嗜卷書(shū)虱羧酸酯酶CarE基因克隆及表達(dá)分析

唐培安 李非凡 王進(jìn)軍 沈 飛 宋 偉

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心1，南京 210023)(西南大學(xué)；重慶市昆蟲(chóng)學(xué)及害蟲(chóng)控制工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，重慶 400716)

嗜卷書(shū)虱羧酸酯酶CarE基因克隆及表達(dá)分析

唐培安1李非凡1王進(jìn)軍2沈 飛1宋 偉1

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心1，南京 210023)(西南大學(xué)；重慶市昆蟲(chóng)學(xué)及害蟲(chóng)控制工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，重慶 400716)

為探明羧酸酯酶CarE在嗜卷書(shū)虱抗藥性中的作用，本研究采用RT-PCR和RACE方法，從嗜卷書(shū)虱體內(nèi)克隆獲得了2條CarE基因全長(zhǎng)序列，命名為L(zhǎng)best1與Lbest2(GenBank登錄號(hào)分別為EU854151與EU854152)，2條基因全長(zhǎng)為2 049和2 525 bp，編碼570和617個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，理論等電點(diǎn)分別為6.85和4.74。2條基因均具有昆蟲(chóng)羧酸酯酶的催化活性位點(diǎn)和保守序列，并具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，2條CarE基因均屬于羧酸酯酶的F簇。定量分析結(jié)果表明，Lbest2在敵敵畏和磷化氫抗性品系中的表達(dá)水平均顯著高于敏感品系(P<0.05)，而Lbest1在不同品系中的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異；敵敵畏和磷化氫處理均可誘導(dǎo)2條基因表達(dá)水平的提高；Lbest1在發(fā)育過(guò)程中表達(dá)水平逐漸降低，而Lbest2在若蟲(chóng)期表達(dá)水平維持不變。結(jié)果表明，Lbest1主要參與調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，Lbest2具有降解外源性物質(zhì)和代謝解毒的功能。

嗜卷書(shū)虱 羧酸酯酶 抗性機(jī)理 基因克隆

羧酸酯酶(CarE)屬于絲氨酸水解酶家族，廣泛存在于生物體的組織與器官內(nèi)，其活性中心含一個(gè)Ser殘基，能有效催化含羧基酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵的內(nèi)源性與外源性多種化合物的水解[1]。在昆蟲(chóng)體內(nèi)CarE是最重要的解毒酶之一，它能與有機(jī)磷酸酯、氨基甲酸酯、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生特異性親和，使殺蟲(chóng)藥劑降解，從而保護(hù)昆蟲(chóng)免受殺蟲(chóng)藥劑毒害[2-4]。大量研究表明，CarE解毒代謝活性的增強(qiáng)是昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的重要機(jī)理之一[5-8]。棉鈴蟲(chóng)對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的抗性以及玉米象對(duì)β-細(xì)辛醚的抗性均與CarE解毒代謝活性的增強(qiáng)直接關(guān)聯(lián)[9-10]。進(jìn)一步研究CarE與昆蟲(chóng)抗藥性的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，許多昆蟲(chóng)，如飛蝗L.migratoria、稻縱卷葉螟C.medinalis以及大豆蚜A.glycines等，其對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性是由于CarE基因的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致其活性增強(qiáng)所致[11-13]。

嗜卷書(shū)虱(Liposcelisbostrychophila)隸屬于嚙目(Psocoptera)、書(shū)虱科(Liposcelididae)，是一種重要的儲(chǔ)藏物害蟲(chóng)，我國(guó)大部分地區(qū)都有嗜卷書(shū)虱的分布，近年來(lái)隨著儲(chǔ)糧熏蒸劑和保護(hù)劑的大量應(yīng)用，嗜卷書(shū)虱抗性問(wèn)題日益突出，而關(guān)于嗜卷書(shū)虱抗性機(jī)理的研究大部分都集中在乙酰膽堿酯酶(AChE)、多功能氧化酶(MFO)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等方面，關(guān)于CarE分子特性及其在抗性形成中的作用報(bào)道較少。據(jù)此，本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了嗜卷書(shū)虱體內(nèi)2條CarE基因的全長(zhǎng)序列，進(jìn)而應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究其在不同品系、不同發(fā)育階段以及藥劑誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)水平，旨在為揭示CarE在嗜卷書(shū)虱抗性形成過(guò)程中的作用，制定抗性治理策略提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試書(shū)虱

