壁虎對肝細(xì)胞癌干細(xì)胞特性的影響及其機(jī)制

張雅蘭　陳文發(fā)　吳春玲

[摘要]研究壁虎對肝癌干細(xì)胞特性的影響，并探討其分子機(jī)制。采用MTT法檢測肝癌細(xì)胞增殖；腫瘤球培養(yǎng)和流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌干性；Western blot檢測Wnt通路及干性相關(guān)蛋白的表達(dá)；免疫共沉淀檢測相互作用蛋白；皮下移植瘤模型檢測肝癌細(xì)胞的干性。結(jié)果顯示，壁虎對Huh7細(xì)胞的IC50為（0750±0112） g·mL-1，其對Hep3B細(xì)胞的IC50為（0454±0039） g·mL-1。壁虎處理的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)形成的腫瘤球的數(shù)目和大小均縮?。≒<005），CD44，CD133陽性的肝癌細(xì)胞比例減少（P<005）。守宮處理肝癌細(xì)胞后，βcatenin，CD44，cMyc，CCND1，Sox2，Oct4，Nanog，ABCG2等表達(dá)均下調(diào)。免疫共沉淀結(jié)果顯示，壁虎能抑制LRP6與Frizzled6的相互作用。表明，壁虎能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖、腫瘤球的形成及腫瘤干細(xì)胞的比例，其通過靶向LRP6，阻止LRP6與Frizzled6復(fù)合物的形成而抑制Wnt信號通路。

[關(guān)鍵詞]壁虎； 肝細(xì)胞癌； 干細(xì)胞特性； Wnt

[Abstract]To explore the effects and mechanism of aqueous extracts of gecko on cancer stem cells properties of hepatocellular carcinoma In vitro， MTT assay was used to detect the cells growth in Huh7 and Hep3B Spheroidforming assay and flow cytometry were performed to observe the the stemness of Huh7 and Hep3B cells The protein expressions of βcatenin， CD44， cMyc， CCND1， Sox2， Oct4， Nanog and ABCG2 were detected by Western blot Interacting proteins were detected by coimmunoprecipitation； and a subcutaneous xenograft model was used to detect the stemness of hepatoma carcinoma cells The results indicated that aqueous extracts of gecko induced cell growth inhibition in a dose and timedependent manner， with the IC50 of （0750±0112） g·mL-1 for Huh7 and （0454±0039） g·mL-1for Hep3B， respectively The number and size of tumor spheres formed by hepatoma carcinoma cells were decreased after treatment by aqueous extracts of gecko（P<005）； the proportions of cells staining with putative markers for cancer stem cells， such as CD133 and CD44， were decreased（P<005） After treatment with aqueous extracts of gecko， the expression levels of βcatenin， CD44， cMyc， CCND1， Sox2， Oct4， Nanog and ABCG2 were decreased Coimmunoprecipitation results showed that the aqueous extracts of gecko could inhibit the interaction between LRP6 and Frizzled6， indicating that the aqueous extracts of gecko could inhibit the proliferation of hepatoma cells， the formation of tumor spheres and the proportion of tumor stem cells， and inhibit the Wnt signaling pathway by targeting LRP6 to prevent the formation of LRP6 and Frizzled6 complexes.

[Key words]gecko； hepatocellular carcinoma； stemness； Wnt

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球發(fā)病率居第5位的惡性腫瘤，也是我國最常見的惡性腫瘤之一。近年來，盡管多種HCC的治療模式不斷進(jìn)展，但HCC的遠(yuǎn)期效果仍不理想，其中癌癥的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致遠(yuǎn)期效果不理想的重要原因。腫瘤干細(xì)胞（CSC）對放化療的敏感性差，被認(rèn)為是造成癌癥轉(zhuǎn)移、腫瘤化療和放療抵抗的主要原因之一。最初在《本草綱目》中記載，壁虎，亦稱守宮或天龍，是一種傳統(tǒng)的中藥材。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，壁虎被證實在肝癌中具有抗腫瘤作用[15]，但其對腫瘤干性的影響未見相關(guān)報道。本研究探討壁虎對肝癌干性的影響，并闡述其作用機(jī)制，以望為其臨床治療肝癌提供新的依據(jù)。

