鉀礦區(qū)海金沙內(nèi)生真菌多樣性及生態(tài)分布研究

張紅芳, 甘會云, 錢旭, 陳曄,2,*

1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 九江 332000 2.九江市區(qū)域產(chǎn)業(yè)與城市生態(tài)重點實驗室, 九江 332000

鉀礦區(qū)海金沙內(nèi)生真菌多樣性及生態(tài)分布研究

張紅芳1, 甘會云1, 錢旭1, 陳曄1,2,*

1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 九江 332000 2.九江市區(qū)域產(chǎn)業(yè)與城市生態(tài)重點實驗室, 九江 332000

為探明不同鉀礦區(qū)同種植物內(nèi)生真菌的物種多樣性、群落組成以及生態(tài)分布規(guī)律, 運用傳統(tǒng)組織分離方法與分子生物學(xué)方法相結(jié)合, 對3個不同鉀礦區(qū)(龍南安基山、南京小龍山、黎川龍安)的海金沙居群地采樣, 進行了海金沙內(nèi)生真菌的分離頻率、種類組成、多樣性和生態(tài)分布分析, 同時與非鉀礦區(qū)(廬山蓮花洞)海金沙內(nèi)生真菌進行對比分析。結(jié)果表明: 從海金沙1200個組織塊中分離出477 株內(nèi)生真菌, 其中產(chǎn)孢菌株229株, 占總數(shù)48 %, 不產(chǎn)孢菌248株, 占52%。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和形態(tài)型菌株的rDNA的18S基因和ITS序列的相似性比較和分子系統(tǒng)發(fā)育分析確定477菌株中438 菌株鑒定隸屬于Alternaria、Colletotrichum、Fusarium、Peniccillium等75個分類單元, 還有39 株不產(chǎn)孢類群無法鑒定。在真菌屬的水平, 以Colletotrichum(20.96%)、Fusarium(11.32%)和Alternaria(8.81%)為優(yōu)勢菌群。從分離頻率來看, 不同鉀礦區(qū)內(nèi)生真菌出現(xiàn)頻率存在差異, 各礦區(qū)內(nèi)生真菌菌群之間的相似性低, 相似性系數(shù)(Cs)在0.07—0.30之間。鉀礦區(qū)海金沙內(nèi)生真菌出現(xiàn)頻率高于非鉀礦區(qū), 非鉀礦區(qū)(蓮花洞)菌株分離頻率為19.08%, 而在鉀礦區(qū)中南京分離頻率最高(33.33%)。在宿主組織中, 海金沙葉片、葉柄和根狀莖等不同組織部位內(nèi)生真菌在數(shù)量、種群分布以及優(yōu)勢種群等方面存在較大差異, 葉柄(44.44%)＞葉片(39.41%)＞根狀莖(16.15%), 在各個組織部位的優(yōu)勢類群分布也存在一定的差異。形成內(nèi)生真菌分布差異性與不同地理位置、氣候因素、土壤理化性質(zhì)和宿主植物組織的生理狀況以及化學(xué)組成變化等密切相關(guān)。

海金沙; 鉀礦區(qū); 優(yōu)勢菌群; 多樣性; 相似性系數(shù)

1 前言

自1866年Heinrich Anton de Bary提出植物中存在有“內(nèi)生生物體(Endophyte)”至今, 國內(nèi)外學(xué)者在不斷地拓寬內(nèi)生真菌宿主植物研究, 已開展了從藻類、地衣、苔蘚、蕨類植物和種子植物等植物內(nèi)生真菌多樣性研究, 并對不同氣候和生境的植物內(nèi)生真菌資源進行了發(fā)掘, 取得了豐碩的研究成果[1-7]。研究表明內(nèi)生真菌普遍存在植物組織中, 具有豐富多樣性, 受宿主植物組織、環(huán)境等多種因素影響, 體現(xiàn)出一定組織、宿主差異性, 并與宿主植物之間建立了長期穩(wěn)定的互惠共生關(guān)系(Mutualistic symbiosis)[8-9];此外, 這種共生關(guān)系在相對極端的環(huán)境中也普遍存在, 賦予植物優(yōu)良生長性狀, 能提高宿主植物抗逆性、促進宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收從而增強宿主植物對此類環(huán)境的適應(yīng)性[10-20]。

