銅綠微囊藻水華聚集對(duì)黑麥草生理生態(tài)的影響

邱穎　張瓊　張雪　李石晶　孫靖

摘要：指出了藍(lán)藻水華聚集引起水體環(huán)境惡化，人們可利用生物浮床來凈化此類水體，黑麥草是供選擇的浮床生物之一。在實(shí)驗(yàn)室中模擬生態(tài)浮床，探索了5種不同初始濃度的銅綠微囊藻接種后，生長(zhǎng)于浮床上的黑麥草的生長(zhǎng)情況及其生理響應(yīng)，并比較了水體凈化效果。結(jié)果表明：接種處理組的黑麥草的根長(zhǎng)、鮮重與空白相比，都呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，但當(dāng)藍(lán)藻初始接種量達(dá)0.278 g/L時(shí)，生長(zhǎng)情況較其他接種組變差；黑麥草葉片可溶性蛋白、MDA含量在大部分接種組都增加。此外，不接種藍(lán)藻時(shí)，黑麥草能十分有效吸收水中的磷；初始接種量低于0.248 g/L時(shí)，隨著接種量的增加，水體的TP 降低了78%～92%，CODCr卻不斷升高；超過0.248 g/L的接種處理組中，實(shí)驗(yàn)期間TP 減少率超過90%，但CODCr達(dá)到最大值。因此，在利用黑麥草凈化富營養(yǎng)水體時(shí)，為更好地發(fā)揮其水體凈化功能，應(yīng)將種植時(shí)間提前，避免藍(lán)藻水華的嚴(yán)重聚集。

關(guān)鍵詞：水華聚集；銅綠微囊藻；黑麥草；丙二醛（MDA）；總磷（TP）

中圖分類號(hào)：X524

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：16749944（2017）20002904

1引言

由于工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，城鎮(zhèn)人口的增加，生活污水和工業(yè)廢水未經(jīng)處理而大量排放，水體中過量累積氮磷等營養(yǎng)鹽而導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化[1]。湖泊等水體富營養(yǎng)化最顯著的外在特征之一就是浮游藻類的大量繁殖和藍(lán)綠藻水華的頻發(fā)。當(dāng)前，世界范圍內(nèi)有30%～40% 的湖泊和水庫，正遭受不同程度的富營養(yǎng)化影響；在我國，湖泊、水庫富營養(yǎng)化及藍(lán)藻爆發(fā)現(xiàn)象也愈加明顯[2]。一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)：我國處于富營養(yǎng)狀態(tài)的水庫個(gè)數(shù)、庫容個(gè)數(shù)分別占所調(diào)查水庫的30.8% 和11.2%[3]。

由于藍(lán)藻爆發(fā)對(duì)水體及水中各類生物都會(huì)產(chǎn)生危害，人們一直在不斷的探索對(duì)富營養(yǎng)水體的治理辦法，植物修復(fù)是重要的治理方法之一。國外用于廢水凈化的植物較多，如常見的蘆葦、香蒲和燈芯草等，鳳眼蓮、黑三棱、水蔥等植物也有所使用[4]。我國凈水植物品種的運(yùn)用，大多參照國外的方式[5]。近年來，國內(nèi)學(xué)者通過對(duì)沉水草本、漂浮草本、浮水草本、挺水草本、濕生草本、中生草本植物的大量研究，為廢水凈化選取了高性能的植物品種[6]。因此，利用生物浮床凈化富營養(yǎng)水體這一研究領(lǐng)域有著較好的發(fā)展前景。在浮床生物的選擇中，黑麥草因其產(chǎn)地廣泛，培養(yǎng)簡(jiǎn)單方便，漸漸受到人們的重視并展開了一些污染水體修復(fù)方面的探索[7]。然而，針對(duì)富營養(yǎng)水體，黑麥草是否也具有凈化效果？水華大量聚集后，將對(duì)黑麥草生長(zhǎng)產(chǎn)生何種影響？藍(lán)綠藻細(xì)胞死亡分解后對(duì)水體水質(zhì)、營養(yǎng)鹽釋放以及黑麥草生長(zhǎng)將產(chǎn)生何種影響？目前相關(guān)的報(bào)道尚不多見。

