乳樂沖劑對乳腺增生大鼠乳腺組織、性激素及其受體表達(dá)的影響

趙嫻，候咪，喬迪

?

乳樂沖劑對乳腺增生大鼠乳腺組織、性激素及其受體表達(dá)的影響

趙嫻1，候咪2，喬迪3

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽 712046；2.延安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西延安 716000； 3.臨汾市中心醫(yī)院，山西臨汾 041000

觀察乳樂沖劑對乳腺增生大鼠乳腺組織病理學(xué)、卵巢性激素及其受體表達(dá)的影響，探討其作用機制。采用肌注苯甲酸雌二醇20 d，再肌注黃體酮5 d建立乳腺增生模型。將66只雌性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、針刺組和中藥高、中、低劑量組，每組11只。針刺組選取甲組穴“屋翳”“合谷”（均雙側(cè)）、“膻中”，乙組穴“天宗”“肝俞”“足三里”（均雙側(cè)），2組穴位交替使用，1組/d；中藥各劑量組給予1.1、0.55、0.11 g/mL乳樂沖劑灌胃，1次/d。各組均連續(xù)治療30 d后腹主動脈采血，ELISA檢測血清雌二醇（E2）、孕激素（P）含量；同時切除第2對左側(cè)乳房，光鏡下觀察乳腺組織變化，免疫組化檢測乳腺組織雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）陽性表達(dá)。與空白組比較，模型組大鼠乳腺組織增生明顯，血清E2含量和ER、PR陽性表達(dá)積分顯著升高（＜0.01），P含量顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各治療組大鼠乳腺組織增生均有改善，E2含量和ER、PR陽性表達(dá)積分均顯著降低（＜0.05），針刺組P含量顯著升高（＜0.01），且以針刺組和中藥低劑量組作用最為明顯。乳樂沖劑可有效改善外源性雌激素、P所致大鼠乳腺增生組織結(jié)構(gòu)，其機制與降低血清E2含量和乳腺組織ER、PR陽性表達(dá)積分，升高血清P含量有關(guān)。

乳腺增生??；乳樂沖劑；針刺；激素水平；受體；大鼠

乳腺增生（mammary glands hyperplasia，MGH）是一種既非炎癥又非腫瘤的乳腺疾病，是乳腺實質(zhì)的良性增生，居乳腺病首位，目前臨床對MGH尚無特效療法。國醫(yī)大師郭誠杰教授及其學(xué)術(shù)傳承人于20世紀(jì)70年代開始循序漸進(jìn)開展了針刺治療MGH的系列臨床及實驗研究，并取得可靠療效[1-3]。郭老治療MGH除采用針刺治療外，常配合自創(chuàng)乳樂沖劑口服。為更全面整理、傳承郭老治療MGH的經(jīng)驗，本研究聚焦乳樂沖劑對MGH的治療作用，通過觀察其對MGH大鼠性激素、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)物質(zhì)、乳腺組織病理改變的影響，探討其治療MGH的療效和作用機制，為篩選更有效的針?biāo)幗Y(jié)合治療方案，以及研究開發(fā)治療MGH的新藥提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級SD大鼠雌性未孕66只，80～90日齡，體質(zhì)量（200±20）g，西安交通大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號SCXK（陜）2012-003。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心清潔級動物實驗房，室溫20～25 ℃，相對濕度40%～70%，通風(fēng)良好，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物

乳樂沖劑（當(dāng)歸10 g，白芍10 g，柴胡9 g，茯苓10 g，青皮9 g，香附9 g，延胡索9 g，莪術(shù)9 g，昆布15 g，黃芪15 g，淫羊藿12 g），陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥劑實驗室制備。苯甲酸雌二醇注射液，杭州動物藥品廠，批號130522；黃體酮注射液，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號130413。