1材料

11藥材鮮壁虎Gekko swinhonis Gunther購自河北祁奧中藥飲片有限公司，經(jīng)由作者鑒定后使用。經(jīng)冷凍、研磨、溶解、過濾等步驟后制成鮮壁虎水提取物，經(jīng)BCA法定量后，制成質(zhì)量濃度100 g·L-1的溶液。endprint

12動物BALB/c裸小鼠45只，雄性，4周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號SCXK（滬）20120002。裸鼠飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，實驗動物相關(guān)操作符合動物倫理學(xué)要求。

13試劑βcatenin（510672AP），CD133（184701AP），cMyc（108281AP），CCND1（601861Ig），Sox2（110641AP），Oct4（112631AP），Nanog（142951AP），ABCG2（100511AP），GAPDH（600041Ig）均購自中國Proteintech公司；LRP6（2560），F(xiàn)rizzled6（5158），CD44（3570）均購自美國CST公司；細(xì)胞裂解液（S3090）購自碧云天生物技術(shù)公司；COIP試劑盒（Thermo公司，美國）；LowInput QuickAmp Labeling Kit，Gene Expression Hybridization Kit 及基因芯片均購自德國Agilent公司。

14儀器移液器（GeneTex公司，美國）；化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀（BIOTEK公司，美國）；超速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國）；Agilent Scanner G2505C（Agilent 公司，德國）；垂直電泳儀（BioRad公司，美國）；轉(zhuǎn)膜儀（BioRad公司，美國）。

2方法

21細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞Huh7和Hep3B購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清，100 kU·L-1青霉素，100 kU·L-1鏈霉素的DMEM培基，在37 ℃，5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。

22細(xì)胞藥物敏感度實驗（MTT法）取對數(shù)生長期細(xì)胞，1萬個細(xì)胞/孔種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后加入含不同濃度（0，005，01，025，05，1，25，5 g·mL-1）壁虎水提取物的培基培養(yǎng)一定時間，每孔加入MTT溶液（5 g·L-1）20 μg，37 ℃孵箱中繼續(xù)孵育4 h，再加入DMSO，選擇570 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度。

23腫瘤球培養(yǎng)細(xì)胞用含不同濃度壁虎水提取物的培基培養(yǎng)一定時間（0，01，025 g·mL-1）處理48 h后，取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化后充分洗滌棄去培養(yǎng)液中殘留的血清，接種于低黏附性6孔板中，每孔5 000個細(xì)胞，4 mL腫瘤球培基（DMEM/F12+B27+bFGF+EGF）培養(yǎng)2～3周后觀察腫瘤球的形成情況。

24流式檢測細(xì)胞表面標(biāo)記細(xì)胞用含不同濃度壁虎水提取物的培基培養(yǎng)一定時間（0，01，025 g·mL-1）處理48 h后，取對數(shù)生長期細(xì)胞約1×106個細(xì)胞，洗滌細(xì)胞后，用含一抗的PBS重懸細(xì)胞，冰上孵育20～45 min，離心后用PBS洗滌2次，重懸于含熒光二抗的PBS中，冰上孵育20～45 min，離心后用PBS洗滌2次，上機(jī)檢測。

25動物造模取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105，2×105，5×105 個/100 μL的梯度接種于裸鼠皮下，每個梯度15只裸鼠。壁虎水提取物0，1，3 mg·g-13個梯度每周灌胃給藥2次，2個月后，觀察裸鼠皮下瘤的形成情況。

26基因表達(dá)譜檢測細(xì)胞用含不同濃度壁虎水提取物的培基培養(yǎng)一定時間（0，025 g·mL-1）處理48 h后，提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)定量后，用熒光染料標(biāo)記RNA，再將標(biāo)記的RNA與基因芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用Agilent Scanner G2505C 掃描芯片熒光信號，篩選出差異基因后，進(jìn)行KEGG通路分析。

27Western blot檢測相關(guān)基因蛋白的表達(dá)細(xì)胞用含不同濃度壁虎水提取物的培基培養(yǎng)一定時間（0，025 g·mL-1）處理48 h后，加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心20 min取上清測蛋白濃度。經(jīng)8%～10%SDS PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在3%BSA中封閉1 h，一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜后再用HRP耦聯(lián)的二抗室溫孵育15 h，洗膜后加ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光。

