小球藻親環(huán)蛋白A的酶活性及過表達(dá)擬南芥抗鹽性分析

廖 栩 何明良 張素艷 馬海燕 王旭輝 羅秋香 管清杰*

(1.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.吉林省德惠市第九中學(xué)，德惠 130300)

小球藻親環(huán)蛋白A的酶活性及過表達(dá)擬南芥抗鹽性分析

廖 栩1何明良1張素艷2馬海燕1王旭輝1羅秋香1管清杰1*

(1.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2.吉林省德惠市第九中學(xué)，德惠 130300)

在前期研究中分離到噬碳酸鹽小球藻(Chlorellasp. X1)的親環(huán)蛋白基因CsCyp1A(登錄號(hào)：KY207381)，編碼CsCyp1A蛋白是否具有肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)活性功能是進(jìn)一步研究它參與小球藻耐鹽生物學(xué)過程的基礎(chǔ)。通過His標(biāo)簽的pQE-30-CsCyp1A原核蛋白表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)它的E.coliM15菌株表達(dá)融合蛋白，Nitra-柱純化后獲得純化的30 kDa左右的His-CsCyp1A融合蛋白質(zhì)，Western雜交檢測(cè)到HisCsCyp1A蛋白的雜交信號(hào)。酶活性分析顯示，HisCsCyp1A融合蛋白中生色基團(tuán)的產(chǎn)生速度明顯快于對(duì)照，表明CsCyp1A蛋白可以催化底物N-succinyl-Xaa-Pro-Phe-p-nitroanilide中Xaa-Pro肽鍵的順反折疊，說明純化的CsCyp1A蛋白具有PPIase活性。典型的親環(huán)蛋白家族成員具有肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)活性，參與折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程。真空滲入法侵染轉(zhuǎn)化的擬南芥在35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下超表達(dá)CsCyp1A基因，耐鹽性研究表明它提高了過表達(dá)株系對(duì)NaCl脅迫的耐性，揭示小球藻CsCyp1A基因的抗鹽性功能，它將成為抗逆育種的基因資源。本研究也為探索小球藻親環(huán)蛋白A的抗鹽堿脅迫生物學(xué)作用和分子育種奠定了基礎(chǔ)。

噬碳酸鹽小球藻；鹽堿地；親環(huán)蛋白A；肽脯氨酰順反異構(gòu)酶；原核表達(dá)蛋白

親環(huán)蛋白(cyclophilin)具有Lys118-His126環(huán)以及4條β折疊片(3～6)所形成的袋狀結(jié)構(gòu)，是環(huán)孢霉素A特異的結(jié)合位點(diǎn)，是作為免疫抑制劑CsA的細(xì)胞內(nèi)受體被發(fā)現(xiàn)的[1]。Handschum-acher等人在小牛胸腺組織中發(fā)現(xiàn)親環(huán)蛋白A(cyclophilin A,CypA)[2]，研究表明，CypA的免疫抑制劑的特異性受體普遍存在于生物體內(nèi)。人類Cyp1A的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β折疊片，此外還伴有α螺旋以及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。在1989年，德國(guó)和日本的研究小組發(fā)現(xiàn)CypA具有肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶(Peptide acyl preserved ammonia acyl cis-trans isomerase，PPIase)活性，能夠催化Xaa-Pro的順反異構(gòu)[3～4]，在蛋白的折疊、運(yùn)輸以及蛋白間的相互作用中發(fā)揮重要的作用。池蝶蚌CyPA是一個(gè)既參與免疫應(yīng)激又對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育具有影響的功能廣泛的蛋白質(zhì)[5]。有些CyPs可以作為分子伴侶，在應(yīng)激反應(yīng)中參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并影響RNA的剪接過程[6]。在擬南芥中，有29個(gè)親環(huán)素基因，其中有14個(gè)已被報(bào)導(dǎo)，其功能涵蓋了剪接、光合作用和植物的抗逆反應(yīng)[7]。發(fā)現(xiàn)油桃的3個(gè)CYP707A家族成員中的PpCYP707A2可以被ABA和GA誘導(dǎo)，而且三者交叉調(diào)控花芽休眠的進(jìn)程[8]。到目前為止，擬南芥[7]、鹽芥[9]、水稻[10]、棉花[11]、木豆等的CyPs與非生物脅迫調(diào)節(jié)相關(guān)研究已有報(bào)道，OsCyp2參與到了水稻側(cè)根發(fā)生的整個(gè)過程，促進(jìn)生長(zhǎng)[10]。梁凌星等在研究杧果防治農(nóng)業(yè)病蟲害的生產(chǎn)實(shí)踐中，敲除CYP51基因的杧果對(duì)咪鮮胺的敏感性存在極顯著差異，說明了CYP51基因?qū)漉r胺產(chǎn)生抗藥性[12]。過表達(dá)CcCyP擬南芥的PPIase活性顯著提高，增加了對(duì)多種非生物脅迫耐性[13]。典型的親環(huán)蛋白家族成員具有肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)活性，參與折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程。未見能夠在極端蘇打鹽漬土壤中生存的小球藻CyPs的報(bào)道，小球藻(Chlorellasp. X1)是從松嫩蘇打鹽堿土壤中分離到的，在400 mmol·L-1NaHCO3的培養(yǎng)液中快速生長(zhǎng)，充分顯示了它噬堿性鹽的特性[14]，過表達(dá)其CsCyp1A基因的酵母高抗鹽堿脅迫[15]。土壤鹽堿化造成農(nóng)牧業(yè)的巨大損失，在松嫩平原上鹽堿地有373×104公頃[16]。隨著人口的越來越多，糧食短缺，可耕地減少。為了鹽堿地成為后備耕地將進(jìn)行綜合的生態(tài)研究，首先從改良其土壤性質(zhì)入手，其次利用耐性植物綜合治理[17]。那么通過篩選和轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育耐鹽堿品種，耐性基因的挖掘就顯得尤為重要。本研究對(duì)噬堿性鹽小球藻親環(huán)蛋白A(CsCyp1A)的結(jié)構(gòu)進(jìn)生物信息分析，構(gòu)建體外原核表達(dá)載體，摸索誘導(dǎo)表達(dá)純化條件，檢測(cè)其親環(huán)蛋白A是否具有肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶活性功能是進(jìn)一步研究它參與小球藻耐鹽生物學(xué)過程的基礎(chǔ)。深入研究過表達(dá)CsCyp1A基因擬南芥對(duì)鹽脅迫的耐受性，將為促進(jìn)親免蛋白A的生物學(xué)研究和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也對(duì)研究鹽堿地小球藻噬碳酸鹽脅迫的生理機(jī)制具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與載體

