恩諾沙星免疫親和柱的制備與應(yīng)用研究

朱新生，強(qiáng)敏，陸源，王韋崗，牛瑞，王云

（1.鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇鎮(zhèn)江212132；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

恩諾沙星免疫親和柱的制備與應(yīng)用研究

朱新生1，強(qiáng)敏1，陸源1，王韋崗1，牛瑞2，王云2

（1.鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇鎮(zhèn)江212132；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

將制備獲得的恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）多克隆抗體與Sepharose 4B進(jìn)行偶聯(lián)，獲得恩諾沙星免疫親和柱（immunoaffinity column，IAC），并對(duì)IAC柱的性能和應(yīng)用前景進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：恩諾沙星多克隆抗體效價(jià)為1.28×105、半抑制濃度為5.47 ng/mL；制備的IAC柱的柱容量為2.54 g/mL凝膠，IAC柱的平均回收率為98.9%，柱與柱之間的變異系數(shù)為3.0%；牛奶中ENR的加標(biāo)回收率分別為96.5%~99.8%。

恩諾沙星；多克隆抗體；免疫親和層析

恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）是畜禽和水產(chǎn)動(dòng)物常用的一種氟喹諾酮類抗生素，能通過(guò)抑制細(xì)菌DNA螺旋酶來(lái)達(dá)到抗菌效果[1]。ENR進(jìn)入畜禽機(jī)體后在體內(nèi)分布廣泛且速度快，而且其殺菌譜廣，與其他藥物無(wú)交叉耐藥性，但是ENR在動(dòng)物體內(nèi)消除比較緩慢，半衰期較長(zhǎng)[2]。在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，濫用ENR的現(xiàn)象相當(dāng)普遍，造成動(dòng)物制品中ENR殘留，給人體健康帶來(lái)威脅，如導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)、精子質(zhì)量下降等[3]。因此，世界各國(guó)對(duì)喹諾酮類抗生素的最高殘留限量均做出了嚴(yán)格的限制。我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定禽肉及其制品中ENR的最高殘留限量為0.1 mg/kg。為保護(hù)消費(fèi)者的身體健康，迫切需要建立一種快速、準(zhǔn)確的食品中ENR殘留分析檢測(cè)方法。

目前ENR常用的檢測(cè)分析方法有液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[4]、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC/MS）[5-6]、毛細(xì)管電泳法[7]等。但由于實(shí)際樣品中抗生素殘留含量低、樣品基質(zhì)復(fù)雜，屬于痕量分析的范疇，因此在進(jìn)行儀器分析之前通常需要進(jìn)行樣品凈化處理。常見(jiàn)的樣品凈化前處理的方法有固相萃取、液相微萃取等，但這些方法選擇性低、耗時(shí)。免疫親和層析技術(shù)，利用配體和靶標(biāo)分子特異性可逆相互作用進(jìn)行色譜分離，具有操作簡(jiǎn)便、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景[8-9]。本研究將恩諾沙星多克隆抗體與CNBr-Sepharose 4B偶聯(lián)制備獲得免疫親和柱（immunoaffinity column，IAC），并對(duì)其性能和應(yīng)用前景進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

恩諾沙星：Santa cruz公司；CNBr活化的sepharose 4B：GE公司；甲醇、乙腈（色譜純）：Thermo-Fisher公司；其他試劑均為化學(xué)純：國(guó)藥上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

UV-9600紫外分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司；高效液相色譜儀LC 20AT：日本島津公司；5810R冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀Multiskan FC：美國(guó)Thermo公司。

1.2 抗體制備

采用N-羥基琥珀酰亞胺法（N-hydroxysuccinimide，NHS法）制備免疫原[8]。稱取 20 mg ENR、12.5 mg碳二亞胺 （1-ethyl-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC）、10 mg NHS，充分溶解于 0.9 mL 二甲亞砜中，加入100 μL三乙胺，室溫?cái)嚢?4 h，然后將其緩慢滴加到含有25 mg牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 的 0.01 mmol/L pH 7.4 磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶液中，室溫?cái)嚢?3 h；將上述反應(yīng)好的溶液裝入透析袋中，4℃條件下使用PBS溶液透析3天后，4 000 r/min離心20 min，收集上清液，冷凍干燥后，分裝保存。

免疫原ENR-BSA用生理鹽水配成濃度為1mg/mL的溶液。首次免疫1.0 mg/只，用弗氏完全佐劑將ENRBSA乳化后，采用背部皮下多點(diǎn)的注射方式；加強(qiáng)免疫用不完全佐劑進(jìn)行乳化。第3次免疫7天后，耳緣靜脈取血，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked im munosorbent assay，ELISA）測(cè)定免疫血清的效價(jià)和IC50值。