28免疫共沉淀將壁虎水提取物與磁珠孵育固定化后，提取細(xì)胞總蛋白，與上述的磁珠在4 ℃中共孵育過夜進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，后洗脫共沉淀的蛋白，對獲取的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，篩選出差異蛋白或是對獲取的蛋白進(jìn)行Western blot檢測驗證質(zhì)譜的結(jié)果。具體操作步驟按照免疫共沉淀試劑盒的說明書進(jìn)行。

29統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 210進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示；計量資料采用單因素方差分析（OneWay ANOVA）用于多組間的比較，采用t檢驗用于2組間比較。P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

31抑制肝癌細(xì)胞的增殖肝癌細(xì)胞經(jīng)壁虎處理后，壁虎對肝癌細(xì)胞的影響呈現(xiàn)出劑量和時間依賴性，隨著壁虎濃度的增加及處理時間的延長（IC50的藥物濃度處理細(xì)胞），其對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用越顯著。壁虎作用于肝癌細(xì)胞48 h，其對Huh7細(xì)胞的IC50是（0750±0112） g·mL-1，其對Hep3B細(xì)胞的IC50是（0454±0039） g·mL-1。而當(dāng)壁虎質(zhì)量濃度小于025 g·mL-1時，對肝癌細(xì)胞增殖無明顯影響，見圖1。

32壁虎抑制肝癌的干細(xì)胞特性肝癌細(xì)胞增殖受抑制可能會影響其干細(xì)胞特性，為排除增殖對干細(xì)胞特性的影響，選取01 g·mL-1和025 g·mL-12個濃度梯度的壁虎處理肝癌細(xì)胞。經(jīng)處理后的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)形成的腫瘤球的數(shù)目和大小均較對照組（0 g·mL-1）明顯縮小（P<005），并且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，見圖2。同時，經(jīng)不同濃度壁虎處理的肝癌細(xì)胞，其干細(xì)胞標(biāo)志物CD44，CD133的比例也明顯減少（P<005），也呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，見圖2。

進(jìn)一步在動物體內(nèi)證實壁虎對肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的影響，結(jié)果顯示，壁虎能夠抑制肝癌在體內(nèi)的成瘤能力，且壁虎的濃度越大其對肝癌細(xì)胞成瘤能力的抑制越顯著，見圖3。endprint

33壁虎通過抑制Wnt通路進(jìn)而影響肝癌的干細(xì)胞特性為進(jìn)一步闡明壁虎影響肝癌干細(xì)胞特性的具體機(jī)制，將肝癌細(xì)胞經(jīng)壁虎處理后與未經(jīng)壁虎處理的肝癌細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。篩選出差異基因（倍數(shù)改變≥2倍），經(jīng)KEGG通路分析表明，壁虎在肝癌細(xì)胞中主要影響Wnt通路，見圖4。

進(jìn)一步檢測Wnt通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子βcatenin及其經(jīng)典靶基因CD44，cMyc，CCND1的表達(dá)，結(jié)果表明在肝癌細(xì)胞中經(jīng)壁虎處理后Wnt通路的活性發(fā)生下調(diào)。Wnt通路與肝癌的干細(xì)胞特性密切相關(guān)，進(jìn)一步檢測干細(xì)胞特性的相關(guān)指標(biāo)Sox2，Oct4，Nanog，ABCG2等表達(dá)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)壁虎處理的肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白發(fā)生下調(diào)，見圖5。

34壁虎靶向LRP6后影響肝癌細(xì)胞Wnt通路活性通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析，篩選出與壁虎可能存在相互作用的蛋白，見表1。為篩選出的評分最高的10個相互作用蛋白。其中LRP6為Wnt通路的關(guān)鍵膜受體分子，進(jìn)一步通過免疫共沉淀檢測壁虎對LRP6的影響，結(jié)果顯示，壁虎對LRP6的表達(dá)量并無影響，而是影響了LRP6與另一關(guān)鍵Wnt通路信號分子Frizzled6的結(jié)合，隨著壁虎濃度的增加，LRP6與Frizzled6的結(jié)合量逐漸減少，見圖6。

