番茄紅素對反式脂肪酸致小鼠腎臟損傷的修復作用

丁 旭，謝 羨，劉 娟，姚明顏，朱樂玫

（長沙醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，長沙 410219）

番茄紅素對反式脂肪酸致小鼠腎臟損傷的修復作用

丁 旭，謝 羨，劉 娟，姚明顏，朱樂玫

（長沙醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，長沙 410219）

目的：探討番茄紅素（Lycopene，LP）對反式脂肪酸（Trans fatty acid，TFA）染毒小鼠腎臟損傷的修復作用及其機制。方法：40只健康SPF級小鼠隨機分為正常對照、TFA染毒、TFA染毒+低劑量LP保護、TFA染毒+中劑量LP保護和TFA染毒+高劑量LP保護5個組，每組8只（雌雄各半）。統(tǒng)一在上午對對照組用生理鹽水對小鼠進行灌胃，除外各組分別灌胃TFA 50mg/kg.bw；在下午對各劑量LP保護組分別灌胃LP 5mg/kg.bw、10mg/kg.bw、20mg/kg.bw，隔天灌胃一次。8周后，觀察小鼠生長情況，取其腎臟標本做病理形態(tài)學觀察；取血，進行血清尿素（UREA）、肌酐（CREA）、尿酸（UA）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）含量的檢測和腎組織丙二醛（MDA）含量及腎臟超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的測定。結果：較對照組，TFA染毒組小鼠體重、腎臟臟器系數、血清中UREA、CREA、TG、TC、LDL-C及MDA含量增加，差異間均有統(tǒng)計學意義；UA、HDL-C含量減少及SOD、GSH-Px活性下降，差異間均有統(tǒng)計學意義；且腎組織可見形態(tài)病變。較TFA染毒組，TFA染毒+低、中、高LP保護組體重、肝臟臟器系數、血清中UREA、CREA、TG、TC、LDL-C及MDA含量減少差異間均有統(tǒng)計學意義；UA、HDL-C含量增加及SOD、GSH-Px活性有升高，差異間均有統(tǒng)計學意義；且隨著LP劑量的升高，腎組織結構趨于正常，病理變化明顯改善。結論：番茄紅素可修復由反式脂肪酸導致的腎臟損傷，對腎功能有保護作用。

番茄紅素；反式脂肪酸；腎臟損傷；修復作用

反式脂肪酸（trans fatty acid，TFA）是一種不飽和脂肪酸，含有一個或多個非共軛反式雙鍵，它作為油脂的一種，逐漸作為食品安全領域的焦點，引起了大家的廣泛關注［1］。反式脂肪酸由人體攝入后可以以正常脂類的吸收代謝途徑進入人體體內，干擾正常脂類的代謝；已有大量研究證明，隨食品攝入過量的反式脂肪酸會導致機體心血管系統(tǒng)疾病、嬰兒發(fā)育、糖尿病、老年癡呆等危害，且人類脂酶對TFA無效，使其易于在動脈沉積，對肝腎系統(tǒng)造成損傷［2］。番茄紅素（Lycopene，LP）是成熟番茄中的主要色素，也是常見的類胡蘿卜素之一，廣泛的存在于番茄、番茄制品及葡萄柚等多類水果中，且對單線態(tài)氧的猝滅活性最高。番茄紅素具有極強的抗氧化活性和清除自由基的功效，使自由基的產生和清除處于平衡，消退線粒體中的大部分活性氧（Reactive oxygen species，ROS）。此外，番茄紅素還具有預防腫瘤、調節(jié)炎癥相關因子、降低血脂及心血管疾病的發(fā)生等生物學作用［3］。本研究通過隨機對照試驗，探討番茄紅素對反式脂肪酸致小鼠腎臟損傷的修復作用，為改善反式脂肪酸導致的腎臟損傷及其作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物40只健康SPF級小鼠（雌雄各半），體重18～22g。由長沙市天勤生物技術提供，許可證號：SCXK［湘］ 2014-0011。動物在實驗專用飼養(yǎng)房標準條件下飼養(yǎng)，室溫250C左右，相對濕度50%～70%，光照吋間12 h/12 h明暗交替，動物自由進食飲水。