嗜卷書(shū)虱敏感品系(Susceptible strain，SS)：源于1990年建立的嗜卷書(shū)虱種群，該種群采自西南大學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)及害蟲(chóng)控制工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(原西南農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用昆蟲(chóng)與螨類(lèi)生態(tài)研究室)模擬糧倉(cāng)中。飼養(yǎng)方法如下：在實(shí)驗(yàn)室(27±1) ℃、(75 ± 5)% RH、不予光照、不接受任何藥劑的條件下以全麥粉、酵母粉和脫脂奶粉(10∶1∶1)混合而成的飼料飼養(yǎng)，該品系也被用于基因克隆試驗(yàn)。

敵敵畏抗性品系(DDVP-R)：飼養(yǎng)方法相同，每一個(gè)月間隔用適當(dāng)濃度的敵敵畏丙酮溶液熏蒸處理一次，保持成蟲(chóng)的死亡率在75%左右，所獲得的品系抗性倍數(shù)達(dá)22.36，作為敵敵畏抗性品系。

磷化氫抗性品系(PH3-R)：飼養(yǎng)方法相同，每一個(gè)月間隔用一定量的PH3氣體熏蒸處理一次，保持成蟲(chóng)的死亡率在75%左右，所獲得的品系抗性倍數(shù)達(dá)4.51，作為磷化氫的抗性品系。

1.1.2 主要試劑

DEPC：Amersco公司；DNA凝膠回收試劑盒：上海華舜公司；TRIzol Isolation Reagent：Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、載體pMD 18-T Vector、DH5α感受態(tài)細(xì)胞competent cell、3’-Full RACE 試劑盒：TaKaRa公司；5’-Full RACE試劑盒：Clontech和Invitrogen公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取

稱(chēng)取20 mg嗜卷書(shū)虱羽化后3～5 d的雌成蟲(chóng)(約1 000頭)，放于滅菌的研缽中，液氮速凍后迅速研碎，后續(xù)步驟參照TRIzol Isolation Reagent試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用SmartSpecTM 3000核酸濃度分析儀(美國(guó)BIO-RAD公司)檢測(cè)RNA純度與濃度提取的RNA樣品置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 第一鏈cDNA的合成及PCR擴(kuò)增

合成第一鏈cDNA的反應(yīng)體系分別參照3’-Full RACE 試劑盒(TaKaRa)與5’-Full RACE試劑盒(Clontech)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)，在72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；第二輪半套式PCR反應(yīng)，將第一輪的PCR產(chǎn)物作為模板，退火溫度為53 ℃，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，其他與第一輪相同。使用特異性引物擴(kuò)增3’或5’端時(shí)，退火溫度參照試劑盒的要求以及基因特異性引物的退火溫度設(shè)定，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)參照試劑盒說(shuō)明，其他條件相同。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%的瓊脂糖膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物克隆與測(cè)序

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)目的電泳條帶進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物用pGEM?-T Easy vector連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌(E.coliDH5α)。挑選陽(yáng)性克隆經(jīng)菌液檢測(cè)后送Invitrogen公司測(cè)序。

1.2.4 基因表達(dá)模式研究

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real time PCR)方法，測(cè)定嗜卷書(shū)虱不同品系(SS、DDVP-R、PH3-R)、不同發(fā)育時(shí)期(1齡、2齡、3齡、4齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng))和藥劑誘導(dǎo)前后2條CarE基因mRNA表達(dá)水平。

不同品系：包括敏感品系(SS)、敵敵畏抗性品系(DDVP-R)和磷化氫抗性品系(PH3-R)等3個(gè)品系，RNA提取等方法相同，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

不同發(fā)育時(shí)期：參考Wang等[14]的方法挑取嗜卷書(shū)虱敏感品系1齡、2齡、3齡、4齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)進(jìn)行RNA提取。