本實(shí)驗(yàn)將在室溫下，以接種了不同濃度銅綠微囊藻的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)介質(zhì)，選用黑麥草作為浮床生物，探索藍(lán)藻對(duì)黑麥草生理生化的影響，并分析培養(yǎng)介質(zhì)中總磷（TP）和COD等凈水指標(biāo)的變化。本研究將為減輕藍(lán)藻水華聚集，減少藍(lán)藻對(duì)凈水的浮床植物的不良影響，提高水體凈化效果提供理論依據(jù)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1銅綠微囊藻的培養(yǎng)與黑麥草的種植

本實(shí)驗(yàn)所用銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）購自中國科學(xué)研究院水生生態(tài)所淡水藻種庫（湖北，武漢，F(xiàn)ACHB-905），所用培養(yǎng)基為現(xiàn)配并滅菌的BG11藍(lán)藻培養(yǎng)基（pH值為8.0）。藻種需經(jīng)過幾次轉(zhuǎn)接來適應(yīng)新環(huán)境，具體做法為：訂購的藻種搖勻后，在無菌操作下直接轉(zhuǎn)入小三角瓶?jī)?nèi)，用四層滅菌紗布把瓶口封好，防止污染并保持氣體流通，然后放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d（培養(yǎng)箱光暗周期為14 h∶10 h，溫度26±1 ℃，光照強(qiáng)度為2000 lx）；接著，在無菌操作下取5～10 mL藻樣轉(zhuǎn)入10～20 mL新鮮培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)；當(dāng)銅綠微囊藻生物量明顯增多時(shí)，再次轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接比例1∶5（藻液∶培養(yǎng)基），每天搖瓶3次。實(shí)驗(yàn)時(shí)選用的Microcystis aeruginosa為重新接種后生長(zhǎng)3～4 d的新鮮藻樣。

北方生黑麥草（Lolium perenne），購自巨豐種業(yè)（江蘇，南京）。將黑麥草種子浸泡后，選出籽實(shí)飽滿的種子，均勻撒入備好的含育苗土壤的培養(yǎng)盒中，待黑麥草種子發(fā)芽后，取莖長(zhǎng)3 cm左右的幼苗，均勻移入含有不同銅綠微囊藻濃度的浮床上，水培培養(yǎng)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)定5個(gè)處理組（其中包括一個(gè)不接種藍(lán)藻的空白對(duì)照組），每組設(shè)3個(gè)平行。所用培養(yǎng)介質(zhì)均為新鮮的BG11培養(yǎng)液，初始磷濃度為40 mg/L（以K2HPO4計(jì)）。接種組一次性接入如上所述的新鮮藻樣，接種量分別為每L培養(yǎng)基質(zhì)添加0 mL、10 mL、30 mL、50 mL和70 mL的藻樣。利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定，五個(gè)處理組所含M. aeruginosa的初始生物量分別為0 g/L、0.121 g/L、0.164 g/L、0.248 g/L和0.278 g/L。

2.2黑麥草生長(zhǎng)情況的觀察

本次實(shí)驗(yàn)周期為浮床接種后的三周。每隔一周，取生長(zhǎng)在不同處理組中的黑麥草，對(duì)其根長(zhǎng)、鮮重這樣的外觀形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行觀察和記錄。所用工具為剪刀，直尺，所用儀器為分析天平（FA1004N）。

