKP-1表達(dá)后，順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡會明顯增加[9]。MKP-1也與其他抗腫瘤藥物的耐藥相關(guān)。有研究顯示，MKP-1在乳腺癌中的過表達(dá)能夠保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于遭受多種化療藥物如多柔比星，氮芥和紫杉醇類誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10]。最近的一項(xiàng)臨床研究更顯示， MKP-1過表達(dá)可能與靶向藥物西妥昔單抗耐藥相關(guān)[11]。本研究中，采用RNA干擾技術(shù)對MKP1進(jìn)行基因沉默后，他莫昔芬作用下的MCF7-TR細(xì)胞活力減低，凋亡增加，部分恢復(fù)了對他莫昔芬的敏感性，提示MKP1參與維持MCF7-TR細(xì)胞的他莫昔芬耐藥性。

他莫昔芬聯(lián)合同步放化療可有效減輕放化療引起的骨髓抑制、消化道反應(yīng)、放射性損傷等毒副反應(yīng)[12]；同時，其聯(lián)合乳癖消、散瘀化瘀方治療乳腺增生可取得較好的療效[13-14]。作為經(jīng)典的雌激素受體調(diào)節(jié)劑，他莫昔芬主要通過與雌激素競爭性結(jié)合雌激素受體并抑制其活化，從而下調(diào)雌激素受體信號通路活性，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用[15]。研究亦報(bào)道，他莫昔芬也可激活JNK等信號通路，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。導(dǎo)致他莫昔芬耐藥的機(jī)制復(fù)雜，因素多變。主要機(jī)制可能為雌激素受體信號通路與活化的激酶信號通路之間形成串話調(diào)節(jié)，導(dǎo)致雌激素受體非配體性激活，引起下游通路活化增加。另外雌激素受體缺失、核受體共調(diào)節(jié)因子失衡、表皮生長因子受體信號通路過度活化等均可導(dǎo)致他莫昔芬耐藥[17]。本研究利用siRNA敲低MKP1后，他莫昔芬明顯促進(jìn)MCF7-TR細(xì)胞JNK的磷酸化，顯示在MCF7-TR細(xì)胞中，MKP1主要對JNK實(shí)施去磷酸化，從而抑制JNK活性。在應(yīng)用JNK特異性抑制劑SP600125預(yù)處理細(xì)胞后，他莫昔芬誘導(dǎo)MKP1敲低MCF7-TR細(xì)胞凋亡的能力降低。提示MKP1能通過抑制JNK活性維持MCF7-TR對他莫昔芬的耐受性。

總之，MKP1在他莫昔芬耐藥的MCF7細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可抑制他莫昔芬介導(dǎo)的JNK凋亡通路活化，從而維持細(xì)胞對他莫昔芬的耐藥。但是，他莫昔芬耐藥MCF7細(xì)胞中上游信號如何調(diào)節(jié)MKP1表達(dá)，其他MKPs家族成員是否也參與維持他莫昔芬耐藥性，尚需進(jìn)一步研究。

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EffectsofMKP1onthedrugsensitivityoftamoxifenresistantMCF7cells

Bai Jingjing,Ma Gang,He Jianjun,et al.

Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Objective：To investigate the effects of mitogen-activated protein kinase phosphatase 1(MKP-1) on the drug sensitivity of tamoxifen resistance breast cancer MCF7 cells and the molecular mechanisms. Methods：The expression of MKP1 in MCF7 and tamoxifen resistant MCF7 cells were analyzed by Real-time PCR and Western Blot. Effects of MKP1 siRNA on the activation of MAPKs mediated by tamoxifen in tamoxifen resistant MCF7 cells were analyzed by Western Blot. MTT assy was used to analyze the effects of MKP1 siRNA on survival rate of tamoxifen resistant MCF7 cells after tamxoifen treatment. The effects of MKP1 siRNA on apoptosis induced by tamoxifen in tamoxifen resistant MCF7 cells were analyzed with flow cytometer. JNK inhibitor SP600125 was used to treat MKP1 siRNA group cells. Results：MKP1 expression level was higher in tamoxifen resistant MCF7 cells compared with parental MCF7 cells. MKP1 siRNA enhanced the tamoxifen sensitivity of tamoxifen resistant MCF7 cells,and promoted the apoptosis induced by tamoxifen. Tamoxifen-induced activation of JNK significantly increased in MKP1 siRNA group tamoxifen resistant MCF7 cells compared with control group cells. SP600125 recovered tamoxifen resistant capacity in MKP1 siRNA group tamoxifen resistant MCF7 cells. Conclusion：MKP1 maintains tamoxifen resistant capacity in tamoxifen reisistant MCF7 cells through blocking JNK activation.

Drug tolerance Mitogen-activated protein kinase phosphatase Tamoxifen @MCF7 cells Apoptosis

*陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2011K13-01-08)

△通訊作者

藥物耐受性 絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶 他莫昔芬 @MCF7 細(xì)胞凋亡

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.006

(收稿：2017-05-04)