大腸桿菌(E.coli)M15；pMD18-T-CsCyp1A質(zhì)粒DNA及pQE-30原核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

Ex-Taq DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ，及T4DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司；N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide和Ni-agarose蛋白質(zhì)純化柱子購(gòu)自Sigma公司；His標(biāo)簽的一抗和鼠抗兔的二抗，均購(gòu)買于碧云天生物技術(shù)研究所；DIG標(biāo)記物和CDP-Star購(gòu)自Roche公司；其他試劑為中國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 小球藻親環(huán)蛋白A(CsCyp1A)結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步研究從噬堿性鹽小球藻克隆到的基因，其ORF編碼蛋白的結(jié)構(gòu)功能[15]，應(yīng)用SMART網(wǎng)絡(luò)軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)分析小球藻CsCyp1A基因(登錄號(hào)：KY207381)推導(dǎo)氨基酸的功能結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)該基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能。

1.2.2 pQE-30-CsCyp1A融合表達(dá)載體的構(gòu)建

以測(cè)序完全正確的pMD18-T-CsCyp1A質(zhì)粒DNA的1%為模板，應(yīng)用增設(shè)BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的特異引物(CsCyp1A-F：5′-ggatccatgggtgccggtgcaag-3′和CsCyp1A-R：5′-gtcgactagagccctgcaaactgagc-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再連入pMD18-T載體于E.coliJM109中克隆質(zhì)粒DNA，再經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ酶切其目的基因質(zhì)粒和pQE-30載體DNA，回收膠中目的DNA、連接和轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步酶切鑒定完成pQE-30-CsCyp1A載體的構(gòu)建。

1.2.3 HisCsCyp1A融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

1.2.3.1 HisCsCyp1A融合蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)

構(gòu)建的pQE-30-CsCyp1A質(zhì)粒DNA所熱激轉(zhuǎn)化至M15菌株，陽性單克隆接種于5 mL含有100 mg·L-1Amp+25 mg·L-1Kana的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)至菌液ODλ=600=0.3～0.5，開始小量誘導(dǎo)表達(dá)，以YT為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，30℃下，1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)時(shí)間梯度為：0 hr(空白對(duì)照)，1、2、3和4 hr。離心收集菌體加入10 mmol·L-1咪唑裂解緩沖液和2×Loading Buffer各200 μL，煮沸變性，取15 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，以考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行凝膠染色。

1.2.3.2 HisCsCyp1A融合蛋白大量誘導(dǎo)與純化

在含有100 mg·L-1Amp+25 mg·L-1Kana的500 mL LB培養(yǎng)基中，于37℃搖床振蕩培養(yǎng)表達(dá)HisCsCyp1A融合蛋白的菌株，當(dāng)ODλ=600為0.3～0.5，加入1 mmol·L-1IPTG于30℃誘導(dǎo)融合蛋白的大量表達(dá)3 h，收集菌體細(xì)胞在超聲波下進(jìn)行破碎，離心，收集蛋白上清液加入400 μL Ni-agarose蛋白純化柱中，通過吸附柱的結(jié)合作用，洗滌雜蛋白，進(jìn)行HisCsCyp1A融合蛋白純化，并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)純化蛋白。