2.3黑麥草葉片蛋白含量與丙二醛含量的測(cè)定

本次試驗(yàn)中，黑麥草葉片所含蛋白質(zhì)含量的測(cè)定用小牛血清蛋白法（BCA）。樣本的前處理步驟如下：收集不同生長(zhǎng)時(shí)間（一周，兩周，三周）的不同處理組的黑麥草各 10 株，研磨稱重，然后按照各自不同的重量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例，在離心管中加入 9 倍體積的生理鹽水，-20 ℃冰箱凍融3～4次破細(xì)胞壁后，按照 3500 轉(zhuǎn)/min，在高速冷凍離心機(jī)中離心10 min，取上清液。再用生理鹽水按1∶9 稀釋成 1% 組織勻漿備用。后續(xù)測(cè)定和計(jì)算方法按照市售的試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國南京）說明書進(jìn)行。

丙二醛（MDA）含量的測(cè)定也包括樣本前處理和測(cè)試兩個(gè)階段，前處理的流程如下：收集不同處理組及不同生長(zhǎng)階段的黑麥草，稱重，研磨，然后按照各自不同的重量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例，加入9倍體積的應(yīng)用提取液（試劑盒自帶），放在冰箱內(nèi)凍融3～4次，以4000 r/min在離心機(jī)中離心10 min，取上清液待測(cè)。具體測(cè)定和計(jì)算方法也參照了南京建成的丙二醛測(cè)定試劑盒說明書（南京建成生物工程研究所，中國南京）。所有測(cè)定都在96孔板中進(jìn)行，所用儀器為多功能酶標(biāo)儀（Tecan Infinite 200 Pro，瑞士）。endprint

2.4培養(yǎng)基質(zhì)中總磷和生化需氧量的測(cè)定

在測(cè)定黑麥草生理生化數(shù)據(jù)的同時(shí)，收集培養(yǎng)了一周、兩周和三周的水培基質(zhì)，測(cè)定其中 TP 和重鉻酸鉀生化需氧量（CODCr）。總磷的測(cè)定采用過硫酸鉀消解-鉬銻抗比色法，CODCr 的測(cè)定采用國標(biāo)方法[8]。

3結(jié)果與分析

3.1藍(lán)藻水華聚集對(duì)黑麥草生長(zhǎng)情況的影響

為了探索不同接種量的藍(lán)藻對(duì)黑麥草生長(zhǎng)的影響，我們收集了不同生長(zhǎng)階段的黑麥草植株，對(duì)其根長(zhǎng)和鮮重進(jìn)行了測(cè)量，結(jié)果如表1和表2所示。從表1中可以看出，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)黑麥草在不同處理組均不停生長(zhǎng)。與空白對(duì)照相比，培養(yǎng)基質(zhì)中有水華藍(lán)藻的處理組中，黑麥草的根長(zhǎng)被刺激，在初始接種量為10～50 mL范圍內(nèi)，這種刺激作用隨藍(lán)藻濃度的增加而變得越發(fā)明顯，但當(dāng)接種量達(dá)到70 mL時(shí)，盡管仍表現(xiàn)為刺激，但與其他接種濃度相比，根長(zhǎng)明顯變短。黑麥草鮮重的變化趨勢(shì)與根長(zhǎng)類似，需要特別指出的是，在70 mL藻液接種組，這種鮮重的刺激現(xiàn)象已經(jīng)非常微弱，甚至在第三周時(shí)與空白對(duì)照組幾乎相當(dāng)（表2）。

*平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差，單位：cm

從表2中數(shù)據(jù)可以得知，在水體中存在微囊藻水華時(shí)，黑麥草的生長(zhǎng)在外觀上表現(xiàn)為刺激現(xiàn)象；但當(dāng)水華聚集嚴(yán)重時(shí)，刺激現(xiàn)象有可能減弱或消失。利用水葫蘆凈化富營養(yǎng)水體的相關(guān)報(bào)道也發(fā)現(xiàn)：各處理中水葫蘆的根長(zhǎng)、總長(zhǎng)、鮮重與實(shí)驗(yàn)開始相比都呈增加的趨勢(shì)，并且隨藍(lán)藻濃度的增加，根長(zhǎng)、總長(zhǎng)增加的幅度減小[9]，這與該研究結(jié)果類似。因此，今后在利用黑麥草凈化富營養(yǎng)水體時(shí)，為了讓黑麥草長(zhǎng)勢(shì)更好，應(yīng)考慮在春末或夏初進(jìn)行移植。