1.3 IAC的制備

IAC柱的制備參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，具體步驟如下：

1）將純化后的多抗置于偶聯(lián)緩沖液（0.1 mol/L NaHCO3，0.5 mol/L NaCl，pH 8.3）中透析過(guò)夜，然后稀釋到一定濃度備用；2）準(zhǔn)確稱取CNBr-Sepharose4B干膠0.1g在10mL 1 mmol/L HCl溶液中溶脹20 min。用10倍體積的偶聯(lián)緩沖液洗滌，在4℃，4 000 r/min條件下離心1 min，離心2次；3）取洗滌后的2 mL濕膠迅速轉(zhuǎn)移至含有2 mL一定濃度多抗的偶聯(lián)緩沖液中，于室溫下振搖1 h；4）用10倍體積以上的偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的多抗；5）將凝膠置于5倍體積的0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）中，在室溫下封閉 2 h；6）用 5 倍體積的0.1 mol/L 醋酸鹽緩沖液（pH 4.0）、0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）交替洗滌3次，再用pH 7.4的0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌2次后，裝柱至凝膠體積為0.5 mL。裝柱后向柱管加入1 mL 0.01 mol/L PBS緩沖液和10 μL 1%硫柳汞鈉，封住口底后于4℃保存。

1.4 柱容量的測(cè)定

取10 mL 400 ng/mL（4 000 ng）ENR標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)柱，每1 mL上樣液收集一管，用HPLC法測(cè)定ENR含量，計(jì)算柱容量。

柱容量（ng ENR/g濕膠）=IAC柱吸附的ENR總量（ng）/濕凝膠質(zhì)量（g）

1.5 IAC柱與柱之間重復(fù)性的測(cè)定

IAC柱之間的重復(fù)性用回收率進(jìn)行評(píng)價(jià)，按照1.3的方法制備IAC柱，分別用2 mL 50、100、200 ng/mL（總量分別為 100、200、400 ng） 三種不同濃度的ENR標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次過(guò)柱，每一個(gè)濃度兩組平行，用0.01 mol/LPBS緩沖液充分洗滌后，再用90%甲醇-水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干，5 mL甲醇復(fù)溶后用HPLC法測(cè)定洗脫液中ENR的含量，計(jì)算柱與柱之間的重復(fù)性。

1.6 牛奶樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定

在5 mL空白牛奶樣品中分別加入濃度為5、10 ng/mL的ENR標(biāo)準(zhǔn)溶液（使用0.8%NaOH-PBS進(jìn)行稀釋），每組兩個(gè)平行，將ENR標(biāo)準(zhǔn)溶液分別過(guò)柱，充分洗脫后，收集洗脫液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用甲醇定容至5 mL，用HPLC法測(cè)定ENR的含量，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.7 HPLC分析

色譜條件：Shimpack VP-ODSC18色譜柱（250 mm×4.6 mm）和UV檢測(cè)器；流動(dòng)相：乙腈和0.05 mol/L磷酸（19∶81，體積比）；UV檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流速 1.0 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 ENR抗體的制備

免疫原ENR-BSA的紫外掃描圖譜如圖1所示。

載體蛋白BSA在277 nm處有特征吸收峰，ENR在282 nm和319 nm處有兩個(gè)特征吸收峰，免疫原ENR-BSA則在280 nm和321 nm處有兩個(gè)特征吸收峰。由于紫外吸收具有加合性，免疫原ENR-BSA不僅保留了載體蛋白和半抗原ENR的特征吸收峰，同時(shí)又有所遷移，說(shuō)明半抗原ENR和載體蛋白偶聯(lián)成功。

圖1 ENR-BSA、BSA和ENR的紫外掃描圖譜Fig.1 UV spectra of ENR-BSA，BSA and ENR

將所制備的免疫原ENR-BSA免疫動(dòng)物，采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)免疫血清的效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 免疫血清的效價(jià)曲線Fig.2 The titer curve of immune serum

隨著稀釋倍數(shù)的增加，陰性血清的A450值無(wú)顯著變化，陽(yáng)性血清的A450值隨著稀釋倍數(shù)的增加而降低，當(dāng)免疫血清的稀釋倍數(shù)為128 000時(shí)，與陰性血清的比值即P/N值大于2.1，即免疫血清的效價(jià)達(dá)到1.28×105。