蕨類植物是地球上最早出現(xiàn)的陸生植物類群,在世界各地均有分布, 具有豐富的物種多樣性。蕨類植物在適應(yīng)特殊環(huán)境(如干旱環(huán)境、污染環(huán)境、礦區(qū)環(huán)境等)方面具有獨特的適應(yīng)機制[21-22]。這種獨特適應(yīng)機制是否與內(nèi)生真菌之間建立了一種特殊關(guān)系是值得深入探究的問題。

為探明鉀礦區(qū)蕨類植物內(nèi)生真菌的物種多樣性、群落組成以及生態(tài)分布規(guī)律。以海金沙Lygodium japonicum(海金沙系海金沙科海金沙屬多年生蕨類植物, 分布廣泛, 具有抗逆境能力強、生長迅速、繁殖能力強等特點)為材料[23-25], 系統(tǒng)地研究不同鉀礦區(qū)海金沙內(nèi)生真菌類群多樣性及生態(tài)分布特點, 探討不同鉀礦區(qū)與植物內(nèi)生真菌群落組成及多樣性變化的關(guān)系, 并進一步分析礦區(qū)與非礦區(qū)植物內(nèi)生真菌分布特點。研究結(jié)果將有助于全面了解鉀礦區(qū)植物內(nèi)生真菌的類群組成和生態(tài)分布規(guī)律, 為探究植物內(nèi)生真菌對宿主植物在礦區(qū)適應(yīng)機制提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1標(biāo)本采集處理 2014年6月下旬分別在3個不同鉀礦區(qū)(龍南安基山、南京小龍山、黎川龍安)和 1個非鉀礦區(qū)(廬山蓮花洞)等地進行了海金沙L.japonicum樣本采集(樣地基本概況, 見表1)。材料采集處理方法參照文獻[26]。

2.1.2培養(yǎng)基 麥芽汁瓊脂(2%)培養(yǎng)基為分離、純化培養(yǎng)基, 其配比: 麥芽汁 750 mL, 瓊脂 15 g,10%海金沙葉水提液100 mL, 加蒸餾水定容至1000 mL, 自然pH(使用前在培養(yǎng)基中加80 U·mL-1鏈霉素1 mL); PDA培養(yǎng)基為保種培養(yǎng)基。

2.2 內(nèi)生真菌的分離及純化

內(nèi)生真菌的分離采用常規(guī)的組織分離法, 地上部分從每種植物樣品中隨機選取 20段帶有葉片的小段片, 自來水沖洗干凈, 按文獻進行表面消毒[26-30]。純化已鑒定菌種后, 接入 PDA斜面, 4 ℃冰箱中保藏。分離純化獲得的菌株保存于九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院真菌研究室(JJTU)。

2.3 內(nèi)生真菌的鑒定

2.3.1內(nèi)生真菌的鑒定 根據(jù)菌落的顏色、形態(tài)、菌絲和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征鑒定到屬。將不產(chǎn)孢菌株在促孢培養(yǎng)基上進行促孢培養(yǎng), 并檢查其產(chǎn)孢情況, 產(chǎn)孢后按上述方法進行鑒定。經(jīng)促孢培養(yǎng)后仍不產(chǎn)孢的菌株則根據(jù)菌落表面特征、菌絲顏色、菌絲生長速率等分為無孢類群(Mycelia Sterilia)的形態(tài)型[9]。通過rDNA中的5.8SITS序列的分子系統(tǒng)學(xué)分析方法進行鑒定。真菌屬的鑒定主要依據(jù) Barnett& Hunter(1998)、Dictionary of fungi(10 版, 2008)、Keith Seifer(2011)的分類系統(tǒng)和《真菌鑒定手冊》,并參考國內(nèi)外相關(guān)期刊發(fā)表的文獻資料[31-33]。

表1 采集樣地基本概況Tab.1 Basic general situation of sampling sites

2.3.2不產(chǎn)孢內(nèi)生真菌菌株分子生物學(xué)鑒定[8,30]