藥劑誘導(dǎo)：挑取嗜卷書(shū)虱敏感品系雌成蟲(chóng)30 mg，放入直徑2 cm的塑料小盒中，用160目尼龍絲網(wǎng)作盒蓋，將裝有書(shū)虱的小盒放入廣口瓶中，加入5 mg/L的敵敵畏丙酮溶液4 μL或磷化氫氣體6 μL，并設(shè)無(wú)藥劑處理的對(duì)照，密閉后放置在(27±1) ℃、全黑暗條件下熏蒸處理18 h(死亡率在30%左右)；挑取熏蒸后仍存活的書(shū)虱20 mg提取總RNA。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real time PCR)方法：使用β-actin作為內(nèi)參基因，20 μL Real time PCR反應(yīng)體系中包括：2× MasterMix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA 模板2 μL以及ddH2O 6 μL。循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；隨后進(jìn)行40個(gè)95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s的循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火結(jié)束后進(jìn)行熒光信號(hào)采集。循環(huán)結(jié)束后以0.5 ℃/10 s的速度從60 ℃緩慢遞增到95 ℃，連續(xù)測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度以獲取熔解曲線，以確定無(wú)引物二聚體或非特異性擴(kuò)增發(fā)生。每個(gè)樣品至少重復(fù)3次。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

多重序列比對(duì)和氨基酸序列的推導(dǎo)使用DNAMAN軟件完成；BLAST搜索、開(kāi)放閱讀框(ORF)的查找以及酶的催化三聯(lián)體的預(yù)測(cè)在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI) 站點(diǎn)完成；采用 ExPASy 在線軟件預(yù)測(cè)酶的分子質(zhì)量(MM)和等電點(diǎn)(pI)；使用Mega 5.1 軟件針對(duì)氨基酸序列進(jìn)行Neighbor-Joining聚類(lèi)分析，信號(hào)肽的預(yù)測(cè)使用在線軟件SignalP 3.0完成(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。使用NetNGlyc1.0 Server 軟件對(duì)編碼蛋白糖基化位點(diǎn)(N-glycosylation site)進(jìn)行預(yù)測(cè)；Scanprosite(http://www.expasy.org/prosite/)用于預(yù)測(cè)氨基酸序列的磷酸化位點(diǎn)等。

1.2.6 引物設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)克隆試驗(yàn)所用引物；使用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3.0 (http://frodo.wi.mit.edu/)設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物，引物序列與擴(kuò)增效率見(jiàn)表1；進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR并獲得相應(yīng)Ct值后，采用2-ΔΔCt法比較目的基因在各個(gè)檢測(cè)試驗(yàn)中表達(dá)水平的差異；采用SPSS13.0軟件中ANOVA單因素分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

表1 引物序列與擴(kuò)增效率

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜卷書(shū)虱CarE基因全長(zhǎng)序列的克隆及分析

利用羧酸酯酶簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增，結(jié)果顯示有1條與預(yù)測(cè)長(zhǎng)度相符的條帶，經(jīng)克隆測(cè)序后得到2個(gè)不同的基因片段，2個(gè)片段長(zhǎng)度均為344 bp，編碼114個(gè)氨基酸，是完整的編碼序列。將2個(gè)片段所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行BLASTP搜索，結(jié)果表明，這2個(gè)基因片段與其他昆蟲(chóng)CarE基因具有很高的同源性。

根據(jù)克隆獲得的2個(gè)CarE基因片段，分別使用擴(kuò)增3’端和5’端的基因特異引物，利用RACE技術(shù)成功地克隆獲得了嗜卷書(shū)虱2個(gè)CarE基因的全長(zhǎng)序列，分別命名為L(zhǎng)best1(GenBank登錄號(hào)：EU854151)和Lbest2(GenBank登錄號(hào)：EU854152)。核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列見(jiàn)圖1、圖2。