1.3 主要試劑與儀器

蘇木素、伊紅，雌二醇（E2）、孕激素（P）、ELISA試劑盒和一抗，武漢博士德生物工程有限公司。DIGITAL CAMERADXM 1200正置顯微鏡（日本Nikon），TL-4型臺式離心機（湖南儀器儀表總廠），SHHW21.60A11型恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠），ZT-12J自動脫水機器（孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司），JB-L6包埋機、切片機（武漢俊杰電子有限公司），自動酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD，型號MODEL5500），Motic images Advanced 3.0圖像采集分析系統(tǒng)（Nikon DIGITAL CAMERADXM1200F）。0.35 mm×25 mm華佗牌一次性無菌針灸針（江蘇醫(yī)療用品廠有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組

動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機區(qū)組分層抽樣法分為空白組、模型組、針刺組和中藥低、中、高劑量組，每組11只。中藥低、中、高劑量組按動物與人臨床用藥量換算分別給藥0.11、0.55、1.1 g/mL。

2.2 造模

參考文獻(xiàn)[1，4]方法造模。大鼠后肢外側(cè)肌注苯甲酸雌二醇0.5 mg/（kg?次），1次/d，連續(xù)20 d，繼而肌注黃體酮5 mg/（kg?次），1次/d，連續(xù)5 d?？瞻捉M大鼠后肢外側(cè)同法肌注等量0.9%NaCl溶液，1次/d，連續(xù)25 d。造模后，模型大鼠出現(xiàn)毛色干枯、攝食減少、易激惹、體質(zhì)量增加緩慢甚至出現(xiàn)停滯等現(xiàn)象，肉眼觀察其乳頭高度明顯高于空白組。從中隨機選擇3只，做常規(guī)病理切片檢查，光鏡下見乳腺小葉數(shù)增多，小葉腺泡密集、數(shù)目增多、彌漫增生、乳腺腺泡和導(dǎo)管大量增生，腺泡腔明顯擴張，導(dǎo)管上皮增生明顯，說明造模成功。

2.3 干預(yù)

針刺組和中藥各劑量組從造模成功后第1日起施以相應(yīng)治療措施，共30 d。針刺組參考《實驗針灸學(xué)》[5]，以比較解剖和骨度分寸法為依據(jù)選穴。所選穴位分2組，甲組取“屋翳”“合谷”（均雙側(cè)）、“膻中”，乙組取“天宗”“肝俞”“足三里”（均雙側(cè)）。針刺選用0.35 mm×25 mm毫針，常規(guī)消毒后，向外下斜刺“天宗”，向下斜刺“肝俞”，直刺“足三里”，向后（尾側(cè)）平刺“膻中”，向外平刺“屋翳”，向掌直刺“合谷”，深度均為（2.0±0.2）mm；采用捻轉(zhuǎn)手法行針，前后捻轉(zhuǎn)各360°，左右來回為1次，每穴行針100次（約20～30 s），不留針。甲、乙組穴位交替使用，每日1組，1次/d。中藥各劑量組按15 mL/kg體質(zhì)量給藥，1次/d，3 mL/次。在施以相應(yīng)治療措施的同時，空白組、模型組和中藥各劑量組均采用針刺組同法進(jìn)行抓取固定30 s，空白組、模型組和針刺組灌服等量蒸餾水，均為1次/d。

2.4 標(biāo)本采集及檢測

末次治療后，禁食24 h。8%硫化鈉大鼠乳房周圍脫毛。腹主動脈采血，2000 r/min離心15 min，取血清，置于-70 ℃冰箱保存，按ELISA試劑盒說明書操作，同批檢測血清E2、P含量。完整剝離并取下第2對左側(cè)乳房，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片（4 μm厚），HE染色，免疫組化檢測大鼠乳腺組織雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）表達(dá)情況并計算其陽性積分。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[6]方法并加以改良。鏡下觀察細(xì)胞染色情況，評估染色范圍和程度。高倍視野（×40）下計算200個細(xì)胞，統(tǒng)計陽性細(xì)胞的百分比，≤25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分別計1、2、3、4分；著色強度按陽性細(xì)胞著色無、弱（淡黃）、中（棕黃）、強（棕褐）分別計0、1、2、3分。每張切片隨機取5個視野（×400），每個視野均進(jìn)行陽性細(xì)胞百分比計分與著色強度計分，二者相加作為陽性表達(dá)積分。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 不同干預(yù)措施對模型大鼠乳腺組織形態(tài)的影響