1.2.3.3 Western雜交檢測(cè)HisCsCyp1A融合蛋白

將未誘導(dǎo)(0 h)總蛋白和經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h的總蛋白，以及純化的HisCsCyp1A融合蛋白10 μg樣品，通過12.5%的SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)膜，以His-Antibody為鼠一抗雜交，兔抗鼠的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，CDP-Star顯色檢測(cè)HisCsCyp1A融合蛋白的雜交信號(hào)。

1.2.4 CsCyp1A蛋白的PPIase酶活性檢測(cè)

參照Fischer G,等測(cè)定重組CsCyp1A蛋白的PPIase活性的方法[18]。略有改動(dòng)，總反應(yīng)體系為1 mL：0.02 μmol·L-1純化的蛋白加入到PPIase buffer(50 mmol·L-1Hepes,pH8.0,86 mmol·L-1NaCl)中，冰上放置1 hr；然后快速加入終濃度為1.2 mmol·L-1的糜蛋白酶(溶于10 mmol·L-1HCl)以及終濃度為60 μmol·L-1的底物(溶于三氟乙醇/470 mmol·L-1LiCl/N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide)，混勻后放置于紫外分光光度計(jì)中，連續(xù)測(cè)定390 nm吸光值3 min，應(yīng)用Excel分析數(shù)據(jù)并作折線圖。

1.2.5 過表達(dá)CsCyp1A擬南芥的抗鹽性檢測(cè)

1.2.5.1轉(zhuǎn)基因T1代株系的PCR檢測(cè)

采用真空滲入法，以含有pCXSN-CsCyp1A質(zhì)粒DNA的根癌農(nóng)桿菌(EHA105)侵染轉(zhuǎn)化擬南芥[19]，經(jīng)潮霉素篩選得到的T1代和WT(野生型擬南芥)種子經(jīng)消毒滅菌，播種在1/2MS含40 mg·L-1潮霉素的培養(yǎng)基上，發(fā)芽培養(yǎng)后，移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中，以CTAB法提取T1代(T1-#1，-#2，-#3)植株的葉片基因組DNA的1%作為模板，PCR檢測(cè)外源CsCyp1A基因整合情況(35SF：5′-TCATTTCATTTGGAGAGAACAC-3′;NOSR:5′-ATCGGGGAAATTCGCTAGTG-3′)。繼續(xù)潮霉素篩選培收獲到T3代種子。用Trizol一步方法提取WT和T3代轉(zhuǎn)基因植株(T3-#1，-#2，-#3)的總RNA，取5 μg經(jīng)甲醛變性電泳，轉(zhuǎn)膜，Nouthern雜交檢測(cè)CsCyp1A基因的表達(dá)。

1.2.5.2轉(zhuǎn)基因T3代株系對(duì)NaCl脅迫的耐性

取T3代株系(T3-#1，-#2，-#3)和WT種子滅菌后，播種在1/2MS平板上發(fā)芽7 d，將兩葉期的不同轉(zhuǎn)化株系以及WT幼苗植株移接到1/2MS+0(對(duì)照)、100、125、150 mmol·L-1NaCl的培養(yǎng)基上處理，培養(yǎng)于溫度22～23℃，光照明/暗為16 hr/8 hr，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，7天后觀察植株的生長(zhǎng)表型變化，調(diào)查植株的生長(zhǎng)狀況，測(cè)量根長(zhǎng)以及植株的鮮重，并檢測(cè)其MDA含量[20]，用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻親環(huán)蛋白A(CsCyp1A)結(jié)構(gòu)域

將克隆到的小球藻CsCyp1A基因推導(dǎo)編碼的274個(gè)氨基酸輸入SMART網(wǎng)絡(luò)軟件，運(yùn)行分析發(fā)現(xiàn)其功能結(jié)構(gòu)域(圖1)：含有三個(gè)低螺旋區(qū)域(23～33，216～227，245～273 aa)和一個(gè)肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PPIase)功能結(jié)構(gòu)域(43～195 aa)，表明小球藻CsCyp1A基因編碼的蛋白可能具有肽脯氨酰順反異構(gòu)酶功能。

圖1 小球藻親環(huán)蛋白A(CsCyp1A)功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)粉色為低復(fù)雜區(qū)域；灰色框圖為肽脯氨酰順反異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域Fig.1 The prediction of Chlorella Cyclophilin A’s(CsCyplA) functional structure area

2.2 His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體的酶切鑒定

經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切的目的DNA與載體片段連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliJM109克隆菌株中，在37℃下，對(duì)提取pQE-30-CsCyp1A重組質(zhì)粒DNA限制性內(nèi)切酶鑒定，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明，有大小為850 bp的DNA插入片段(圖2)，與目的基因大小相符，說明構(gòu)建完成His標(biāo)簽融合蛋白的原核表達(dá)載體pQE-30-CsCyp1A。