*平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差，單位：g/10株

3.2藍(lán)藻水華聚集對(duì)黑麥草葉片中蛋白含量和丙二醛含量的影響

為了從更深層面了解水華藍(lán)藻對(duì)黑麥草生長(zhǎng)的影響，對(duì)黑麥草葉片的蛋白含量和丙二醛（MDA）含量進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。在本次實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，與空白相比，黑麥草葉片的蛋白含量在大多數(shù)接種了微囊藻的處理組都有所升高，只有50 mL接種量處理組在第三周時(shí)，蛋白含量比空白組下降。在70 mL處理組，葉片蛋白含量與空白很接近，在第三周時(shí)也低于空白組（圖1）。這個(gè)結(jié)果這與前面所述的生長(zhǎng)情況的結(jié)果是非常相似的。

此外，有趣的是，空白組和10 mL處理組，在這三周內(nèi)葉片的蛋白含量都是一直增加的，而在其他處理組，葉片蛋白含量的變化趨勢(shì)是先增加后減少（圖1）。這說明：盡管在外觀上，黑麥草在含有水華藍(lán)藻的培養(yǎng)基質(zhì)中仍然持續(xù)生長(zhǎng)，但其葉片蛋白的合成已經(jīng)受到了藍(lán)藻的影響而放慢了。在水華藍(lán)藻濃度較高的處理組甚至低于了空白的合成水平。

另外，對(duì)黑麥草葉片中MDA含量的分析更是證明了上述論斷。如圖2所示，與空白組相比，在所有的接種了微囊藻的處理組，葉片中MDA的含量都大大提升了，且隨著藍(lán)藻初始接種量的增加，MDA含量也不斷增加。在植物的抗氧化防御系統(tǒng)中，MDA含量反映的是植物遇到外界不利影響（如干旱、寒冷、紫外線、水澇、外源污染物等）時(shí)的脂質(zhì)過氧化水平，它的含量越高，說明受到的氧化損傷也越強(qiáng)[10～12]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微囊藻的存在確實(shí)使得黑麥草受到一定程度的氧化損傷，且這種損傷存在濃度相關(guān)性。

3.3不同處理組培養(yǎng)液中的總磷濃度和重鉻酸鉀需氧量

最后，對(duì)各處理組培養(yǎng)基質(zhì)中的總磷（TP）濃度和重鉻酸鉀需氧量（CODCr）進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雖然培養(yǎng)基質(zhì)中初始磷濃度較高，達(dá)到40 mg/L，但生物對(duì)磷的利用能力很強(qiáng)。在空白對(duì)照組，由于培養(yǎng)液中沒有藍(lán)藻，水中磷濃度的降低主要由于黑麥草吸收磷的作用，計(jì)算發(fā)現(xiàn)它對(duì)磷的吸收率超過99%。而在接種藍(lán)藻的處理組，首先，水體中TP濃度隨時(shí)間的變化規(guī)律比較統(tǒng)一，都是逐漸減少（圖3）。這說明無論是藍(lán)藻還是黑麥草，隨著生物量的增加，對(duì)水中磷的吸收都不斷增加。其次，若對(duì)所有接種組進(jìn)行比較則發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)基質(zhì)中TP的變化與接種量之間沒有一定的規(guī)律可尋，但與黑麥草生長(zhǎng)情況有一定的關(guān)聯(lián)。如初始接種量在30mL和50 mL時(shí)，黑麥草生長(zhǎng)較好，水中TP濃度也較高；而在70 mL時(shí)，黑麥草生長(zhǎng)最差，水中TP濃度也最少。通過計(jì)算還發(fā)現(xiàn)，10～50 mL接種量時(shí)，基質(zhì)中TP的減少率在78.3%～92.3% 之間；但初始接種量為70 mL時(shí)，基質(zhì)中TP的減少率在90.6%～97.6% 之間（圖3）。一方面，藍(lán)藻的新陳代謝過程中，一直存在著新生細(xì)胞吸取磷元素，死亡細(xì)胞釋放磷元素的過程。另一方面，黑麥草與藍(lán)藻之間的相互作用，也會(huì)影響黑麥草根部對(duì)磷的吸收和釋放。因此，其深層原因較為復(fù)雜，值得進(jìn)一步深入研究。