1.1.2 主要儀器與試劑7170A全自動生化分析儀（日本Hatachi公司），CK40光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司），RM2245型石蠟切片機（德國Leica公司），AB204-N型電子分析天平（METTLER公司），80-2型臺式低速離心機（上海手術器械廠）

番茄紅素（Lycopene，LP）粉劑（純度＞90%，上海思域化工科技有限公司）；反式脂肪酸（Trans Fatty Acids，TFA）油劑（純度＞95%，上海銳聰科技發(fā)展有限公司）；小鼠超氧化物岐化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（Malonaldehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物有限公司）

1.2 方法

1.2.1 動物的分組將40只健康SPF級小鼠隨機分為正常對照組、TFA染毒組、TFA染毒+低劑量LP保護組、TFA染毒+中劑量LP保護組、TFA染毒+高劑量LP保護組5個組，每組8只（雌雄各半）。統(tǒng)一在上午對對照組用生理鹽水對小鼠進行灌胃，除外各組分別灌胃TFA 50mg/kg.bw；在下午對低、中、高劑量番茄紅素保護組分別灌胃LP 5mg/kg.bw、10mg/kg.bw、20mg/ kg.bw，隔天灌胃一次。

1.2.2 血液、腎組織的采集及相關指標的測定末次灌胃后，動物禁食12h，不禁水，分別測定各組動物的體重；在實驗8周后，觀察小鼠生長情況，眼周取血后處死，并進行迅速解剖，取其腎臟組織做病理形態(tài)學觀察；并做常規(guī)病理學切片，HE染色觀察腎臟病理形態(tài)學變化。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 動物一般生長情況的觀察實驗期間，觀察各組動物的皮膚、毛發(fā)和生理功能變化等特征，記錄小鼠的進食量與飲水量，每周記錄一次體重變化。

1.3.2臟臟器系數測定用生理鹽水漂洗小鼠腎組織，濾紙吸干后準確稱取腎臟臟器重量，計算其臟器系數。

1.3.3 病理學觀察鼠均摘取左腎臟，將其置于10%福爾馬林中固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，于顯微鏡下觀察其形態(tài)學變化。

以上腎臟病理學染色、切片、拍照和讀片均在長沙醫(yī)學院病理學教研室老師指導下完成。

1.3.4 生化指標檢測取出已保存的血清（-800C），靜置至室溫。在日本7170A全自動生化分析儀的幫助下檢測各組小鼠血清腎功能指標：UREA、CREA、 UA，血脂指標：TG、TC、HDL-C、LDL-C。

上指標均在湖南省疾控中心生化檢驗科測定完成。

1.3.5 腎組織中SOD、GSH-Px活性及MDA含量的檢測每鼠均摘取右腎下半部（髓質皮質兼用），制備腎均漿液，離心后取上清。采用考馬斯亮蘭法測定腎組織蛋白含量：硫代巴比妥酸法（TBA法）測定MDA含量，采用二硫代雙硝基苯甲酸法（DTNB法）測定GSH-Px活性，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，均嚴格按試劑盒說明書方法進行操作。

1.3.6 統(tǒng)計學方法本次實驗數據均采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析處理，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析進行顯著性檢驗（LSD-t法）。顯著性檢驗水準α取值0.05，以P＜0.05為差異間具有統(tǒng)計學意義。用Excel軟件作圖。