運用CTAB法進行內(nèi)生真菌DNA的提取, 利用真菌通用引物 Primer1 (ITS1: 5’- TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3’正向)和 Primer4(ITS4: 5’-TCCTCC GCTTATRGATATGC-3’反向)對內(nèi)生真菌 DNA 的ITS1、ITS2 和 5.8S rRNA 區(qū)間進行擴增; PCR 產(chǎn)物用純化試劑盒(QiaQuick PCR purification Kit;Qiagen)進行純化, 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR產(chǎn)物的序列測定: 由北京華大基因有限公司完成。

通過對分子數(shù)據(jù)庫 GenBank中的序列 BLAST進行同源序列的檢索, 分子序列相似性超過 98%的序列被選作是同源序列。同時, 相似性較低的序列被選作為外源序列(Outgroup)。

用軟件 MAFFT 7.0 運算實現(xiàn)分子序列比對,軟件的設(shè)置為 Scoring Matrix: 1PAM/κ=2; Gap opening penalty=1.53; Offset value=0.0。比對完的序列用BioEdit 軟件進行剪切編輯。利用 MEGA 4.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建, 該軟件采用的方法是鄰接法(Neighbour-joining, NJ), 樹的可靠性通過Bootstrap1000次來檢驗。

2.4 土壤和植株中主要成分測定

用TPY-6PC土壤養(yǎng)分化驗儀測定樣品中的速效氮、有效磷、速效鉀、有機質(zhì)含量、土壤酸堿度, 植株中的主要元素K、P、Si、 Al等[34]。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析[25]

采用分離率(Isolation rate,IR)衡量組織中內(nèi)生真菌的豐富程度。分離率: 分離到的某一指定類型內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占樣品組織塊總數(shù)比值。

采用分離頻率(Isolation frequency,IF)比較判斷內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌群。分離頻率: 某一指定類型內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占獲得總內(nèi)生真菌菌株數(shù)比值。

采用最為常用Shannon-Weiner多樣性指數(shù)(He)進行內(nèi)生真菌種群的多樣性水平分析。He=-∑[ni/NLn(ni/N)], 其中ni為第i個內(nèi)生真菌菌株數(shù)目,N為全部內(nèi)生真菌菌株數(shù)。用Pielou均勻度指數(shù)分析菌群分布的均勻程度,E=He/Ln(S)式中:He為Shannon-Wiener 指數(shù),S為物種數(shù)。 Margalef豐富度指數(shù):R=(S-1)/lnN。Berger-Parker優(yōu)勢度指數(shù)(D),D=Nmax/N式中:Nmax為優(yōu)勢種的個體數(shù);N為功能團全部物種的個體數(shù)。

采用Jaccard相似性指數(shù)(Cj)對不同植物間內(nèi)生真菌組成的相似程度進行比較和分析。Cj=c/(a + b－c)。式中:a是一種植物內(nèi)生真菌的種類數(shù),b是另一種植物內(nèi)生真菌的種類數(shù),c是兩種植物共同具有的內(nèi)生真菌種類數(shù), 比較兩種植物之間內(nèi)生真菌種類組成的相似程度。

3 結(jié)果與分析

3.1 海金沙內(nèi)生真菌主要類群組成

從4個居群地的海金沙1200個組織塊中共分離獲得內(nèi)生真菌477株, 其中產(chǎn)孢菌株229株, 占總菌株數(shù)48%, 不產(chǎn)孢菌248株, 占52%。根據(jù)菌落、菌絲形態(tài)學(xué)特征進行鑒定, 不產(chǎn)孢類群根據(jù)培養(yǎng)特征(生長速度、顏色以及質(zhì)地等)將248菌株劃分26個形態(tài)型。通過對產(chǎn)孢類群的形態(tài)學(xué)鑒定和形態(tài)型菌株的5.8SrDNA、ITS序列的相似性比較和分子系統(tǒng)發(fā)育分析, 將分離獲得 477株內(nèi)生真菌中 438 菌株鑒定為Alternaria、Colletotrichum、Fusarium、Peniccillium等75 個分類單元, 此外 39株不產(chǎn)孢類群 DNA序列在GenBank中無相近參考菌株信息, 作為無法鑒定的內(nèi)生真菌, 它們分別為Fungal endophytesp.(9株)、Fungalsp.(22 株)、Uncultured fungus(8株), 這些菌群是否是新的類群有待進一步分析(見表2, 圖1)。在屬的水平以Colletotrichum、Fusarium、Alternaria為優(yōu)勢菌群, 其分離頻率分別為20.96%、11.32%、8.81%。

表2 海金沙內(nèi)生真菌的菌群組成Tab.2 Composition of endophytic fungi from L.japonicum (Thunb.) Sw.