2.2 嗜卷書(shū)虱CarE氨基酸序列分析

由表2可知，Lbest1基因全長(zhǎng)為2 049 bp，其中開(kāi)放閱讀框1 713 bp，編碼一個(gè)570個(gè)氨基酸組成的前體蛋白，N端無(wú)信號(hào)肽；成熟蛋白的分子質(zhì)量為61.4 kDa，理論等電點(diǎn)為6.85；Lbest1含有cAMP和cGMP依賴(lài)的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)2個(gè)，分別對(duì)應(yīng)推導(dǎo)的氨基酸編號(hào)為：102～105、283～286；蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)9個(gè)，分別對(duì)應(yīng)推導(dǎo)的氨基酸編號(hào)為：24～26、281～283、286～288、302～304、390～392、403～405、431～433、462～464和567～569；酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)7個(gè)，分別對(duì)應(yīng)推導(dǎo)的氨基酸編號(hào)為：46～49、93～96、177～180、302～305、358～361、411～414、519～522。

Lbest2基因全長(zhǎng)為2 525 bp，包括由76個(gè)核苷酸組成的5’非編碼區(qū)序列、由1 854個(gè)核苷酸組成的ORF和由595個(gè)核苷酸組成的3’非編碼區(qū)序列。ORF編碼617個(gè)氨基酸組成的前體蛋白，其中包括了由17個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽；成熟蛋白的分子質(zhì)量為67.3 kDa，理論等電點(diǎn)為4.74。Lbest2含有cAMP和cGMP依賴(lài)的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)1個(gè)，對(duì)應(yīng)推導(dǎo)的氨基酸編號(hào)為：89～92；蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)5個(gè)，分別對(duì)應(yīng)推導(dǎo)的氨基酸編號(hào)為：87～89、88～90、353～355、592～594和603～605；酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)10個(gè)，分別對(duì)應(yīng)推導(dǎo)的氨基酸編號(hào)為：136～139、142～145、292～295、322～325、341～344、347～350、363～366、538～541、543～546以及575～578。另外，通過(guò)預(yù)測(cè)Lbest2還含有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(161和184)。

表2 嗜卷書(shū)虱2個(gè)全長(zhǎng)羧酸酯酶的氨基酸序列特征

將嗜卷書(shū)虱和其他昆蟲(chóng)CarE的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。由圖3可見(jiàn)，不同昆蟲(chóng)CarE之間在活性位點(diǎn)附近的氨基端序列保守性較高，如保守的催化三聯(lián)體(GESAG-E-H)、6個(gè)保守的半胱氨酸殘基形成三對(duì)二硫鍵及FGESAG序列等。

根據(jù)在線軟件ScanProsite的算法原理，CarE有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，1個(gè)是絲氨酸活性中心：F-[GR]-G-x (4)-[LIVM]-x-[LIV]-x-G-x-S-[STAG]-G，另1個(gè)是二硫鍵形成的位點(diǎn)：[ED]-D-C-L-[YT]-[LIV]-[DNS]-[LIV]-[LIV-FYW]-x-[PQR](其中“[ ]”表示不同物種在該位點(diǎn)是其中的1個(gè)氨基酸)。本試驗(yàn)克隆獲得的嗜卷書(shū)虱2條CarE經(jīng)該軟件分析均發(fā)現(xiàn)了CarE的保守結(jié)構(gòu)域，Lbest1的絲氨酸活性中心為“FGGDPNKVTIFGESAG”，二硫鍵形成的位點(diǎn)為“EDCLFLNVFTP”；Lbest2的絲氨酸活性中心為“FGGDPNRITLFGESAG”，二硫鍵形成的位點(diǎn)為“EDCLYLNIYSP”。

圖2 嗜卷書(shū)虱Lb est2的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.3 嗜卷書(shū)虱CarE氨基酸序列聚類(lèi)分析

選取雙翅目、鞘翅目、直翅目等共9個(gè)代表性昆蟲(chóng)的CarE氨基酸序列以及本試驗(yàn)獲得的嗜卷書(shū)虱Lbest1、Lbest2序列，參考Oakeshott等[15]對(duì)羧酸酯酶的研究方法，使用Mega 5.1 軟件進(jìn)行Neighbor-Joining聚類(lèi)分析；結(jié)果由圖4可知，Lbest1與Lbest2均被劃分在F簇中，該簇主要由非鱗翅目昆蟲(chóng)的保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase，JHE)組成；F簇屬于第二功能組(Secreted catalytic class)，組內(nèi)主要包括與激素降解相關(guān)的酶類(lèi)。嗜卷書(shū)虱的Lbest1先與黃星天牛、黑腹果蠅、黃粉蟲(chóng)、蟋蟀的JHE聚類(lèi)在一起，然后與本試驗(yàn)獲得的另一個(gè)Lbest2匯成一大類(lèi)。