2 結果

2.1 番茄紅素對TFA染毒小鼠生長的影響

番茄紅素對反式脂肪酸染毒小鼠體重的變化，見表1。

表1 LP對TFA染毒小鼠體重變化的影響（n=8）

由表1所示，各組小鼠初試體重較為接近，均無顯著性差別，無統(tǒng)計意義（P＜0.05）；TFA染毒組及低劑量LP保護組小鼠終試體重增長高于對照組（P＜0.05），對比組間差異有統(tǒng)計學意義；經各劑量LP保護的TFA染毒組小鼠體重增長均低于TFA染毒組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗期間除TFA染毒組小鼠體重增長快，皮下脂肪增厚，后期出現(xiàn)毛發(fā)蓬松，色澤暗淡、精神狀態(tài)差外，其余各組活動均正常，皮毛清潔，無豎毛、腺體分泌等異常改變，無動物死亡的現(xiàn)象。

2.2 番茄紅素對TFA染毒小鼠腎臟器系數的影響

番茄紅素對反式脂肪酸染毒小鼠臟器系數的變化見表2。

表2 LP對TFA染毒小鼠腎臟臟器系數的影響（n=8）

由表2得知：TFA染毒組及低、中、高劑量LP保護組小鼠腎臟器系數均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經低、中、高劑量LP保護的各組小鼠腎臟臟器系數均低于TFA染毒組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 番茄紅素對TFA染毒小鼠腎臟病理形態(tài)的影響

番茄紅素對反式脂肪酸染毒小鼠的腎臟病理形態(tài)的變化見圖3。

對照組：腎小球和腎小管結構完整，無變性、壞死及炎癥細胞浸潤等病理變化。

TFA染毒組：腎小球體積增大，系膜細胞增生；腎小管上皮細胞水變性，部分可見內有顆粒管型；腎間質內炎癥細胞浸潤。

TFA染毒+低劑量LP保護組：腎毛細血管球體積增大，部分腎小管擴張：管腔內有管型形成；腎間質內炎癥細胞浸潤，呈小灶性壞死。

TFA染毒+中劑量LP保護組：腎間質內炎癥細胞浸潤，腎間質血管擴張、充血。

TFA染毒+高劑量LP保護組：可見腎小球萎縮，腎小管上皮細胞水變性。

觀察情況如下圖。

圖3 LP對TFA染毒小鼠腎臟病理形態(tài)的影響（×10，HE）

2.4 番茄紅素對TFA染毒小鼠血清腎功能指標變化的影響

番茄紅素對反式脂肪酸染毒小鼠血清腎功能指標的變化見表3。

由表3得知：TFA染毒組及各劑量LP保護組小鼠血清UREA、CREA含量均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經LP保護后，各劑量LP保護組小鼠血清中UREA、CREA含量有不同程度的下降，與TFA染毒組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。TFA染毒組及低、中劑量LP保護組小鼠血清UA含量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經LP保護后的中、高劑量保護組小鼠血清UA含量均有增加，高于TFA染毒組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 LP對TFA染毒小鼠UREA、CREA、UA含量的影響（n=8）

2.5 番茄紅素對TFA染毒小鼠血清血脂指標變化的影響

番茄紅素對反式脂肪酸染毒小鼠血清血脂指標的變化見表4。

表4 LP對TFA染毒小鼠血脂指標的影響（n=8）

由表4得知：TFA染毒組及低、中劑量LP保護組小鼠血清TG、TC含量均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但經LP保護后，各劑量LP組TG、TC含量較TFA染毒組相比均呈降低趨勢，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，TFA染毒組及低、中劑量LP保護組小鼠血清HDL-C含量仍低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；各劑量LP保護組的小鼠血清HDL-C含量與TFA染毒組相比有所升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

與對照組相比，TFA染毒組及低、中、高劑量LP保護組小鼠血清LDL-C含量均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；各劑量LP保護組的小鼠血清LDL-C含量較TFA染毒組相比均呈降低趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.6番茄紅素對TFA染毒小鼠腎臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量改變的影響番茄紅素對反式脂肪酸染毒小鼠腎臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量的變化見表5。

由表5得知：與對照組比較，TFA染毒組及低、中、高劑量LP保護組腎臟SOD、GSH-Px活性下降，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經LP保護后的低、中、高LP保護組腎臟SOD、GSH-Px 活性有升高，MDA含量有下降，低于或高于TFA染毒組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但仍未恢復至正常水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表5 LP對TFA染毒小鼠腎臟SOD、GSH-Px活性、MDA含量的影響（n=8）