續(xù)表

圖1 基于 5.8S rDNA 構(gòu)建的形態(tài)型菌株鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbour-Joining phylogenetic tree of mycelia sterilia based on 5.8S rDNA gene sequences

3.2 內(nèi)生真菌相似性及多樣性分析

3.2.1 海金沙內(nèi)生真菌菌群組成的相似性

相似性系數(shù)是反映兩個不同生境中真菌菌群組成相似程度的重要參數(shù)。從內(nèi)生真菌菌群的相似性來看(表3), 各樣地之間內(nèi)生真菌類群相似性較低,相似性系數(shù)在0.07—0.30之間, 均小于0.5。從鉀礦區(qū)海金沙內(nèi)生真菌菌群組成之間相似性來看, 龍南和黎川的相似性最高(Cs=0.2553), 南京與龍南的相似性最低(Cs=0.0690); 從鉀礦區(qū)與非鉀礦區(qū)海金沙內(nèi)生真菌菌群組成之間相似性來看, 黎川和蓮花洞的相似性最高(Cs=0.3023), 南京和蓮花洞最低(Cs=0.1568)。

3.2.2 海金沙內(nèi)生真菌菌群組成的多樣性

從Pielou均勻度指數(shù)(E)來看, 3個鉀礦區(qū)海金沙組織的內(nèi)生真菌菌群的均勻度指數(shù)在 0.7015—0.8552 之間(表4), 龍南采樣地點均勻度指數(shù)為 0.8552, 南京采樣地點均勻度指數(shù)為 0.7015, 而非鉀礦區(qū)(蓮花洞)海金沙內(nèi)生真菌均勻度指數(shù)最高為0.8726, 從而體現(xiàn)出各采樣地點的海金沙內(nèi)生真菌的多樣性是比較穩(wěn)定的。從 Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)(He)來看, 龍南采樣地點的最高,He為2.9086, 南京的最低,He為 2.4313。從Berger-Parker優(yōu)勢度指數(shù)來看, 蓮花洞采樣地點的最高, 為6.5000, 南京的最低, 為2.8909。從Margalef 豐富度指數(shù)(R)來看, 龍南采集點最高, 為 6.3392, 黎川最低, 為5.7524。

由表4可知, 海金沙內(nèi)生真菌菌群的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)(He)、Margalef 豐富度指數(shù)(R)、Berger-Parker優(yōu)勢度指數(shù)和均勻度指數(shù)(E)在海金沙不同組織部位之間的變化趨勢一致, 即: 葉片＞葉柄＞根狀莖, 表明海金沙葉片中內(nèi)生真菌的多樣性最高。

表3 不同地點海金沙內(nèi)生真菌相似性系數(shù)Tab.3 Similarity coefficients of endophytic fungi from L.japonicum in different sampling locations

表4 不同地點海金沙內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)Tab.4 Diversity indices of endophytic fungi from L.japonicum in different sampling locations

