海藻酸鈉包埋希瓦氏菌及其對(duì)活性艷紅X—3B脫色研究

肖力彬+劉柳+汪聰+蔡亞君

摘 要：本研究分析腐敗希瓦氏菌4H菌株通過(guò)海藻酸鈉進(jìn)行固定化以后對(duì)偶氮染料活性艷紅X-3B的處理效果。首先以該菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體為對(duì)象，確定了在CaCl2濃度為1.5%、海藻酸鈉濃度為2.5%、微球粒徑0.6mm時(shí)包埋得到的微球性能最佳。用包埋了腐敗希瓦氏菌4H菌體的微球分別在不同的pH、溫度、染料濃度等條件下處理活性艷紅X-3B，在pH為5和9時(shí)，微球?qū)?0mg/L活性艷紅X-3B35℃靜置處理8h時(shí)的脫色率分別為70.8%和67.7%，而菌懸液只有34.2%和47.6%；在溫度分別為20℃和50℃時(shí)，對(duì)50mg/L活性艷紅X-3B靜置處理12h時(shí)的脫色率分別為73.1%和62.7%，而菌懸液只有57.6%和27.3%；在染料濃度高達(dá)1600mg/L和3200mg/L時(shí)，微球?qū)H7的活性艷紅X-3B在35℃靜置處理48h時(shí)的脫色率分別為95.3%和94.1%，菌懸液為92.3%和91.3%。結(jié)果顯示，腐敗希瓦氏菌4H菌經(jīng)海藻酸鈉包埋固定化后形成的微球?qū)Σ焕h(huán)境的耐受性更強(qiáng)，且多次重復(fù)利用仍具較好的脫色效果，具有更好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：腐敗希瓦氏菌；固定化；海藻酸鈉；活性艷紅X-3B；脫色

廢水生物處理是主要利用微生物的分解作用去除水中污染物的方法，成本低且無(wú)二次污染，是現(xiàn)代廢水處理中應(yīng)用最廣泛的方法之一，但印染廢水由于其有機(jī)物含量高、可生化性差、色度深、水質(zhì)變化大，對(duì)常規(guī)的活性污泥或生物膜等生物處理系統(tǒng)中的微生物（無(wú)論是天然微生物還是投加的功能菌）生長(zhǎng)代謝影響大，導(dǎo)致生物處理系統(tǒng)消耗快、效率低。針對(duì)這一問(wèn)題，本研究以一株染料脫色菌株為對(duì)象，比較將菌體通過(guò)海藻酸鈉固定化技術(shù)包埋在微球里后處理染料廢水時(shí)對(duì)環(huán)境條件的耐受度和脫色效果，從而分析利用包埋固定化技術(shù)提高印染廢水生物處理系統(tǒng)效率的可行性。

一、材料和方法

1.菌株來(lái)源 菌株Shewanella putrefaciens 4H為本實(shí)驗(yàn)室分離篩選。

2.菌株的活化及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將保藏菌種接種到5ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中35℃活化培養(yǎng)，觀察脫色時(shí)間，如脫色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則重復(fù)此步驟，直至脫色時(shí)間穩(wěn)定之后，將菌液按1：100比例轉(zhuǎn)接至50ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)，定時(shí)取樣檢測(cè)培養(yǎng)物的OD600和OD525，根據(jù)OD600繪制生長(zhǎng)曲線，確定生長(zhǎng)曲線中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間段。同時(shí)根據(jù) OD525 計(jì)算不同時(shí)間的脫色率，確定脫色完全所需時(shí)間。

3.海藻酸鈉包埋固定化條件研究 以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體（無(wú)菌水洗滌三次）為對(duì)象，將菌體用無(wú)菌水懸浮至OD600值為1～2的菌懸液，然后取該菌懸液0.5mL與4.5mL的海藻酸鈉溶液充分混和，在無(wú)菌的100mL小燒杯中倒入60mL氯化鈣溶液，用注射器將菌懸液和海藻酸鈉的混合物滴入氯化鈣溶液之中，即可形成固定化微球。此后將燒杯置于4℃的冰箱中，18h之后取出，去除氯化鈣溶液，并用生理鹽水洗滌固定化微球3次，再置于4℃冰箱中，保存?zhèn)溆?。比較不同的海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、注射器口徑對(duì)制得微球性能的影響，確定最佳的固定化條件。

4.固定化微球?qū)钚云G紅X-3B的脫色研究 將固定化微球在不同溫度、pH、染料濃度的條件下處理活性艷紅X-3B，以等量菌懸液在相同條件下的處理為對(duì)照，分析固定化對(duì)菌株生長(zhǎng)及脫色性能的影響。并對(duì)固定化微球的重復(fù)利用效果進(jìn)行了分析。