3 討論

本研究結果顯示，TFA染毒組小鼠的體重高于對照組，腎臟器系數在高于對照組的同時腎臟切片可見腎組織形態(tài)病變。以此表明攝入過量的反式脂肪酸可以使小鼠體重增加，反式脂肪酸所導致的腎臟器數增加與其病理形態(tài)變化具有相關性，與小鼠體重增加具有一致性。原因可能由于過量的反式脂肪酸阻礙了必需脂肪酸在體內的正常代謝，使正常的生理功能出現(xiàn)紊亂，且腎臟為反式脂肪酸主要毒作用的靶器官之一，從而抑制了小鼠腎臟組織的生長發(fā)育。而比較各劑量LP保護組與TFA染毒組發(fā)現(xiàn)，隨著番茄紅素劑量的增大，體重和腎臟系數增長逐步減緩，腎臟形態(tài)逐步有所改善，可能由于番茄紅素加速了體內的代謝，減少了反式脂肪酸在體內的蓄積，說明番茄紅素對反式脂肪酸致小鼠腎臟損傷具有修復作用。

腎臟為機體主要的排泄器官，可以維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定性，因此檢測腎臟功能尿素（UREA）、肌酐（CREA）、尿酸（UA）等是觀察腎臟損傷的主要指標。進一步的研究結果表明，TFA染毒組的小鼠血清中，UREA、CREA的含量增高，而血清UA的含量下降；LP保護組中的UREA、CREA含量均有不同程度的下降，而UA含量上升，且其隨著番茄紅素劑量的增加呈現(xiàn)下降或上升趨勢。這說明小鼠的腎臟受到了反式脂肪酸的毒性作用，產生了氧化應激損害反應，而番茄紅素對反式脂肪酸致小鼠腎臟損傷有保護和修復作用，其保護作用的大小隨著番茄紅素劑量的增加或減少呈一定的劑量-效應關系。其次，從小鼠血清血脂含量結果得出，TFA染毒組小鼠血清中的TG、TC、LDL-C含量明顯增高，而HDL-C的含量明顯下降；LP保護組的小鼠血清中的TG、TC、LDL-C含量較之降低，HDL-C的含量較之升高，表明機體內由于攝入過量的反式脂肪酸導致脂質堆積，影響了血脂中的正常含量［4］，而番茄紅素可以改善小鼠血脂水平，對此產生的疾病風險具有修復調節(jié)的作用。

氧化作用是生物在有氧呼吸過程中出現(xiàn)的一種生理活動，會產生活性氧（ROS），人體腎臟系統(tǒng)中也會存在一定濃度的活性氧。而MDA是反應機體氧化損傷最具代表性的指標，可以反映細胞的受損傷活動；SOD活力的高低間接反應了機體清除氧自由基的能力；GSHPx可以抑制自由基的生成反應。國內外研究表明，反式脂肪酸可使染毒動物抗氧化酶活性下降，脂質過氧化產物MDA增高，認為反式脂肪酸具有誘導機體產生自由基的能力［5］。本次研究結果顯示，TFA染毒組較對照組而言，SOD、GSH-Px活性下降，MDA含量升高；而各劑量LP保護組較TFA染毒組而言，SOD、GSH-Px活性有所升高，MDA含量有所下降，雖低于或高于TFA染毒組，但是仍未恢復至正常含量。說明番茄紅素對反式脂肪酸所導致的毒性作用具有保護和修復抗氧化能力，抑制了自由基的生成［6］，減少了反式脂肪酸對小鼠腎臟所帶來的氧化損害。

綜上所述，攝入過量的反式脂肪酸可引起腎臟系統(tǒng)的損傷，而番茄紅素可抑制反式脂肪酸所引起的氧化應激反應，保護腎功能的正常形態(tài)，修復腎臟系統(tǒng)產生的損傷，其機制可能與番茄紅素能減少或終止腎臟組織中的脂質過氧化反應，具有清除氧自由基的作用有關。此次實驗也為番茄紅素對反式脂肪酸致腎臟損傷的修復提供了重要的參考依據。

［1］ 畢凌瀟. 中國市售食品中反式脂肪酸含量的現(xiàn)狀研究［J］. 食品安全導刊.2016.24： 047.