3.3 海金沙內(nèi)生真菌生態(tài)分布

3.3.1 不同鉀礦區(qū)海金沙內(nèi)生真菌菌群的分布

在 3個鉀礦區(qū)之間, 海金沙植物中內(nèi)生真菌的菌群組成存在著明顯差異, 在分離頻率上表現(xiàn)為南京＞黎川＞龍南的規(guī)律, 南京鉀礦區(qū)分離頻率最高,為 33.33%。除共有的優(yōu)勢菌群以外, 海金沙植物中內(nèi)生真菌還具有其各自地區(qū)的優(yōu)勢菌群存在差異,南京以Alternaria(17.61%)、Colletotrichum(34.59%)為優(yōu)勢菌群, 黎川以Fusarium(13.85%)、Colletotrichum(17.69%)、Fungalsp.(11.54%)為優(yōu)勢菌群, 龍南以Colletotrichum(14.43%)、Fusarium(18.56%)為優(yōu)勢菌群。鉀礦區(qū)部分內(nèi)生真菌類群在同一植物中分布具有特定的地理分布特性, 如Aegerita(0.21%)、Entylomella(0.63%)、Botrytis(3.14%)等僅在南京礦區(qū)分離獲得出現(xiàn),Antromycopsis(0.77%)、Catenulifera(1.54%)、Nigrospora(3.08%)等僅分布在黎川礦區(qū),Fusicladium(2.06%)、Acremonium(0.63%)、Beltrania(1.03%)等僅分布在龍南礦區(qū)。

同時, 研究發(fā)現(xiàn)從鉀礦區(qū)海金沙植物中分離獲得內(nèi)生真菌在數(shù)量、種群分布以及優(yōu)勢種群等與非鉀礦區(qū)之間存在較大差異。從數(shù)量來看, 鉀礦區(qū)分離獲得菌株數(shù)＞非鉀礦區(qū); 非鉀礦區(qū)優(yōu)勢菌群為Peniccillium(15.38%)、Guignardia(11%)、Fusarium(11%)。Alternaria、Colletotrichum、Fusarium、Peniccillium等在鉀礦區(qū)和非鉀礦區(qū)均有分布。Rhinotrichella(3.30%)等僅分布非鉀礦區(qū)。

3.3.2 海金沙不同組織中內(nèi)生真菌菌群的分布

從總分離頻率來看, 海金沙葉片、葉柄和根狀莖等不同組織部位內(nèi)生真菌在數(shù)量、種群分布以及優(yōu)勢種群等方面存在較大差異, 葉柄(44.44%)＞葉片(39.41%)＞根狀莖(16.15%)(表2), 尤其葉柄、葉片中的內(nèi)生真菌在種類與數(shù)量上較為豐富, 根狀莖最少;同時, 在各個組織部位的優(yōu)勢類群分布也存在一定的差異, 在葉片、葉柄中以Colletotrichum分離頻率為較高, 分別 29.26%、19.34%,Fusarium在根狀莖中的分離頻率較高, 為14.29%。除2—3個明顯較重要的屬外(IF＞10), 分離頻率較低(IF＜5)的屬構(gòu)成了海金沙內(nèi)生真菌的主要組成。一些內(nèi)生真菌類群表現(xiàn)出一定組織專一性, 如Arthroboyryum、Blastomyces、Curvularia等僅分布在葉片中,Acroolictys、Aegerita、Beauveria等僅在葉柄中分離得到,Antromycopsis、Cladobotryum、Gibelluiopsis等僅分布在根狀莖中。

4 討論

從分離純化結(jié)果顯示: 不產(chǎn)生孢子的菌株的分離率達到 20.67%, 分離頻率更達到 52%, 與其他學(xué)者研究植物內(nèi)生真菌的結(jié)果相似[11-19], 其原因可能是由于內(nèi)生真菌與宿主在長期協(xié)同進化中形成的適應(yīng)關(guān)系使得內(nèi)生真菌不僅在宿主體內(nèi)不產(chǎn)子實體及孢子, 而且在體外培養(yǎng)時也已不易產(chǎn)生子實體[35]。

研究結(jié)果表明: 鉀礦區(qū)常見蕨類植物海金沙內(nèi)生真菌在葉片、葉柄和根狀莖中的分布和分離頻率存在差異, 以葉柄的分離頻率為最高, 根狀莖的分離頻率最低, 這可能與內(nèi)生真菌的來源及其萌發(fā)、生長和擴展有關(guān)。蕨類植物莖為根狀莖, 其內(nèi)部結(jié)構(gòu)為表皮、皮層和中柱, 表皮無氣孔, 蕨類植物根狀莖的內(nèi)生真菌是通過莖表皮細(xì)胞間穿過皮層機械組織細(xì)胞間隙侵入到根狀莖的皮層薄壁細(xì)胞[29]; 也可能與礦區(qū)土壤環(huán)境有關(guān), 因為礦區(qū)土壤貧瘠, 有些真菌難以在這種環(huán)境中生存, 故侵入蕨類植物根狀莖內(nèi)生真菌數(shù)量較少, 而地上部分葉可以接受空氣中大量真菌孢子, 孢子通過不同途徑侵入葉內(nèi)定植[25]。具體影響內(nèi)生真菌在蕨類植物不同組織部位分布差異的因素需要進一步探究。