注：保守的氨基酸殘基用黑色表示，﹡代表活性中心的催化三聯(lián)體位點(diǎn)；Md_CarE: 家蠅CarE Musca domestica (AAD29685); Cp_CarE: 庫(kù)蚊CarE Culex pipiens quinquefasciatus (EDS26821); Hd_CarE: 棉鈴蟲(chóng)CarE Helicoverpa armigera (ABQ42338); Lb_est1: 嗜卷書(shū)虱CarE1 Liposcelis bostrychophila (EU854151); Lb_est2: 嗜卷書(shū)虱 CarE2 Liposcelis bostrychophila (EU854152)。圖3 嗜卷書(shū)虱CarE與其他昆蟲(chóng)酯酶序列的多重比對(duì)

注： Ph為黃星天牛; Dm為黑腹果蠅; Tm為黃粉蟲(chóng); Ga為蟋蟀; Apol為蠶蛾; AM為蜜蜂; Bm為家蠶; Snon為地中海玉米螟; Slit為斑馬魚(yú)圖4 昆蟲(chóng)CarE和酯酶氨基酸序列的聚類(lèi)分析

2.4 2條CarE基因在不同品系中的表達(dá)水平研究

嗜卷書(shū)虱2個(gè)CarE基因(Lbest1和Lbest2)在不同品系中的相對(duì)表達(dá)水平見(jiàn)圖5。在嗜卷書(shū)虱體內(nèi)Lbest2的表達(dá)水平顯著高于Lbest1，在敵敵畏抗性品系、磷化氫抗性品系以及敏感品系中的比值分別達(dá)到2.22、1.85和1.65倍(P<0.05)。其中Lbest1在抗性品系中的表達(dá)水平高于敏感品系，但差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)。Lbest2在兩抗性品系中的表達(dá)水平均顯著高于敏感品系(P<0.05)，其中在敵敵畏抗性品系中的表達(dá)水平最高，達(dá)到敏感品系的1.9倍，在磷化氫抗性品系中的表達(dá)水平是敏感品系的1.4倍。

注：同一顏色柱上不同字母表示差異顯著 (P<0.05)，余同。圖5 嗜卷書(shū)虱2個(gè)CarE基因在不同品系中表達(dá)水平的比較

2.5 藥劑處理對(duì)CarE基因mRNA表達(dá)水平的影響

從圖6中可以看出，敵敵畏和磷化氫均可誘導(dǎo)嗜卷書(shū)虱體內(nèi)2個(gè)CarE基因的過(guò)量表達(dá)。Lbest1經(jīng)敵敵畏和磷化氫處理后表達(dá)量分別是對(duì)照的1.76和1.47倍，三者之間差異達(dá)顯著水平(P< 0.05)。同樣，Lbest2經(jīng)敵敵畏和磷化氫處理后表達(dá)量分別是對(duì)照的1.65和1.84倍。

圖6 嗜卷書(shū)虱2個(gè)CarE基因在藥劑處理前后表達(dá)水平的比較

2.6不同發(fā)育階段CarE基因mRNA表達(dá)水平的研究

嗜卷書(shū)虱CarE基因在不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)水平見(jiàn)圖7。Lbest1在低齡若蟲(chóng)期的表達(dá)水平較高，但隨著昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)水平逐漸降低，成蟲(chóng)期表達(dá)水平最低。Lbest2在若蟲(chóng)期的表達(dá)水平較低，且在4個(gè)若蟲(chóng)齡期間的表達(dá)水平差異不顯著，但都顯著低于成蟲(chóng)期的表達(dá)水平(P<0.05)。