空白組乳腺小葉未見增生，腺泡數(shù)量少，腺體大部分處于靜止?fàn)顟B(tài)，腺上皮細(xì)胞排列密集、大小較均勻，腔內(nèi)未見明顯分泌物；模型組乳腺小葉明顯增生，大部分腺泡及部分導(dǎo)管呈擴張或極度擴張狀態(tài)，且充滿分泌物，排列較疏松，大小變化明顯；各治療組病理變化較模型組有所改善，乳腺小葉可見增生，與模型組比較，腺泡數(shù)量明顯減少，導(dǎo)管擴張明顯減輕，腔內(nèi)有少量分泌物及脫落細(xì)胞，排列較緊密，細(xì)胞大小變化不明顯。結(jié)果見圖1。

4.2 不同干預(yù)措施對模型大鼠血清雌二醇和孕激素水平的影響

與空白組比較，模型組E2水平顯著升高、P水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各治療組E2水平顯著降低（＜0.05），針刺組P水平顯著升高（＜0.01），中藥各劑量組P水平有所上升；與針刺組比較，中藥高劑量組E2水平顯著升高（＜0.05），中藥各劑量組P水平顯著降低（＜0.05）；且中藥各劑量組間比較，以中藥低劑量組療效最佳。結(jié)果見表1。

圖1 各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)（HE染色，×200）

表1 各組大鼠血清E2和P水平比較（±s）

注：與空白組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01； 與針刺組比較，▲＜0.05；與中藥高劑量組比較，△＜0.05（下同）

4.3 不同干預(yù)措施對模型大鼠雌激素受體和孕激素受體陽性表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組ER、PR表達(dá)積分均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各治療組ER、PR表達(dá)積分均顯著下降（＜0.05）；與針刺組比較，中藥高劑量組ER顯著升高（＜0.05），中藥各劑量組PR均有所上升；中藥各劑量組間比較，以中藥低劑量組療效最佳，見表2。大鼠乳腺組織ER、PR為核表達(dá)或漿表達(dá)，腺導(dǎo)管和小葉上皮細(xì)胞核和或細(xì)胞漿著色時為陽性。與空白組比較，模型組大鼠乳腺組織ER、PR染色范圍廣、著色更深，表達(dá)明顯增強，針刺組和中藥各劑量組大鼠乳腺組織ER、PR表達(dá)均較模型組降低，針刺組和中藥低劑量組ER、PR表達(dá)更接近空白組。結(jié)果見圖2、圖3。

表2 各組大鼠乳腺組織ER、PR陽性表達(dá)比較（±s，分）

圖2 各組大鼠乳腺組織ER陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖3 各組大鼠乳腺組織PR陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

5 討論

經(jīng)過長期大量的臨床診療實踐，郭老對MGH的病因病機和治法有著系統(tǒng)的認(rèn)識。他認(rèn)為，肝氣郁滯、沖任失調(diào)是本病的病理基礎(chǔ)，而乳絡(luò)不通是其病機關(guān)鍵，治療當(dāng)以“通”“調(diào)”為要，“通”以行乳絡(luò)、暢氣血、化痰瘀、消乳塊，“調(diào)”臟腑、“調(diào)”沖任，臟腑平衡，沖任和調(diào)。郭老自創(chuàng)的乳樂沖劑組方正是基于這樣的認(rèn)識。該方由當(dāng)歸、白芍、柴胡、茯苓、青皮、香附、延胡索、莪術(shù)、昆布、黃芪、淫羊藿11味藥組成，為疏肝理氣、化痰軟堅、活血止痛之劑。方中柴胡辛散疏肝解郁為君，“肝欲散，急食辛以散之”；配以當(dāng)歸、白芍共為臣藥，養(yǎng)血柔肝，緩肝之急，君臣相配，補肝體，助肝用，以疏達(dá)肝氣；佐以香附、青皮疏肝解郁，調(diào)暢氣機；延胡索行氣活血止痛；淫羊藿補腎壯陽，溫陽化濕；昆布消痰軟堅、緩消癥塊；莪術(shù)破血祛瘀，行氣止痛；茯苓、炙甘草益氣健脾，實脾土以御肝乘，共為佐藥。諸藥合用，共奏行氣活血、消痰化濕、軟堅散結(jié)，消散乳中結(jié)塊之效。

