三種偽狂犬病病毒gE抗體ELISA檢測試劑盒的比較

董雅琴，劉 爽，鄭 輝，張 志，吳發(fā)興，李曉成

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114）

三種偽狂犬病病毒gE抗體ELISA檢測試劑盒的比較

董雅琴1，劉 爽1，鄭 輝2，張 志1，吳發(fā)興1，李曉成1

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114）

為比較3種品牌（A、B、C）偽狂犬病病毒（PRV）gE抗體ELISA檢測試劑盒的臨床使用效果，應(yīng)用中和試驗(yàn)來標(biāo)定偽狂犬病非免疫豬場的180份臨床血清樣品，同時(shí)用3種試劑盒進(jìn)行檢測，并對試劑盒的重復(fù)性、敏感性、特異性以及與中和試驗(yàn)結(jié)果的符合度等指標(biāo)進(jìn)行測定與分析。結(jié)果顯示：3種試劑盒的批內(nèi)穩(wěn)定性均較好，變異系數(shù)均小于10%；批間重復(fù)性差異較大，變異系數(shù)最小者為8.09%，最大者高達(dá)21.31%；3種試劑盒的診斷特性良好，敏感性為95.56%～97.78%，特異性為94.44%～100%；各試劑盒檢測結(jié)果與中和試驗(yàn)結(jié)果均完全相符（Kappa值為0.91～0.96）。比較結(jié)果表明，3種試劑盒均適用于臨床樣品的PRV gE抗體檢測，其中穩(wěn)定性及敏感性俱佳的試劑盒C更適用于PRV的持續(xù)監(jiān)測、早期發(fā)現(xiàn)、引種檢疫及凈化效果評估，而特異性與準(zhǔn)確性最高的試劑盒B更適用于貴重病畜的診斷淘汰。因此，生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)根據(jù)診斷目的合理選擇最適試劑盒。

偽狂犬病毒；gE抗體；ELISA檢測試劑盒；比較

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）又稱Aujeszky氏病，是發(fā)生于豬及多種家畜和野生動物的高度接觸性傳染病。其病原為偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）。動物感染后會出現(xiàn)發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎等急性病癥[1]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將該病列為須報(bào)告動物疫病[2]。我國將其列入《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》優(yōu)先防治疫病及重點(diǎn)凈化考核疫病，并將到2020年全國所有種豬場達(dá)到PR凈化標(biāo)準(zhǔn)列為控制目標(biāo)[3]。為配合豬場做好PR的凈化工作，快速準(zhǔn)確鑒定PRV野毒感染尤為必要。

當(dāng)前我國主要通過疫苗免疫進(jìn)行PR防控。PRV基因缺失疫苗的廣泛使用不但可以有效控制PR，還可以通過gE抗體檢測來鑒定豬只是否感染PRV野毒。隨著PRV gE基因缺失疫苗的廣泛應(yīng)用，針對該基因建立的抗體ELISA檢測方法已被普遍用于PRV野毒感染的檢測。目前，市場上PRV gE抗體ELISA檢測試劑盒品牌眾多。如何合理選擇診斷試劑盒是基層檢測中普遍存在的問題。本研究選擇3個(gè)應(yīng)用較廣的進(jìn)口品牌試劑盒，從敏感性、特異性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性等方面進(jìn)行比較，以期為實(shí)踐中PRV gE抗體ELISA檢測試劑盒的合理選擇提供依據(jù)，也為PR凈化提供一定的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 ELISA試劑盒

3種PRV gE抗體ELISA檢測試劑盒，每種試劑盒各3個(gè)批次：A品牌試劑盒（批號CL456、BL680、BL524）、B品牌試劑盒（批號MAE100633、MAE100640、MAE100652）、C品牌試劑盒（批號P-01024、P-01118、P-1211）。3種試劑盒的原理均為阻斷ELISA。

1.2 病毒與細(xì)胞

PRV閩A株，豬腎細(xì)胞傳代細(xì)胞系PK-15，均由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心畜病監(jiān)測室保存。

1.3 參考血清

PR抗體陽性參考血清，中和抗體效價(jià)為1∶（1 651±839），PR抗體陰性參考血清，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 臨床血清樣本的定性

背景清楚的臨床豬血清樣品180份，均來源于PR非免疫場。用病毒中和試驗(yàn)對其進(jìn)行檢測，最終得到90份PR抗體陽性血清和90份PR抗體陰性血清將其用于試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)的測定。具體操作見文獻(xiàn)[4]。