圖2 pQE30-CsCyp1A重組載體DNA酶切鑒定 M. DL2000 Marker；1～3. BamHⅠ，SalⅠ雙酶切pQE30-CsCyp1A質(zhì)粒DNAFig.2 Confirmation of the pQE30-CsCyp1A DNA plasmid M. DL2000 Marker; 1-3. pQE30-CsCyp1A cutted by restriction enzyme(BamHⅠ,SalⅠ)

2.3 HisCsCyp1A融合蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)

為了原核表達(dá)CsCyp1A蛋白，將pQE-30-CsCyp1A質(zhì)粒DNA熱激轉(zhuǎn)化到E.coliM15，對(duì)Amp和Kana篩選下的陽性M15克隆菌株小量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，由12.5%的SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果可以看出(圖3)，在30℃下，經(jīng)1 mmol·L-1IPTG不同時(shí)間誘導(dǎo)之后，導(dǎo)入pQE-30-CsCyp1A質(zhì)粒的M15菌株隨IPTG誘導(dǎo)時(shí)間(1～3 hr)的延長(zhǎng)，表達(dá)的約為30 kDa融合蛋白增加明顯，誘導(dǎo)4 hr反而表達(dá)蛋白下降。因此，說明HisCsCyp1A融合蛋白的最佳誘導(dǎo)條件是，誘導(dǎo)物為1 mmol·L-1IPTG，表達(dá)培養(yǎng)時(shí)間為3 hr。

圖3 小量誘導(dǎo)表達(dá)HisCsCyp1A融合蛋白 M. Marker；0.轉(zhuǎn)pQE-30-CsCyp1A質(zhì)粒的菌株誘導(dǎo)0 min的總蛋白；1～4.轉(zhuǎn)化pQE-30-CsCyp1A質(zhì)粒的菌株相應(yīng)誘導(dǎo)時(shí)間的總蛋白Fig.3 The expression of a small amount of induced HisCsCyp1A fusion protein M. Marker; 1. Transformed pQE-30-CsCyp1A vector,induced 0 min; 2-5. Transformed pQE-30-CsCyp1A vector,induced 1-4 h

2.4 HisCsCyp1A融合蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)與純化

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，在30℃條件下，1 mmol·L1IPTG誘導(dǎo)含有pQE-30-CsCyp1A重組載體的E.coliM15菌株3 hr，超聲破碎細(xì)胞，獲得的上清中HisCsCyp1A融合蛋白，上清蛋白溶液經(jīng)Ni-agarose柱純化目的蛋白，洗脫收集獲得的蛋白質(zhì)樣品，通過12.5%SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，收集到純化的HisCsCyp1A蛋白約為30 kDa，純化蛋白的濃度為41.3 μg·mL-1，純化的蛋白能夠進(jìn)行CsCyp1A蛋白的PPIase活性的檢測(cè)及其蛋白相關(guān)特性的研究。

Western雜交檢測(cè)HisCsCyp1A融合蛋白，為了進(jìn)一步檢測(cè)純化的HisCsCyp1A融合蛋白，實(shí)驗(yàn)選取His抗體對(duì)其(圖4A)進(jìn)行Western雜交檢測(cè)。DIG顯色結(jié)果表明，在誘導(dǎo)的總蛋白以及純化的上清蛋白中檢測(cè)到雜交信號(hào)(圖4B)，進(jìn)一步驗(yàn)證含His標(biāo)簽的純化蛋白在上清中，為下一步的酶活性分析準(zhǔn)備了實(shí)驗(yàn)材料。

圖4 HisCsCyp1A融合蛋白的純化和Western雜交檢測(cè) a: M. Marker；1.轉(zhuǎn)pQE-30-CsCyp1A質(zhì)粒的菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)0 hr總蛋白；2.誘導(dǎo)3 hr的總蛋白；3.純化的HisCsCyp1A融合蛋白 b. 以His抗體探針的Western雜交分析圖Fig.4 Purification of HisCsCyp1A fusion protein and the detection by Western blot a: M. Marker；1. Transformed pQE-30-CsCyp1A vector which was non-induced by IPTG; 2. Transformed pQE-30-CsCyp1A vector which was induced 3 hr by IPTG; 3. HisCsCyp1A fusion protein b. Western blot analysis of His antibody probe

2.5 HisCsCyp1A融合蛋白PPIase酶活性

N-succinyl-Xaa-Pro-Phe-p-nitroanilide具有順式構(gòu)象和反式構(gòu)象，通過Xaa-Pro肽鍵的順反折疊使順式結(jié)構(gòu)和反式結(jié)構(gòu)處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)多肽處于反式結(jié)構(gòu)時(shí)，α-糜蛋白酶(α-Chymotrypsin)將C端封閉的基團(tuán)裂解釋放生色基團(tuán)，生色基團(tuán)可以在390 nm測(cè)得。實(shí)驗(yàn)表明(圖5)，在底物中加入HisCsCyp1A融合蛋白后，生色基團(tuán)的產(chǎn)生速度明顯快于對(duì)照，表明HisCsCsCyp1A具有PPIase活性，其可以催化底物N-succinyl-Xaa-Pro-Phe-p-nitroanilide中Xaa-Pro肽鍵的順反折疊，加速封閉基團(tuán)裂解，表明純化的HisCsCyp1A蛋白具有PPIase活性。具有肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)活性功能是進(jìn)一步研究它參與小球藻耐鹽生物學(xué)過程的基礎(chǔ)。