對(duì)于培養(yǎng)基質(zhì)中CODCr的變化規(guī)律，從圖4中可以看出：初始接種量越多的組，水體的生化需氧量也越大。空白組和10～50mL接種組隨著時(shí)間的變化，CODCr不斷減少或者先增加后降低，而70 mL接種組在第三周時(shí)CODCr達(dá)到最大值。眾所周知，富營養(yǎng)化水體的一個(gè)較大的危害就是水中溶解氧的下降，而造成這種現(xiàn)象的原因正是藻類的大量繁殖，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了藻類有大量消耗溶解氧的潛能。

然而，藍(lán)藻的世代周期較短。在第二周時(shí)，藍(lán)藻死亡分解耗氧量也最大，因藻類的聚集CODCr達(dá)到最高值。第三周時(shí)分解基本完成，CODCr回落。另外，黑麥草的存在，也加速了藻細(xì)胞的分解。需要特別指出的是：70 mL接種處理組在第三周時(shí)水中CODCr達(dá)到最高峰，可能因?yàn)樵孱惥奂啵沟梅纸膺^程變長(zhǎng)。此外，如前所述，第三周時(shí)黑麥草在該處理組的長(zhǎng)勢(shì)也較差，可能是由于此時(shí)水華聚集過于嚴(yán)重，導(dǎo)致了黑麥草根部缺氧，從而生物量遠(yuǎn)不如其他處理組。

4結(jié)論和展望

本次實(shí)驗(yàn)可以得到如下結(jié)論：①在3周的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，當(dāng)藍(lán)藻初始接種量為10～50 mL時(shí)，黑麥草的生長(zhǎng)受到刺激，葉片蛋白含量在大多數(shù)情況下也高于空白組。而在70 mL接種處理組，黑麥草的生長(zhǎng)和葉片蛋白含量都被輕微的抑制；②在所有的接種了微囊藻的處理組，葉片中MDA的含量都大大提升了，且隨著初始接種量的增加，MDA含量也不斷增加，說明黑麥草受到藍(lán)藻誘發(fā)的氧化損傷；③黑麥草能夠大量吸收培養(yǎng)基質(zhì)中的磷，但在水華藍(lán)藻存在時(shí)，由于存在競(jìng)爭(zhēng)和死亡藻體的釋放，培養(yǎng)液中TP濃度有所增加，且與接種濃度沒有相關(guān)性；④初始接種量越多的組，水體的CODCr也越大。若水華聚集過于嚴(yán)重，如初始接種量達(dá)到70 mL時(shí)，有可能導(dǎo)致黑麥草根部缺氧，嚴(yán)重影響黑麥草的正常生長(zhǎng)。endprint

在利用黑麥草凈化富營養(yǎng)化水體時(shí)，為了黑麥草正常生長(zhǎng)并發(fā)揮凈水功能，應(yīng)當(dāng)在水華爆發(fā)前就接種進(jìn)行培養(yǎng)，嚴(yán)重的水華聚集會(huì)抑制其功能的發(fā)揮。此外，黑麥草與藍(lán)藻共存時(shí)對(duì)水中營養(yǎng)鹽如TP的利用情況比較復(fù)雜，值得深入去探索。在此基礎(chǔ)上，對(duì)浮床植物的進(jìn)一步篩選和實(shí)驗(yàn)研究也需要投入更多的精力。

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