［2］ 謝明勇, 謝建華, 楊美艷, 等. 反式脂肪酸研究進展［J］. 中國食品學報.2010.10(4)： 014-026.

［3］ 陳錦瑤. 番茄紅素的生物學作用及應用研究進展［J］. 衛(wèi)生研究. 2013.42(2)： 0336-0342.

［4］ 劉董斌, 王瑞, 劉清國, 等. 不同含量反式脂肪酸飲食對小鼠肝臟氧化應激及PPARγ表達的影響［J］. 營養(yǎng)學報.2013.31(5)：435-439.

［5］ laszezykl, Grueka-MamczarE, KasPerezyk S, et al. Influence of methionine upon the activity of antioxidative enzymes in thekidney of rats exposed to sodium fiuoride［J］. Biol Trace ElemRes.2010.133(l)：60-70.

［6］ 韋莉荔, 陳薇, 陳蓮香. 番茄紅素抗氧化活性藥理作用研究進展.［R］. 中國傷殘醫(yī)學.2014.22(8)： 297-298.

Repaireffect of Lycopeneon trans fatty acidsinduced renal injury in mice

Ding Xu, Xie Xian, Liu Juan, Yao Ming-yan, Zhu Le-mei
(School of Public Health, Changsha 410219, China)

ObjectiveTo discuss the repairing effect of lycopene (LP) on kidney injury of mice caused by Trans fatty acid (TFA).Methods40 healthy SPF mice were randomly divided into the normal control group, TFA exposure group, TFA exposure + low dose LP protection group, TFA exposure + medium dose LP protection group and TFA exposure + high dose LP protection group, with 8 mice in each group (half males and half females). Normal saline was given by gavage in the morning in the control group; other groups were given TFA 50mg/kg. bw by gavage; in the afternoon, LP protection groups of different doses were separately given LP 5mg/kg. bw, 10mg/kg. bw, 20mg/kg. bw by gavage one every other day. After 8 weeks, the growth condition of mice was closely observed and the kidney sample was taken out for pathomorphology observation; blood samples were collected for detections of serum urea (UREA), creatinine (CREA), uric acid (UA), triglycerides (TG), total cholesterol (TC), high-density lipoprotein (HDL - C), low density lipoprotein (LDL-C) and determination of kidney tissue malondialdehyde (MDA) content and kidney superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (gsh-px) activity.Resultscomparing with the control group, the weight, kidney organ coefficient, UREA, CREA, TG, TC, LDL-C and MDA content in the serum of mice of TFA exposure group increased and the differences had statistical significance; UA, HDL-C content decreased and SOD, GSH-Px activity decreasedand the differences had statistical significance; and morphological lesion can be seen in the kidney tissue. Comparing with TFA exposure group, the weight, kidney organ coefficient, UREA, CREA, TG, TC, LDL-C and MDA content in the serum of mice of TFA exposure + low, medium and high LP protection group decreased and the differences had statistical significance; UA, HDL-C content increased and SOD, GSH-Px activity increased and the differences had statistical significance; with theincrease of LP dose, the structure of kidney tissue went back to normal and the pathological change improved evidently.Conclusionlycopene can repair kidney injury caused by Trans fatty acid and has protection effect on kidney function.

lycopene; trans fatty acid; renal injury; repair

R285.5

A

1673-016X（2017）05-0008-05

2017-04-20

2014年地方高校國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目基金（201410823003）；湖南省大學生研究性學習和創(chuàng)新性實驗計劃項目（543）

朱樂玫，E-mail：zhulemei@qq.com