二、 結(jié)果與分析

1.菌株S. putrefaciens 4H生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將S. putrefaciens 4H菌株過(guò)夜活化培養(yǎng)后按1：100轉(zhuǎn)接至50ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中35℃、200rpm培養(yǎng)，每2h檢測(cè)培養(yǎng)液的OD600值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)繪得該菌在該培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線。

2.菌株S. putrefaciens 4H海藻酸鈉固定化研究

將S. putrefaciens 4H菌株過(guò)夜活化培養(yǎng)后按1：100轉(zhuǎn)接至50 mL含50 mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中35℃、200rpm培養(yǎng)，8h時(shí)將培養(yǎng)液離心取菌體，將菌體用無(wú)菌水洗滌三次后用無(wú)菌水懸浮至OD600值為1.2。將菌懸液按每份0.5ml等量分裝，在不同海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、注射器口徑的條件下制備固定化微球。

（1） 氯化鈣濃度對(duì)固定化微球性能的影響。首先，比較了海藻酸鈉溶液濃度為3.0%、注射器口徑為0.6mm時(shí)，氯化鈣溶液濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時(shí)制備微球的性能。肉眼觀察到微球成球性能均良好。將微球分別轉(zhuǎn)接到5ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB液體培養(yǎng)基中35℃靜置培養(yǎng)，每2h取樣，離心之后測(cè)上清的OD525，計(jì)算脫色率。結(jié)果顯示，不同氯化鈣濃度時(shí)制備得到的微球最終都能脫色完全，但氯化鈣濃度為1.5%時(shí)在整個(gè)處理過(guò)程中的表現(xiàn)最好。脫色完全之后觀察到的固定化微球的形態(tài)仍然良好，對(duì)微球外培養(yǎng)液OD600值的檢測(cè)也顯示無(wú)游離菌體的存在。

（2）海藻酸鈉濃度對(duì)固定化微球性能的影響。在氯化鈣溶液濃度為1.5%、注射器口徑為0.6mm時(shí)，比較海藻酸鈉濃度分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%時(shí)制備得到的微球的性能。肉眼觀察到微球成球性能均良好。將微球分別轉(zhuǎn)接到5ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB液體培養(yǎng)基中35℃靜置培養(yǎng)，每2h取樣，離心之后測(cè)上清的OD525，計(jì)算脫色率。結(jié)果顯示，海藻酸鈉濃度為2.5%時(shí)制備得到的微球的脫色效果最好。脫色完全之后觀察到的固定化微球的形態(tài)仍然良好，對(duì)微球外培養(yǎng)液OD600值的檢測(cè)也顯示無(wú)游離菌體的存在。

（3） 微球直徑對(duì)固定化微球性能的影響。在氯化鈣溶液濃度為1.5%、海藻酸鈉濃度為2.5%時(shí)，比較注射器口徑分別為0.45mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm時(shí)制備得到的微球的性能。肉眼觀察到由口徑為0.5mm、0.6mm、0.7mm的注射器制備得到的微球成球性能均良好。將微球分別轉(zhuǎn)接到5ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB液體培養(yǎng)基中35℃靜置培養(yǎng)，每2h取樣，離心之后測(cè)上清的OD525，計(jì)算脫色率。結(jié)果顯示，由口徑為0.6mm的注射器制備得到的固定化微球的脫色效果最好。直徑為0.5mm、0.6mm、0.7mm的固定化微球脫色完全之后觀察到的形態(tài)仍然良好，對(duì)微球外培養(yǎng)液OD600值的檢測(cè)也顯示無(wú)游離菌體的存在；而直徑為0.45mm的微球有部分破碎現(xiàn)象，取樣測(cè)定OD600值，也檢測(cè)到有部分游離菌的存在。endprint

3.菌株S. putrefaciens 4H固定化微球?qū)钚云G紅X-3B的脫色效果

將固定化微球和等菌量的菌懸液分別轉(zhuǎn)接入不同pH 、含不同濃度活性艷紅X-3B的LB液體培養(yǎng)基中，于不同溫度靜置培養(yǎng)，每2h取樣，離心之后取上清檢測(cè)OD525，計(jì)算脫色率。

（1）固定化微球?qū)H的耐受性研究。將固定化微球和菌懸液分別接入5ml pH分別為5、6、7、8、9的含50mg/L活性艷紅X-3B染料的LB液體培養(yǎng)基中35℃靜置培養(yǎng)。脫色率檢測(cè)結(jié)果顯示，在pH為6、7、8時(shí)，菌懸液的脫色效果優(yōu)于微球，6h脫色率分別為90%左右和70%-80%；而pH為5時(shí)，菌懸液濃度不增加，8h脫色率最高僅34.2%，微球8h脫色率為 70.8%；pH為9時(shí)，菌懸液濃度增加少，8h脫色率為47.6%，微球?yàn)?7.7%。