圖5 HisCsCyp1A融合蛋白PPIase活性測(cè)定 CK.對(duì)照樣品在390 nm的吸光值；CsCyp1A.加入HisCsCyp1A融合蛋白樣品在390 nm的吸光值Fig.5 Determination of PPIase activity of HisCsCyp1A fusion protein CK.The absorbance at 390 nm that the control; CsCyp1A.The absorbance at 390 nm that the sample add HisCsCyp1A fusion protein

2.6 過表達(dá)CsCyp1A基因的擬南芥抗鹽性分析

2.6.1 過表達(dá)CsCyp1A擬南芥的分子檢測(cè)

本研究PCR檢測(cè)潮霉素篩選到的抗性株系(圖6A)表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥(T1-#1,-#2,-#3)基因組整合了目的CsCyp1A基因(圖6B)；通過Northern雜交分析CsCyp1A基因在擬南芥植株中的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)CsCyp1A基因擬南芥的三個(gè)株系(T3-#1,-#2,-#3)都有一條明顯的信號(hào)條帶，而野生型擬南芥(WT)沒有檢測(cè)到雜交信號(hào)(圖6C)，表明CsCyp1A基因在轉(zhuǎn)基因植株中成功的表達(dá)。通過潮霉素抗性篩選、基因組DNA的PCR擴(kuò)增檢測(cè)，以及Northern雜交鑒定表明收獲的T3代植株種子成功的導(dǎo)入CsCyp1A基因，并且在35S啟動(dòng)下成功的表達(dá)，可以用于后續(xù)的抗鹽性功能特性分析實(shí)驗(yàn)。

2.6.2 過表達(dá)CsCyp1A擬南芥耐NaCl分析

NaCl脅迫兩葉期幼苗7天后，調(diào)查植株耐性生長(zhǎng)表型：在對(duì)照培養(yǎng)基上，WT植株和轉(zhuǎn)CsCyp1A基因植株生長(zhǎng)狀況良好(圖7A)，無顯著差別；而在NaCl脅迫處理下，植株的生長(zhǎng)均明顯受到抑制(圖7：B-D)，但轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)明顯要優(yōu)于WT植株；為了進(jìn)一步說明NaCl脅迫對(duì)擬南芥植株生長(zhǎng)的影響，我們測(cè)定了植株的根長(zhǎng)、鮮重以及MDA含量的變化(圖7:E-G)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)和鮮重高于野生型植株；MDA的含量測(cè)定表明過表達(dá)株系的含量低于WT株系。揭示了CsCyp1A基因在擬南芥中的過表達(dá)能夠增強(qiáng)植株應(yīng)對(duì)NaCl脅迫，提高耐性生長(zhǎng)的能力。

圖7 檢測(cè)NaCl脅迫處理下過表達(dá)CsCyp1A擬南芥耐生長(zhǎng) a,b,c,d分別是WT和轉(zhuǎn)基因T3代(#1,2,3)株系在1/2MS+0,100,125,150 mmol·L-1 NaCl肋迫下的生長(zhǎng)表型；e.根長(zhǎng)；f.鮮重；g.丙二醛含量Fig.7 The growth of Arabidopsis over-expressing CsCyp1A under NaCl stress a,b,c,d show phenotypes of CsCyp1A transgenic and WT lines subjected to 0, 100, 125 or 150 mmol·L-1 NaCl treatment, respectively; e, f and g show root length, fresh weight and MDA levels changes in CsCyp1A transgenic and WT lines