從分離頻率看, 海金沙內(nèi)生真菌在不同鉀礦區(qū)出現(xiàn)的頻率存在較大的差異, 南京小龍山鉀礦區(qū)(33.33%)＞江西黎川龍安鉀礦區(qū)(27.25%)＞江西龍南安基山鉀礦區(qū)(20.34%); 海金沙植物中內(nèi)生真菌優(yōu)勢菌群在不同鉀礦區(qū)也存在明顯差異。形成這種差異可能與其所處地理位置的氣候因素、土壤因素和海金沙植物組織生理狀況以及化學(xué)組成的明顯變化等因素有關(guān)。從氣候因素來看, 南京小龍山鉀礦區(qū)、黎川龍安鉀礦區(qū)、龍南安基山鉀礦區(qū)分別位于北、中、南不同的亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū), 它們年平均氣溫、降雨量和光照等均存在差異(見表1)。溫度、濕度、光照等氣候條件的差異, 一方面影響內(nèi)生真菌對宿主植物的感染、定殖和生長, 從而使得同一植物內(nèi)生真菌的分布在不同鉀礦區(qū)發(fā)生明顯變化[14]; 另一方面導(dǎo)致植物組織的生理狀況以及化學(xué)組成的明顯變化, 從而影響海金沙內(nèi)生真菌的類群和分布[14,19]。從測定不同鉀礦區(qū)海金沙植株體內(nèi)元素含量來看(見表5), 不同鉀礦區(qū)海金沙植株P(guān)、K、Si、A l等含量存在差異, 進一步說明不同氣候條件下導(dǎo)致植物自身化學(xué)組成的變化, 影響植物內(nèi)生真菌的分布。

表5 不同采集地海金沙所含主要礦質(zhì)元素(mg·kg-1)Tab.5 The main mineral elements from L.japonicum in different sampling locations

表6 不同采集地土壤的主要理化性狀Tab.6 Basic properties of soils used in different sampling locations

為了深入探討地理因素對于海金沙內(nèi)生真菌分離頻率的影響, 對三個鉀礦區(qū)的土壤理化指標(biāo)(pH、有機質(zhì)、全N、速效P 和速效K)進行了測定, 結(jié)果顯示三個鉀礦區(qū)的土壤理化性質(zhì)差異較明顯(表6),土壤理化性質(zhì)對內(nèi)生真菌的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。說明地理因素會導(dǎo)致植物內(nèi)生真菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異, 這與有的學(xué)者研究地理因素對植物中內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)影響的結(jié)果一致[9,11]?？梢? 植物、內(nèi)生真菌雙方由于受到周圍微環(huán)境變化的選擇壓力, 具有選擇性地改變另一方的能力[14,16,19]。這可能是一種跳躍式的協(xié)同進化方式, 一方面某些內(nèi)生真菌可能通過極端環(huán)境的篩選作用具備了溶磷解鉀功能,另一方面, 宿主植物組織中的某些基因選擇性表達,從而增強了對P、K等物質(zhì)的吸收, 使共生體快速適應(yīng)鉀礦區(qū)環(huán)境脅迫[5-6]。