圖7 嗜卷書(shū)虱2個(gè)CarE基因在不同發(fā)育階段表達(dá)水平的比較

3 討論

本研究從嗜卷書(shū)虱體內(nèi)克隆得到2個(gè)CarE基因的全長(zhǎng)序列，通過(guò)軟件預(yù)測(cè)到2條基因均存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，Lbest1無(wú)信號(hào)肽，所以也無(wú)糖基化位點(diǎn)，為非糖基化蛋白，這與Vaughan等[16]對(duì)蚊蟲(chóng)羧酸酯酶的結(jié)果類(lèi)似，由此推測(cè)其并非胞內(nèi)蛋白。而Lbest2預(yù)測(cè)到2個(gè)糖基化位點(diǎn)，糖基化修飾是生物體內(nèi)最為重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式之一，有研究表明，糖基化修飾可以增強(qiáng)羧酸酯酶的穩(wěn)定性[17-18]，使用SignalP 3.0預(yù)測(cè)結(jié)果顯示5’端有17個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列，因此該蛋白為分泌型蛋白。

聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，Lbest1與Lbest2均被劃分在F簇中，該簇主要由非鱗翅目昆蟲(chóng)的保幼激素酯酶組成[15]。保幼激素是昆蟲(chóng)發(fā)育和繁殖過(guò)程中的關(guān)鍵激素，會(huì)由于保幼激素酯酶的水解作用而影響其濃度高低，從而調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育[19-21]。有研究發(fā)現(xiàn)，具有水解保幼激素功能的氨基酸其催化三聯(lián)體為S-E-H[22]，這與本研究發(fā)現(xiàn)的Lbest1與Lbest2催化三聯(lián)體序列一致。因此推測(cè)Lbest1與Lbest2在嗜卷書(shū)虱變態(tài)發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用。

基因定量分析結(jié)果顯示，Lbest1在不同品系中的表達(dá)水平差異不顯著；而不同發(fā)育時(shí)期的定量結(jié)果表明，該基因隨著昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)水平逐漸降低，成蟲(chóng)期表達(dá)水平最低；結(jié)合聚類(lèi)分析結(jié)果，認(rèn)為L(zhǎng)best1主要在調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到重要作用。Lbest2在敵敵畏抗性品系中的表達(dá)水平最高，達(dá)到敏感品系的1.9倍，在磷化氫抗性品系中的表達(dá)水平是敏感品系的1.4倍，且2種藥劑均可誘導(dǎo)該基因表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明Lbest2與敵敵畏和磷化氫的抗性有關(guān)。前人研究表明，羧酸酯酶介導(dǎo)害蟲(chóng)抗藥性主要是通過(guò)提高對(duì)殺蟲(chóng)劑的水解活性，增強(qiáng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的阻隔或者改變酶與底物的親和力來(lái)發(fā)揮作用[23-24]，而羧酸酯酶基因mRNA表達(dá)量的增加常常導(dǎo)致昆蟲(chóng)抗藥性的增強(qiáng)[25-26]。嗜卷書(shū)虱Lbest2在抗性品系中的表達(dá)水平顯著高于敏感品系而且在受到藥劑處理時(shí)過(guò)量表達(dá)，由此推測(cè)Lbest2主要參與外源性物質(zhì)的降解，具有代謝解毒的功能。

4 結(jié)論

本研究成功擴(kuò)增了2條嗜卷書(shū)虱CarE基因，通過(guò)軟件預(yù)測(cè)、同源性比對(duì)、qRT-PCR技術(shù)以及聚類(lèi)分析等研究方法，比較并分析了2條嗜卷書(shū)虱CarE可能具有的功能，從而為解析嗜卷書(shū)虱生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及抗藥性形成的機(jī)理以及嗜卷書(shū)虱抗藥性治理提供了參考。

[1]Zhang Y, Wang L, Guo H, et al. A transcriptome-based screen of carboxylesterase-like genes that are involved in chlorpyrifos resistance inLaodelphaxstriatellus(Fallén)[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2012, 104(3): 224-228

[2]He P, Zhang Y N, Yang K, et al. An antenna-biased carboxylesterase is specifically active to plant volatiles inSpodopteraexigua[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2015, 123: 93-100

[3]Lü F G, Fu K Y, Li Q, et al. Identification of carboxylesterase genes and their expression profiles in the Colorado potato beetleLeptinotarsadecemlineatatreated with fipronil and cyhalothrin[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2015, 122: 86-95