3 討論

在鹽堿環(huán)境下植物生理生態(tài)反應(yīng)，分為植物的脅迫作用、耐性生長(zhǎng)狀況和對(duì)土壤生境的影響[21]。植物親環(huán)蛋白家族成員具有多種生物學(xué)活性，目前研究表明，親環(huán)蛋白的肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)活性作用是主要參與防御反應(yīng)機(jī)制，能夠催化蛋白質(zhì)的折疊與裝配[22]。親環(huán)蛋白依據(jù)功能結(jié)構(gòu)域分子量(18,21,23 kDa)的大小可劃分為A、B、C和線粒體蛋白的D類型[23～24]。本研究通過與His的融合蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)，His標(biāo)簽是6個(gè)組氨酸殘基組成的，pH8.0時(shí)不帶電荷，融合型表達(dá)載體自起始密碼子開始翻譯蛋白，并且是利用金屬螯合層析柱子進(jìn)行分離純化的，易得到可溶性蛋白，親和純化產(chǎn)物純度較高[25]。劉沛等用His-tag系統(tǒng)原核表達(dá)純化到小麥TaMAPK2激酶可溶性蛋白并制備了抗體[26]，本研究構(gòu)建了His-tag標(biāo)簽的pQE-30-CsCyp1A融合表達(dá)載體，以M15菌株來誘導(dǎo)表達(dá)并純化出了HisCsCyp1A融合蛋白，獲得30多kDa可溶性蛋白(圖3)。Western雜交檢測(cè)到上清中的蛋白與誘導(dǎo)表達(dá)總蛋白一致的雜交信號(hào)(圖4)，表明表達(dá)的是融合蛋白。在X-Pro(X為除了Pro以外的氨基酸殘基)結(jié)構(gòu)中只有兩種空間構(gòu)象，一種是反式構(gòu)象，一種是順式構(gòu)象[27]。親環(huán)蛋白能夠改變肽脯氨酰順反式構(gòu)象，而參與防御代謝反應(yīng)，本研究以Xaa-Pro為底物檢測(cè)純化的HisCsCyp1A融合蛋白具有肽脯氨酰順反異構(gòu)酶的活性(圖5)。本研究驗(yàn)證了克隆到的鹽堿土壤中小球藻的CsCyp1A基因表達(dá)的蛋白是與原核的藍(lán)細(xì)菌的4個(gè)親環(huán)蛋白、真核的萊茵衣藻中的52個(gè)親環(huán)蛋白、擬南芥中的52個(gè)親免蛋白、水稻中的56個(gè)親環(huán)蛋白[28～29]相同的酶，可能參與植物遭受脅迫傷害時(shí)激活自身的防御機(jī)制。鹽堿地是由土壤、氣候、地下水、植物、根際微生物、藻類、演替規(guī)律等單元及相互作用關(guān)系構(gòu)成的生態(tài)體系，涉及到一系列的生態(tài)和代謝變化體系，多基因的遺傳轉(zhuǎn)化成為耐性生物育種的基礎(chǔ)[17]。鹽堿地小球藻(Chlorellasp. X1)的獨(dú)特喜鹽堿性的代謝生理特性，必將成為耐鹽堿基因挖掘的對(duì)象[14]。本研究將CsCyp1A基因轉(zhuǎn)化到擬南芥，對(duì)T3代過表達(dá)擬南芥的抗NaCl脅迫分析表明，轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)和鮮重相對(duì)野生型植株生長(zhǎng)抑制差異顯著，過表達(dá)株系的MDA含量低于WT的(圖7)，與張安紅等研究過表達(dá)GhCYP1基因的陸地棉棉花發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫處理?xiàng)l件下，純合轉(zhuǎn)基因棉花株系比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩觊L(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，抗過氧化物酶活性生理活性以及葉綠素含量均明顯高于對(duì)照相同[30]，說明過量表達(dá)CsCyp1A基因提高了擬南芥對(duì)鹽堿逆境的抗性。在植物生長(zhǎng)不利的情況下，通過其動(dòng)態(tài)功能來穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[31～32]。小球藻是生長(zhǎng)在東北松嫩鹽堿草甸上特殊的噬碳酸鹽的藻類，親環(huán)蛋白參與防御機(jī)制可能通過PPIase的活性變化來實(shí)現(xiàn)，本研究檢測(cè)到CsCyp1A蛋白PPIase活性和過表達(dá)提高抗鹽性作用，將通過對(duì)親環(huán)蛋白耐鹽堿機(jī)制的進(jìn)一步研究和分子育種，對(duì)未來的植物抗鹽堿脅迫領(lǐng)域的綜合應(yīng)用具有十分重要的意義。

1.Liu J,Farmer J D Jr,Lane W S,et al.Calcineurin is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506 complexes[J].Cell,1991,66(4):807-815.

2.Handschumacher R E,Harding M W,Rice J,et al.Cyclophilin:a specific cytosolic binding protein for cyclosporin A[J].Science,1984,226(4674):544-547.

3.Fischer G,Wittmann-liebold B,Lang K,et al.Cyclophilin and peptidyl-prolylcis-transisomerase are probably identical proteins[J].Nature,1989,337(6206):476-484.

4.Takahashi N,Hayano T,Suzuki M.Peptidyl-prolylcis-transisomerase is the cyclosporin A-binding protein cyclophilin[J].Nature,1989,337(6206):473-475.

5.羅春,徐靈,何靜,等.池蝶蚌CyPA的應(yīng)激表達(dá)及對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J].水生生物學(xué)報(bào),2015,39(3):475-481.

Luo C,Xu L,He J,et al.The expression of cyclophilin a(CyPA) inHyriopsisschlegeliiin response to pathogens and its effect on the growth of Hela cells[J].Acta Hydrobiologica Sinica,2015,39(3):475-481.

6.Gullerova M,Barta A,Lorkovic Z J.AtCyp59 is a multidomain cyclophilin fromArabidopsisthalianathat interacts with SR proteins and the C-terminal domain of the RNA polymerase II[J].RNA,2006,12(4):631-643.