4討論

壁虎已被證實能夠發(fā)揮抑制腫瘤增殖及侵襲轉(zhuǎn)移、促腫瘤凋亡、抗血管生成及免疫調(diào)節(jié)等多種功能[23，6]，其在肝癌中能夠促進(jìn)肝癌的分化從而發(fā)揮抗腫瘤作用[1，5]?？梢姡诨⒖赡苡绊懜伟┑母杉?xì)胞特性。本研究表明，壁虎可以抑制肝癌的干細(xì)胞特性在體內(nèi)外呈現(xiàn)出抗腫瘤效應(yīng)，其對肝癌干性的影響是通過抑制Wnt通路的活性而實現(xiàn)的。

細(xì)胞的增殖會對侵襲轉(zhuǎn)移、干性等多種功能的檢測產(chǎn)生影響。與前期相關(guān)報道一致，在本研究中證實了壁虎能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖，后續(xù)實驗選取了對肝癌細(xì)胞增殖無明顯影響的壁虎濃度梯度對細(xì)胞進(jìn)行處理。

腫瘤的干細(xì)胞特性已經(jīng)被證實與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移

與正常對照組相比1）P<005，2）P<001，3）P<0001（圖5同）。

密切相關(guān)，直接影響腫瘤患者的預(yù)后。其中各種腫瘤標(biāo)記物的檢測常被用于反應(yīng)干細(xì)胞比例，在肝癌中，CD44及CD133是肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物，通過檢測CD44，CD133的細(xì)胞比例能夠反映肝癌的干細(xì)胞比例[7]。檢測腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性的“金標(biāo)準(zhǔn)”是通過檢測其成瘤的能力。在相同細(xì)胞濃度的移植瘤中，成瘤能力越強(qiáng)則表明腫瘤的干性越強(qiáng)。在本研究中，壁虎能夠在體內(nèi)外抑制肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性。

Wnt通路已被證實在維持干細(xì)胞特性中發(fā)揮重要作用[8]。Wnt通路的信號分子通過結(jié)合于細(xì)胞膜表面的Frizzled受體后，進(jìn)一步與LRP5/6形成細(xì)胞表面的膜分子復(fù)合物，該復(fù)合物抑制βcatenin的降解復(fù)合物APC/AXIN1/GSK3β對βcatenin的泛素化降解，從而使得βcatenin能夠入核促進(jìn)包括cMyc，CCND1，CD44等多個靶基因的轉(zhuǎn)錄，激活Wnt信號通路發(fā)揮促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移、干性等作用[911]。

本研究表明，壁虎能通過下調(diào)Wnt通路的活性從而抑制Sox2，Oct4，Nanog，ABCG2等多個腫瘤干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，實現(xiàn)對肝癌干性的抑制。研究表明壁虎可能是通過其提取物中的蛋白成分發(fā)揮作用[23]，這為采用研究蛋白相互作用的方法，探索壁虎可能的相互作用靶點(diǎn)提供了可能[12]。本研究通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析的方法研究壁虎的相互作用靶點(diǎn)，壁虎起作用成分為蛋白大分子，首先考慮其作用靶點(diǎn)位于細(xì)胞膜表面。對篩選出的可能作用靶點(diǎn)進(jìn)行免疫共沉淀聯(lián)合Western blot驗證分析，證實了LRP6為壁虎的作用靶點(diǎn)，壁虎通過與LPR6相互作用后，阻止了LRP6與Frizzled的結(jié)合，從而抑制了Wnt信號通路的活性。本研究首次通過蛋白互相作用的研究方法尋找出了壁虎的具體作用靶

點(diǎn)，進(jìn)一步闡明了其在肝癌中發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機(jī)制。

綜上可知，在肝癌中，壁虎通過作用于LPR6膜受體，阻止了LRP6與Frizzled復(fù)合物的形成，下調(diào)了Wnt信號通路活性，從而抑制肝癌的干細(xì)胞特性，發(fā)揮壁虎的抗肝癌作用。該研究著眼于肝癌干細(xì)胞特性相關(guān)的分子機(jī)制及生物學(xué)事件，將可能有利于改善肝癌患者的預(yù)后情況以及總體生存率，為壁虎臨床運(yùn)用于肝癌的治療提供了理論依據(jù)。

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[責(zé)任編輯張寧寧]endprint