[4]Wei P, Shi L, Shen G, et al. Characteristics of carboxylesterase genes and their expression-level between acaricide-susceptible and resistantTetranychuscinnabarinus(Boisduval)[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2016, 131: 87-95

[5]Dou W, Xiao L S, Niu J Z, et al. Characterization of the purified glutathione S-transferases from two psocidsLiposcelisbostrychophilaandL.entomophila[J]. Agricultural Sciences in China, 2010, 9(7): 1008-1016

[6]Grigoraki L, Balabanidou V, Meristoudis C, et al. Functional and immunohistochemical characterization of CCEae3a, a carboxylesterase associated with temephos resistance in the major arbovirus vectorsAedesaegyptiandAe.albopictus[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2016, 74: 61-67

[7]Vontas J G, Hejazi M J, Hawkes N J, et al. Resistance—associated point mutations of organophosphate insensitive acetylcholinesterase, in the olive fruit flyBactroceraoleae[J]. Insect Molecular Biology, 2002, 11(4): 329-336

[8]Yang X Q. Gene expression analysis and enzyme assay reveal a potential role of the carboxylesterase gene CpCE-1 fromCydiapomonellain detoxification of insecticides[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2016, 129: 56-62

[9]許雄山, 韓召軍, 王蔭長(zhǎng). 羧酸酯酶與棉鈴蟲(chóng)對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑抗性的關(guān)系[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 22(4): 41-44

Xu X S, Han S J, Wang Y C. Relationship between carboxylesterase and organophosphate resistance in Helicoverp aarmigera (Hübner) [J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 1999, 22(4): 41-44

[10]邱艷, 宋旭紅, 黃衍章. 玉米象成蟲(chóng)對(duì) β-細(xì)辛醚中毒的行為反應(yīng)及殺蟲(chóng)機(jī)理研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2014, 29(7): 80-85

Qiu Y, Song X H, Huang Y Z.Research on behavior response and insecticidal mechanism of β-asarone against Sitophilus zeamais adult[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2014, 29(7): 80-85

[11]張建琴, 葛娉婷, 李大琪, 等. 飛蝗羧酸酯酶基因 LmCesF1 的時(shí)空表達(dá)及與殺蟲(chóng)劑耐受性的關(guān)系[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(8): 1522-1530

Zhang J Q, Ge P T, Li D Q, et al. Spatio-Temporal Expression and insecticide tolerance analysis of carboxylesterase gene LmCesF1 from locusta migratoria[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(8): 1522-1530

[12]劉蘇, 馮明峰, 何夢(mèng)竹. 稻縱卷葉螟羧酸酯酶基因的鑒定與表達(dá)譜分析[J]. 應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2015, 52(3): 662-670

Liu S, Feng M F, He M Z. Identification and expression profiles of Cnaphalocrocis medinalis carboxylesterase genes[J]. Chinese Journal of Applied Entomology, 2015, 52(3): 662-670

[13]楊帥, 王玲, 趙奎軍, 等. 大豆蚜羧酸酯酶基因 AgCarE 的克隆, 表達(dá)及活性分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(18): 3755-3763

Yang S, Wang L, Zhao K J, et al. Cloning, expression and activity analysis of Carboxylesterase gene from Aphis glycines (Hemiptera: Aphididae) [J]. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(18): 3755-3763

[14]Wang J J, Tsai J H, Zhao Z M, et al. Development and reproduction of the psocidLiposcelisbostrychophila(Psocoptera: Liposcelididae) as a function of temperature[J]. Annals of the Entomological Society of America, 2000, 93(2): 261-270

[15]Yu Q Y, Lu C, Li W L, et al. Annotation and expression of carboxylesterases in the silkworm,Bombyxmori[J]. BMC Genomics, 2009, 10(1): 553

[16]Vaughan A, Hemingway J. Mosquito carboxylesterase Estα21 (A2). Cloning and sequence of the full-length cDNA for a major insecticide resistance gene worldwide in the mosquitoCulexquinquefasciatus[J]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(28): 17044-17049