多克隆抗體血清采用飽和硫酸銨法和正辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化。純化后的抗體采用ELISA法測(cè)定其抑制曲線及半數(shù)抑制濃度IC50值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 多克隆抗體的抑制曲線Fig.3 The inhibition curve of polyclonal antibody

由圖3可求得可以求得ENR多克隆抗體的半數(shù)抑制濃度IC50為5.47 ng/mL。

2.2 IAC的制備與評(píng)價(jià)

參照GE-Healthcare操作手冊(cè)，將純化后的ENR多抗與CNBr-Sepharose 4B共價(jià)偶聯(lián)，制備獲得ENR免疫親和柱。10 mL 400 ng/mL ENR溶液連續(xù)過(guò)柱，每1 mL上樣液收集一管，測(cè)定其中的ENR含量，計(jì)算被IAC柱吸附的ENR含量結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 IAC的柱容量Fig.4 Column binding capacity of the IAC

如圖4所示，可得IAC柱容量為（400+393+386+90）/0.5=2.54 μg ENR/mL 凝膠。

將2 mL 50、100、200 ng/mL的ENR標(biāo)準(zhǔn)溶液分別過(guò)柱，每個(gè)濃度兩個(gè)平行，用HPLC法對(duì)柱子回收率進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)該IAC柱與柱之間的重復(fù)性結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 IAC柱之間的重復(fù)性Table 1 Column-to-column variation of IACs

如表1所示，IAC柱的平均回收率為98.9%，柱與柱之間的變異系數(shù)為3.0%，說(shuō)明IAC柱之間重復(fù)性良好。

2.3 IAC的應(yīng)用評(píng)價(jià)

將所制備的IAC柱與HPLC法結(jié)合，在實(shí)際樣品牛奶中進(jìn)行加標(biāo)回收的測(cè)定，過(guò)柱后ENR的回收率測(cè)定結(jié)果如表2所示。

由表2可知，其中牛奶樣品分別加標(biāo)5、10 ng/mL，加標(biāo)總量分別為25 ng和50 ng時(shí)，其回收率分別為96.5%~99.8%、96.6%~99.6%，RSD值分別為1.9%和1.7%。

表2 牛奶樣品中的加標(biāo)回收Table 2 Recoveries of ENR from milk and relative standard deviation（RSD）

3 結(jié)論

制備獲得了ENR多克隆抗體免疫親和柱，并對(duì)其配合HPLC分析在實(shí)際樣品中ENR殘留檢測(cè)的應(yīng)用前景進(jìn)行了評(píng)價(jià)。動(dòng)物免疫獲得的ENR多抗的IC50值5.47 ng/mL，具有較高的親和性和特異性；抗體與Sepharose4B共價(jià)偶聯(lián)獲得的IAC柱的柱容量為2.54μg ENR/mL凝膠；IAC柱的平均回收率為98.9%，柱與柱之間的變異系數(shù)為3.0%，IAC柱與柱之間重復(fù)性良好；牛奶中ENR添加總量為5 ng和10 ng/mL時(shí)，加標(biāo)回收率分別為96.5%~99.8%、96.6%~99.6%。

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Preparation of Immunoaffinity Column and Its Application in Sample Cleanup for Enrofloxacin Residues Detection

ZHU Xin-sheng1，QIANG Min1，LU Yuan1，WANG Wei-gang1，NIU Rui2，WANG Yun2
（1.Zhenjiang Products Quality Supervision and Inspection Center，Zhenjiang 212132，Jiangsu，China；2.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China）

The production of polyclonal antibody （pAb）against enrofloxacin （ENR），the preparation of immunoaffinity column（IAC）and its potential application to the selective extraction of ENR residues from actual samples were described.The produced pAb exhibited good sensitivity to ENR with antiserum titre of 1.28×105and IC50value of 5.47 ng/mL.By coupling the produced antibody with CNBr-activated Sepharose 4B，an IAC was prepared.The maximum capacity of the column for ENR was approximately 2.54 g/mL gel.The average recovery of ENR standard solutions from IACs was 98.9%with the relative standard deviation（RSD）among columns of 3.0%.The IACs were then challenged with ENR-fortified milk samples，recoveries of ENR were found to be in the range of 96.5%-99.8%.

enrofloxacin；polyclonal antibody；immunoaffinity chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.028

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2015BAK45B00）；鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科技支撐計(jì)劃（NY2014024）

朱新生（1966—），男（漢），高級(jí)工程師，本科，主要從事食品安全檢測(cè)研究。

2017-07-11

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