1.5 ELISA檢測及結(jié)果判定

嚴(yán)格按試劑盒說明書對血清樣品進(jìn)行檢測，在指定波長下測定樣品的OD值。按公式進(jìn)行換算，并判定結(jié)果（表1）。

表1 各試劑盒檢測方法及判定條件

1.6 敏感性、特異性、與中和試驗(yàn)的符合度測定

對3種試劑盒各取1個(gè)批次，對180份臨床血清樣品同時(shí)進(jìn)行檢測，結(jié)果填入表2。按公式敏感性Se=a/（a+c），特異性Sp=d/（b+d）[4-5]，計(jì)算各試劑盒的Se和Sp。按照公式Kappa12=2（adbc）/（p1q2+p2q1），計(jì)算試劑盒與金標(biāo)方法結(jié)果間的Kappa值，比較試劑盒與金標(biāo)的符合程度。Kappa值在0.81～1，說明兩個(gè)方法間完全符合；在0.61～0.8，為高度符合；在0.41～0.6，為中度符合；在0.21～0.4，為比較符合；0.2以下為輕度符合；0以下為不符合[6-7]。

表2 敏感性、特異性計(jì)算數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

選取經(jīng)中和試驗(yàn)判定的PR抗體陽性血清和陰性血清各20份，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。在以下兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)束后，對每份樣品的3個(gè)結(jié)果（OD值）計(jì)算變異系數(shù)（CV=平均值/標(biāo)準(zhǔn)差），再計(jì)算所有樣品的平均變異系數(shù)；以批內(nèi)重復(fù)平均變異系數(shù)和批間重復(fù)平均變異系數(shù)的大小，來衡量3種試劑盒的批內(nèi)、批間穩(wěn)定性。

1.7.1 批內(nèi)重復(fù)性測定。每種試劑盒隨機(jī)抽取1個(gè)批次，用不同盒的3塊板，對以上血清同時(shí)進(jìn)行檢測。

1.7.2 批間重復(fù)性測定。每種試劑盒隨機(jī)抽取3個(gè)批次，每批各抽1塊板，對以上血清同時(shí)進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 敏感性、特異性、與中和試驗(yàn)結(jié)果的符合度測定結(jié)果

各試劑盒敏感性較高，均在95%以上，其中試劑盒C敏感性最高，達(dá)到97.78%；各試劑盒特異性均在94%以上，其中試劑盒B的特異性達(dá)到100%。各試劑盒檢測結(jié)果與中和試驗(yàn)結(jié)果間的Kappa值均大于0.9。這說明3個(gè)品牌試劑盒的測定結(jié)果與中和試驗(yàn)結(jié)果均完全符合。符合程度由高到低依次為試劑盒B、C、A。

表3 各試劑盒診斷特性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 重復(fù)性測定結(jié)果

試劑盒A、B、C的批內(nèi)平均變異系數(shù)均小于10%，由此說明3種試劑盒的批內(nèi)重復(fù)性均良好；試劑盒C變異系數(shù)最小說明其批內(nèi)板間穩(wěn)定性最好；試劑盒C的批間平均變異系數(shù)小于10%，說明其批間重復(fù)性良好；試劑盒B的批間平均變異系數(shù)為11.02%，說明其批間重復(fù)性一般；試劑盒A批間平均變異系數(shù)大于20%，說明其批間重復(fù)性較差。綜合批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，試劑盒穩(wěn)定性由高到低依次為C、B、A。

表4 各試劑盒批內(nèi)、批間變異系數(shù)的比較

3 討論

目前對PRV gE抗體ELISA檢測試劑盒的比較與評價(jià)的研究并不多。陳偉杰等[8]通過分析3種商用試劑盒對同一批臨床血清樣品的檢測結(jié)果，計(jì)算兩兩試劑盒結(jié)果間的相關(guān)性、符合率和Kappa值，發(fā)現(xiàn)3種試劑盒具有極顯著的相關(guān)性以及極強(qiáng)或高度的一致性；通過比較各試劑盒的陽性率高低，直接得出三者敏感性的高低順序。該研究在計(jì)算敏感性時(shí)，沒有考慮到試劑盒檢測出的陽性結(jié)果并不一定全是真陽性。而本研究在評價(jià)試劑盒的敏感性、特異性時(shí)，應(yīng)用了“金標(biāo)準(zhǔn)”方法——病毒中和試驗(yàn)，來標(biāo)定血清樣品的陰、陽性，以此為標(biāo)準(zhǔn)來衡量待檢驗(yàn)試劑盒的特性。這樣更加科學(xué)。楊濤等[9]應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)來比較兩種PRV gE抗體ELISA檢測試劑盒，得出二者結(jié)果高度一致，均可應(yīng)用于臨床檢測。該文獻(xiàn)只側(cè)重于評價(jià)兩兩試劑盒間的一致性，而對診斷試驗(yàn)的特性——敏感性、特異性以及試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性（重復(fù)性）和準(zhǔn)確性未作評價(jià)。本研究應(yīng)用來自PR非免疫場的180份臨床豬血清樣品，先用病毒中和試驗(yàn)對血清進(jìn)行定性，然后以此結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，對3種商品化試劑盒的敏感性、特異性和準(zhǔn)確度進(jìn)行了評價(jià)；同時(shí)隨機(jī)抽取同批中不同反應(yīng)板以及不同批次的反應(yīng)板，來評價(jià)3種試劑盒的批內(nèi)、批間重復(fù)性，創(chuàng)新地對3種試劑盒的各項(xiàng)特性進(jìn)行了全面測定與比較。