（2）固定化微球?qū)囟鹊哪褪苄匝芯?。將固定化微球和菌懸液分別接入5ml pH 7的含50mg/L活性艷紅X-3B染料的LB液體培養(yǎng)基中，分別于20℃、30℃、35℃、40℃、50℃靜置培養(yǎng)。脫色率檢測(cè)結(jié)果顯示，在溫度為30、35、40℃時(shí)，菌懸液的脫色效果優(yōu)于微球，6h脫色率分別為90%左右和70%左右；而溫度為20℃時(shí)，菌懸液濃度增加少，菌懸液12h脫色率最高僅57.6.2%，微球12h脫色率為 73.1%；溫度為50℃時(shí)，菌懸液濃度不增加，12h脫色率為27.3%，微球?yàn)?2.7%。

（3）固定化微球?qū)θ玖蠞舛鹊哪褪苄匝芯?。將固定化微球和菌懸液分別接入5ml pH 7的活性艷紅X-3B濃度分別為50mg/L、100 mg /L、200 mg /L、400 mg /L、800 mg /L、1600 mg /L、3200mg/L的LB培養(yǎng)基中，35℃靜置培養(yǎng)。脫色率檢測(cè)結(jié)果顯示，在染料濃度≤800 mg /L時(shí)，菌懸液的脫色效果優(yōu)于微球，如對(duì)濃度≤200 mg /L的染料，微球處理6h脫色率均80%左右，菌懸液均90%左右；對(duì)400 mg /L的染料，微球處理6h脫色率為60%左右，菌懸液80%左右；對(duì)800 mg /L的染料，微球處理6h脫色率為50%左右，菌懸液60%左右。當(dāng)染料濃度為1600 mg/L時(shí)，菌懸液對(duì)染料的脫色率最初優(yōu)于微球，但是在12h之后微球的脫色效果優(yōu)于菌懸液，48h時(shí)微球脫色率為95.3%，菌懸液為92.3%。當(dāng)染料濃度為3200 mg/L時(shí)，微球的脫色效果優(yōu)于菌懸液，48h時(shí)微球脫色率為94.1%，菌懸液為91.3%。

（4）固定化微球的重復(fù)利用性研究。將微球轉(zhuǎn)接入5ml pH7的含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中，測(cè)定起始OD525值及處理6h后OD525值，計(jì)算6h脫色率。然后將固定化微球取出后用生理鹽水洗滌三次，再轉(zhuǎn)入新的含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中，檢測(cè)6h脫色率。重復(fù)上述步驟，直到固定化微球破損較為嚴(yán)重。

在第6次重復(fù)使用時(shí)，其6h脫色率僅比第1次的下降5%左右，脫色性能保持較好，但總體來(lái)說(shuō)隨使用次數(shù)的增加而呈下降趨勢(shì)。在前3次重復(fù)使用時(shí)固定化微球形態(tài)良好，沒(méi)有出現(xiàn)破損，但從第4次開(kāi)始微球開(kāi)始出現(xiàn)破損，第6次后固定化微球發(fā)生崩解。

三、討論

本研究結(jié)果顯示，菌株S. putrefaciens 4H通過(guò)海藻酸鈉包埋固定化后得到的微球?qū)Σ焕h(huán)境的耐受性增強(qiáng)，且可重復(fù)利用，表明該菌通過(guò)包埋固定化后在對(duì)溫度、pH、染料濃度等水質(zhì)參數(shù)變化大的印染廢水的生物處理中具有了更好的應(yīng)用前景。而包埋形成的微球之所以能夠在不利環(huán)境中發(fā)揮降解作用，主要是由于固定化載體起到了一個(gè)保護(hù)屏障的作用，使細(xì)胞不直接與外界環(huán)境相接觸，從而可以抵御土著微生物的惡性競(jìng)爭(zhēng)、防止或減緩噬菌體、毒性物質(zhì)及高滲透壓物質(zhì)的吞噬和毒害等；其次，固定化載體內(nèi)部有較高的孔隙度，可以容納細(xì)胞的增殖，同時(shí)細(xì)胞分泌的胞外酶可經(jīng)過(guò)孔隙釋放到外界降解污染物，或細(xì)胞本身可將從孔隙進(jìn)入的低濃度的污染物直接降解而不受到高濃度污染物的毒害。

本研究所用菌株屬于希瓦氏菌屬，該屬菌株呼吸類(lèi)型多樣，能利用有機(jī)物產(chǎn)生能量，能還原金屬鹽[5-10]、硝酸鹽和腐殖酸等有機(jī)污染物[7，10]，也能將染料脫色，此外，還發(fā)現(xiàn)多個(gè)希瓦氏菌株能產(chǎn)電。目前，希瓦氏菌在醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、電化學(xué)、海洋生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域均得到應(yīng)用，具有很高的研究?jī)r(jià)值。而本文對(duì)希瓦氏菌固定化的研究，也有助于該屬細(xì)菌在各個(gè)領(lǐng)域的更好應(yīng)用。

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