7.Umezawa T,Okamoto M,Kushiro T,et al.CYP707A3,a major ABA 8′-hydroxylase involved in dehydration and rehydration response inArabidopsisthaliana[J].The Plant Journal,2006,46(2):171-182.

8.Matilla A J,Carrillo-barral N,Del Carmen Rodríguez-Gacio M.An update on the role of NCED and CYP707A ABA metabolism genes in seed dormancy induction and the response to after-ripening and nitrate[J].Journal of Plant Growth Regulation,2015,34(2):274-293.

9.Chen A P,Wang G L,Qu Z L,et al.Ectopic expression ofThCYP1,a stress-responsive cyclophilin gene fromThellungiellahalophila,confers salt tolerance in fission yeast and tobacco cells[J].Plant Cell Reports,2007,26(2):237-245.

10.Kim S K,You Y N,Park J C,et al.The rice thylakoid lumenal cyclophilin OsCYP20-2 confers enhanced environmental stress tolerance in tobacco andArabidopsis[J].Plant Cell Reports,2012,31(2):417-426.

11.Zhu C F,Wang Y X,Li Y B,et al.Overexpression of a cotton cyclophilin gene(GhCyp1) in transgenic tobacco plants confers dual tolerance to salt stress andPseudomonassyringaepv.tabaciinfection[J].Plant Physiology and Biochemistry,2011,49(11):1264-1271.

12.梁凌星.抗咪鮮胺杧果膠孢炭疽菌突變的CYP51基因功能探究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2015.

Liang L X.The functional study of mutated CYP51 inColletotrichumgloeosporioidesfor resistance to prochloraz[D].Fuzhou:Fujian Agriculture Forestry University,2015.

13.Sekhar K,Priyanka B,Reddy V D,et al.Isolation and characterization of a pigeonpea cyclophilin(CcCYP) gene,and its over-expression inArabidopsisconfersmultiple abiotic stress tolerance[J].Plant Cell & Environment,2010,33(8):1324-1338.

14.Qiao K,Takano T,Liu S K.Discovery of two novel highly tolerant NaHCO3trebouxiophytes:identification and characterization of microalgae from extreme saline-alkali soil[J].Algal Research,2015,9:245-253.

15.王旭輝,喬坤,汪振娟,等.小球藻親環(huán)蛋白A(CyPA)基因克隆及表達(dá)特性分析[J].植物研究,2014,34(2):245-251.

Wang X H,Qiao K,Wang Z J,et al.Cloning and expression analysis of cyclophilins A(CyPA) gene form chlorella[J].Bulletin of Botanical Research,2014,34(2):245-251.

16.李秀軍,李取生,王志春,等.松嫩平原西部鹽堿地特點(diǎn)及合理利用研究[J].農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究,2002,23(5):361-364.

Li X J,Li Q S,Wang Z C,et al.A research on characteristics and rational exploitation of soda saline land in the western Songnen Plain[J].Research of Agricultural Modernization,2002,23(5):361-364.

17.林棲鳳,李冠一.植物耐鹽性研究進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展,2000,20(2):20-25.

Lin Q F,LI G Y.Research progress in salt tolerance in plants[J].Progress in Biotechnology,2000,20(2):20-25.

18.Fischer G,Bang H,Mech C.Determination of enzymatic catalysis for the cis-trans-isomerization of peptide binding in proline-containing peptides[J].Biomedica Biochimica Acta,1984,43(10):1101-1111.

19.Clough S J,Bent A F.Floral dip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation ofArabidopsisthaliana[J].The Plant Journal,1998,16(6):735-743.

20.Hodges D M,Delong J M,Forney C F,et al.Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds[J].Planta,1999,207(4):604-611.

21.馮玉杰,陳橋.鹽堿地生態(tài)體系構(gòu)成及研究進(jìn)展[C].//第八次全國(guó)環(huán)境微生物學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.哈爾濱:中國(guó)微生物學(xué)會(huì),2005.

Feng Y J,CHEN Q.Composition and research progress of Saline-alkali land ecological system[C].//Proceedings of the eighth national conference on environmental microbiology.Harbin:Chinese Society for Microbiology,2005.

22.Ivery M T.Immunophilins:switched on protein binding domains?[J].Medicinal Research Reviews,2000,20(6):452-484.

23.Bauer K,Kretzschmar A K,Cvijic H,et al.Cyclophilins contribute to Stat3 signaling and survival of multiple myeloma cells[J].Oncogene,2009,28(31):2784-2795.

24.Sun S,Wang Q W,Giang A,et al.Knockdown of CyPA inhibits interleukin-8(IL-8) and IL-8-mediated proliferation and tumor growth of glioblastoma cells through down-regulated NF-κB[J].Journal of Neuro-Oncology,2011,101(1):1-14.

25.Fan T J,Han L H,Cong R S,et al.Caspase family proteases and apoptosis[J].Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2005,37(11):719-727.