國際推薦的檢測PR抗體的方法有病毒中和試驗(yàn)（VN）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。其中，前者一直被認(rèn)為是檢測PR抗體的“金標(biāo)準(zhǔn)”，后來因其操作復(fù)雜、耗時(shí)長，在大量檢測中往往被ELISA試驗(yàn)所取代[10]。因目前國內(nèi)使用的PR疫苗均為gE基因缺失苗，故非免疫場中，抗體陽性血清必為感染抗體陽性，即gE抗體陽性。

本研究結(jié)果表明，3種試劑盒檢測結(jié)果與中和試驗(yàn)結(jié)果的符合度極高。因此，這3種試劑盒可以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，均適用于臨床PRV gE抗體檢測。從穩(wěn)定性來講，3種試劑盒的批內(nèi)穩(wěn)定性均較好，批內(nèi)重復(fù)平均變異系數(shù)均在10%以內(nèi)（C＜B＜A）；但批間穩(wěn)定性差異較大，A、B、C的批間重復(fù)平均變異系數(shù)分別為21.31%、11.02%、8.09%?？梢姡粢獙RV野毒抗體進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測，就需試劑盒具備較好的穩(wěn)定性，以保證監(jiān)測數(shù)據(jù)的可靠性和縱向可比性。這時(shí)應(yīng)選擇穩(wěn)定性最佳的試劑盒C。從診斷特性來講，3種試劑盒的敏感性和特異性均較好，但仍有差異。試劑盒A、B、C的敏感性分別為96.67%、95.56%、97.78%；特異性分別為94.44%、100.00%、95.56%。臨床上在選用診斷試劑盒時(shí)，在準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性相當(dāng)?shù)那闆r下，通常都想追求高敏感性和高特異性，但有時(shí)無法兼得。因此，在選用試劑盒時(shí)應(yīng)根據(jù)診斷目的，來對敏感性和特異性進(jìn)行取舍。如：用于疫病的早期發(fā)現(xiàn)、引種檢疫、證明某地?zé)o疫或評價(jià)豬場凈化效果時(shí)，就要求診斷試驗(yàn)的敏感性越高越好，即假陰性結(jié)果越少越好，不讓任何發(fā)?。ǜ腥荆﹦游锫z，此種情況下建議使用試劑盒C；若用于淘汰貴重病畜、出口貿(mào)易時(shí)，則要求診斷試驗(yàn)的特異性越高越好，即假陽性結(jié)果越少越好，不錯(cuò)殺1例或錯(cuò)判1份樣品，此時(shí)最好使用試劑盒B。臨床實(shí)踐中，應(yīng)綜合分析試劑盒的各項(xiàng)性能指標(biāo)，并根據(jù)工作需求合理選擇最合適的診斷試劑。

[1] 郝飛，湯德元，李春燕，等. 偽狂犬病病毒Guizhou-DY株的分離鑒定及致病性研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44（11）：1851-1856.

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Comparison on Three ELISA Test Kits for gE Antibodies of Pseudorabies Virus

Dong Yaqin1，Liu Shuang1，Zheng Hui2，Zhang Zhi1，Wu Faxing1，Li Xiaocheng1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Qingdao Yebio Biological Engineering Co.，Ltd.，Qingdao，Shandong 266114）

To compare the clinical using effects from three brands of commercial ELISA test kits for Pseudorabies virus（PRV）gE antibodies，180 sera samples were collected from swine farms without PRV vaccination. The sera was determined by virus neutralization test（VN）and was tested by the three ELISA kits at the same time. The characteristics of the three kits were determined and analyzed，including the repeatability，diagnostic sensitivity，specificity and coincidence with VN. The results were as follows：all the three kits had good stability in the inter-assay test with coefficient of variation（CV）below 10%，whereas they were quite different in the intra-assay test with CV，which ranged from 6.90% to 28.87%. And all of the three kits performed well in their sensitivity（from 95.56% to 97.78%）and specificity（from 94.44% to 100%）. Besides，test results of the three kits were completely consistent with those of VN，with the Kappa value from 0.91 to 0.96. The results of the study indicated that all the three brands of ELISA kits were applicable for detection of PRV gE antibodies. Kit C was suitable for continuous surveillance，early detection，introduction quarantine and evaluation on eradication effect because of its best stability and sensitivity；while kit B could be used to diagnose culling expensive animals based on its best specificity and accuracy. Therefore，the optimum reagent kit should be chosen reasonably according to the purpose of diagnosis in production practice.

Pseudorabies virus；gE antibody；ELISA test kits；comparison

S852.659.1

B

1005-944X（2017）11-0079-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.021

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1200500）；科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2012FY111000）

李曉成