[17]周蕾, 顧建新. N-糖基化位點(diǎn)鑒定方法和非經(jīng)典 N-糖基化序列[J]. 生命科學(xué), 2011, 23(6): 605-611

Zhou L, Gu J X. N-glycosylation sites analysis and nonconsensus N-glycosylated sequences[J].Chinese Bulletin of Life Sciences, 2011, 23(6):605-611

[18]Kroetz D L, McBride O W, Gonzalez F J. Glycosylation-dependent activity of baculovirus-expressed human liver carboxylesterases: cDNA cloning and characterization of two highly similar enzyme forms[J]. Biochemistry, 1993, 32(43): 11606-11617

[19]Kamita S G, Hammock B D. Juvenile hormone esterase: biochemistry and structure[J]. Journal of Pesticide Science, 2010, 35(3): 265

[20]Zhang Y, Li S, Xu L, et al. Overexpression of carboxylesterase-1 and mutation (F439H) of acetylcholinesterase-1 are associated with chlorpyrifos resistance inLaodelphaxstriatellus[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2013, 106(1): 8-13

[21]Zhang J, Ge P, Li D, et al. Two homologous carboxylesterase genes fromLocustamigratoriawith different tissue expression patterns and roles in insecticide detoxification[J]. Journal of Insect Physiology, 2015, 77: 1-8

[22]Oakeshott J, Claudianos C, Campbell P M, et al. Biochemical genetics and genomics of insect esterases[J]. Comprehensive Molecular Insect Science, 2005, 5: 309-381

[23]Li X, Schuler M A, Berenbaum M R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics[J]. Annual Review of Entomology, 2007, 52: 231-253

[24]Li F, Han Z. Mutations in acetylcholinesterase associated with insecticide resistance in the cotton aphid,AphisgossypiiGlover[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2004, 34(4): 397-405

[25]Feng Q L, Ladd T R, Tomkins B L, et al. Spruce budworm (Choristoneurafumiferana) juvenile hormone esterase: hormonal regulation, developmental expression and cDNA cloning[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 1999, 148(1): 95-108

[26]Huang S J, Qin W J, Chen Q. Cloning, sequence analysis and expression levels of a carboxylesterase gene fromSpodopteralitura(Fab.)(Lepidoptera: Noctuidae)[J]. Acta Entomologica Sinica, 2010, 53(1): 29-37.

Gene Cloning of Carboxylesterases and mRNA Expression Level inLiposcelisBostrychophila

Tang Peian1Li Feifan1Wang Jinjun2Shen Fei1Song Wei1

(College of Food Science and Engineering; Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety. Nanjing University of Finance and Economics1, Nanjing 210023) (Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering, Southwest University2, Chongqing 400716)

The objective of this study was to explore the function of carboxylesterase gene in pesticide detoxification. TheLbest1 andLbest2 encoding CarE (GenBank Accession No are EU854151 and EU854152) were cloned fromL.bostrychophilain the way of reverse transcriptase PCR (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE). Full-length of these two genes were 2 049 and 2 525 bp, encoded 570 and 617 amino acids, the isoelectric point were 6.85 and 4.74 respectively. Phosphorylation sites were predicted and gene sequences were analyzed, both two genes contained the catalytic activity sites and conserved sequences of the insect carboxylesterase gene as a result. Cluster analysis showed that these two genes were clustered in clade F catalytic activity sites. qRT-PCR (quantitative real time PCR) was used to test the mRNA expression level of these two carboxylesterase gene among different strains, different developmental stages, and after treatment by DDVP or PH3were also studied. Based on the results, it was concluded thatLbest1 could regulate the growth and development of insects,Lbest2 might play an important role in metabolic detoxification and degradation of exogenous substances.

liposcelisbostrychophila, carboxylesterases, resistance mechanism, gene clone

S482.6

A

1003-0174(2017)10-0130-10

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)專(zhuān)項(xiàng)(2016YFD0401004、2017YFD040 1003)，糧食公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201413007-2、201513002-5)，江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助(JSYXK201403)

2017-04-30

唐培安，男，1981年出生，副教授，糧食儲(chǔ)藏

王進(jìn)軍，男，1970年出生，教授，昆蟲(chóng)學(xué)