26.劉沛,徐兆師,晏月明,等.小麥TaMAPK2激酶基因的原核表達(dá)及多克隆抗體制備[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2011,12(1):92-95,102.

Liu P,Xu Z S,Yan Y M,et al.Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of the wheatTaMAPK2 gene[J].Journal of Plant Genetic Resources,2011,12(1):92-95,102.

27.王鏡巖,朱圣庚,徐長(zhǎng)發(fā).生物化學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2002:164-165.

Wang J Y,Zhu S G,Xu C F.Biochemistry[M].Beijing:Higher Education Press,2002:164-165.

28.He Z Y,Li L G,Luan S.Immunophilins and parvulins.Superfamily of peptidyl prolyl isomerases inArabidopsis[J].Plant Physiology,2004,134(4):1248-1267.

29.Vallon O.Chlamydomonas immunophilins and parvulins:survey and critical assessment of gene models[J].Eukaryotic Cell,2005,4(2):230-241.

30.張安紅,王志安,肖娟麗,等.親環(huán)素基因GhCYP1在陸地棉中的過量表達(dá)及耐鹽性分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(2):107-109,122.

Zhang A H,Wang Z A,Xiao J L,et al.Overexpression of cyclophilin gene(GhCYP1) in trangentic cotton and its salt tolerance analysis[J].Journal of Shanxi Agricultural Sciences,2014,42(2):107-109,122.

31.Trivedi D K,Bhatt H,Pal R K,et al.Structure of RNA-interacting cyclophilin A-like protein fromPiriformosporaindicathat provides salinity-stress tolerance in plants[J].Scientific Reports,2013,3:3001.

32.Trivedi D K,Ansari M W,Bhavesh N S,et al.Response ofPiCypAtobacco T2 transgenic matured plant to potential tolerance to salinity stress[J].Plant Signaling & Behavior,2014,9(1):e27538.

The National Key Research and Development Program of China(2016YFC0501203)；Heilongjiang province start postdoctoral scientific research grants(LBH-Q15004)；The national youth fund(31500317)

introduction：LIAO Xu(1993—),male,master,major in saline-alkali gene mining and function research.

date:2017-04-17

ProkaryoticExpression,ActivityAssayofChlorellaCyclophilinAandSaltToleranceAnalysisofArabidopsisOver-expressingCsCyp1A

LIAO Xu1HE Ming-Liang1ZHANG Su-Yan2MA Hai-Yan1WANG Xu-Hui1LUO Qiu-Xiang1GUAN Qing-Jie1*

(1.Northeast Forestry University,Alkali Soil Natural Environmental Science Center,Harbin 150040；2.Dehui No.9 Middle School in Jilin Province,Dehui 130300)

In order to test the activity of peptidyl-prolyl cis-trans isomerase of cyclophilin encoded byCsCyp1A, which was isolated fromChlorellasp. X1 in previous research(Accession No:KY207381), the primers were designed by usingpMD18-T-CsCyp1Aplasmid DNA as template and the target gene fragment that includedKpnⅠ andSalⅠ digestion sites were obtained by cloning. After enzyme digestion, ligation and sequence analysis, the His-taggedpQE-30-CsCyp1Aprokaryotic expression vector was obtained. IPTG inducedE.coliM15 strain which contained its plasmid to express the fusion protein. Purified soluble HisCsCypA fusion protein was obtained by purification on a Nitra-column and the relative molecular mass of CsCyp1A was about 29 kDa. HisCsCyp1A protein hybridization signal was detected by Western blot. By enzyme activity analysis, the production rate of chromogenic groups in HisCsCyp1A fusion protein was significantly faster than in control, and the CsCyp1A protein could catalyze the cis-trans folding of Xaa-Pro peptide bond in N-succinyl-Xaa-Pro- Phe-p-nitroanilide and accelerate the cleavage of blocking groups. The purified CsCyp1A protein had PPIase activity. By overexpression ofCsCyp1Agene driven by 35S promoter inArabidopsisthalianaunder vacuum infiltration, the results showed that it increased the tolerance of overexpression lines to NaCl stress, and revealed the salt tolerance of ChlorellaCsCyp1Agene. It will become a genetic resource for resistance breeding. The study established the foundation for exploring the biological role of chlorella cyclophilin CsCyp1A in the anti-carbonate stress of algae.

phytococcal chlorella;saline-sodic soil;cyclophilin A;peptide prolyl cis-trans isomerase;prokaryotic expression protein

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFC0501203)；黑龍江省博士后科研啟動(dòng)資助金(LBH-Q15004)；國(guó)家青年基金(31500317)資助

廖栩(1993—)，男，碩士研究生，主要從事耐鹽堿相關(guān)基因挖掘與功能研究。

* 通信作者：E-mail:guanqingjie@nefu.edu.cn

2017-04-17

* Corresponding author：E-mail:guanqingjie@nefu.edu.cn

Q812

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.05.012