同時研究發(fā)現(xiàn), 鉀礦區(qū)海金沙內(nèi)生真菌出現(xiàn)的頻率高于非鉀礦區(qū)。一方面可能由于蓮花洞森林公園植被類型豐富, 喬灌木層發(fā)達, 郁閉度大,影響內(nèi)生真菌孢子在垂直方向的傳播, 而鉀礦區(qū)植被類型單一可能有利于內(nèi)生真菌的定殖; 另一方面, 可能由于蓮花洞森林公園位于市郊, 交通便捷, 游客眾多, 人類活動頻繁和森林管理實踐在一定程度上影響了內(nèi)生真菌孢子在水平方向的傳播, 例如 Sieber Canavesi等研究發(fā)現(xiàn)植物在被砍伐之后比在自然建立的情況下內(nèi)生真菌出現(xiàn)的頻率更高, 即同種植物中內(nèi)生真菌出現(xiàn)的頻率差異性與管理實踐有關(guān)[36]。不過影響植物內(nèi)生真菌菌群分布、組成特征和演替變化的因素和作用機制既是多方面的又可能是較為復(fù)雜的, 需進一步探究。

致謝:感謝中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點實驗郭良棟研究員給予的幫助和指導(dǎo)。

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Diversity and ecological distribution of endophytic fungi associated withLygodium japonicum in potassium mining areas

ZHANG Hongfang1, GAN Huiyun1, QIAN Xu1, CHEN Ye1,2,*
1.School of Pharmacy and Life Sciences,Jiujiang University,Jiujiang332000,China2.Jiujiang Key Laboratory of Regional Industry and Urban Ecology,Jiujiang332000,China

In order to make clear the species diversity, community composition and ecological distribution of the endophytic fungi isolated from the fern in different potassium mining areas, the study tookLygodium japonicumin three different potassium mining areas (Longnan Anjishan, Nanjing dragon mountain, Lichuan longan) as experimental material.The isolation frequency, species composition, diversity and ecological distribution of the strains fromL.japonicumwere analyzed by the combination of traditional tissue isolation method and molecular biological method.And the endophytic fungi isolated fromL.japonicuminnon-potassium mining areas (Lianhua Hole, Lushan), were applied as a comparative control.The results showed that 477 strains were isolated from the 1200 tissue blocks.Among them, 229 strains were spore producing strains, accounting for 48%, while 248 strains were non spore producing strains, accounting for 52 %.According to morphological identification of the spore producing groups and comparison of the similarity of 5.8 S rDNA and ITS sequences of non spore producing strains, 438 strains were identified asAlternaria, Colletotrichum,Fusarium, Peniccilliumand other 75 genera, the remaining 39 strains of non spore groups could not be identified.The isolation rate ofColletotrichum, FusariumandAlternariawere 20.96%, 11.32%, 8.81%, respectively, indicating they were dominant.The total separation frequency of the endophytic fungi in the potassium mining areas was generally higher than that in the non potassium mining area, and the separation frequency of the non potassium mining area (Lianhuadong) was 19.08%, while the highest frequency was 33.33% in Nanjing.Generally speaking, the similarity coefficient between each mining area was low, ranging from 0.07 to 0.30.There were significant differences in the number, population distribution and dominant species of endophytic fungi in different tissues.The colonization rate of endophytic fungi from petioles (44.44 %) was generally greater than that from leaves(39.41 %) and then was that from rhizomes (16.15 %).The distribution of endophytic fungi was closely related to the geographical location, climatic factors, physical and chemical properties of soil, and the changes of physiological condition and chemical composition of host plant tissues.

Lygodium japonicum; potassium mining areas; dominant strains; diversity; similarity coefficient; ecological distribution

10.14108/j.cnki.1008-8873.2017.05.021

Q939.5

A

1008-8873(2017)05-160-10

張紅芳, 甘會云, 錢旭, 等.鉀礦區(qū)海金沙內(nèi)生真菌多樣性及生態(tài)分布研究[J].生態(tài)科學(xué), 2017, 36(5): 160-169.

ZHANG Hongfang, GAN Huiyun, QIAN Xu, et al.Diversity and ecological distribution of endophytic fungi associated withLygodium japonicumin potassium mining areas[J].Ecological Science, 2017, 36(5): 160-169.

2016-11-19;

2017-04-21

國家自然科學(xué)基金項目(31360064)

張紅芳(1971-), 女, 碩士, 講師, 研究方向為真菌多樣性, E-mail: 939044612@qq.com

*通信作者:陳曄, 碩士, 教授, 研究方向為植物內(nèi)生真菌多樣性, E-mail:chenyejjtc@126.com