本研究選取觀測指標(biāo)為乳腺病理組織形態(tài)、血清E2、P含量及ER、PR的表達(dá)積分。MGH雖發(fā)于局部，但其實質(zhì)是機體整體功能失調(diào)的反映，E2刺激腺管增生，P則促進(jìn)乳腺腺泡的發(fā)育和增生[7]。E2相對或絕對升高、P分泌相對或絕對減少、E2/P比例失調(diào)，使乳腺實質(zhì)增生過度或復(fù)舊不全，致乳腺導(dǎo)管與小葉及周圍結(jié)締組織的細(xì)胞增生，是該病發(fā)生的重要原因。E2、P通過ER、PR對乳腺組織發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，激素水平越高，其受體表達(dá)越明顯[8]。MGH的發(fā)生還與乳腺組織局部對E2的敏感性不同有關(guān)，乳腺組織ER、PR水平及乳腺組織自身敏感性的升高起著重要作用。有學(xué)者認(rèn)為，局部乳腺組織ER增加，致使組織對E2的敏感性增強也可能是導(dǎo)致乳腺組織增生的重要因素之一[9]。大量研究表明，MGH乳腺組織ER表達(dá)均高于正常人，且乳腺增生程度與ER陽性程度呈正相關(guān)。而E2具有刺激ER、PR合成的作用，ER、PR可隨血液中E2濃度的增加而增加；含量下降的P會使細(xì)胞內(nèi)PR含量下降；當(dāng)E2水平高于P水平時，細(xì)胞內(nèi)ER、PR會處于較高的水平，反之PR含量則下降。E2與P相互協(xié)同，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)PR含量，結(jié)果是明顯升高的E2導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ER、PR含量明顯增加[10]。故對MGH治療的關(guān)鍵正是調(diào)整垂體-性腺的激素分泌，糾正激素水平紊亂或調(diào)節(jié)激素作用的靶點[11]。

本實驗結(jié)果顯示，中藥各劑量組均對MGH大鼠性激素有良性調(diào)節(jié)作用，可使升高的E2水平下降、降低的P水平升高，同時可以抑制其受體（ER、PR）的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)性激素水平、降低受體活性，達(dá)到抑制乳腺組織增生的療效。乳樂沖劑低劑量是臨床等倍劑量，其療效接近針刺治療，且具有更高的安全性。

[1] 郭新榮,張衛(wèi)華,李樹蘭.針刺對乳腺增生模型大鼠卵巢垂體軸性激素調(diào)節(jié)作用的影響[J].山東中醫(yī)雜志,2013,32(7)：485-486.

[2] 王孟琳,王婧錦,張衛(wèi)華,等.P16、P53在針刺乳腺增生模型大鼠乳腺組織的表達(dá)及意義[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2010,12(10)：10-12.

[3] 張衛(wèi)華,郭英民,郭新榮,等.針刺屋翳、乳根治療乳腺增生病1678例[J].陜西中醫(yī),2007,28(6)：714-716.

[4] 羅倫才,季小平,黃蘭雅,等.均勻設(shè)計法用于乳腺增生動物模型復(fù)制的研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(7)：204-206.

[5] 余曙光,郭義.實驗針灸學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2009：150- 152.

[6] 邢傳平,劉斌,董亮.免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果的判斷方法[J].中華病理學(xué)雜志,2001,30(4)：318.

[7] 沈宙鎮(zhèn),陸勁松,邵志敏.乳腺疾病綜合診斷學(xué)：附精選病例特征分析[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2012：11-12.

[8] 盧建余,應(yīng)年,徐仁寶.受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與疾病[M].濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社,2001：369-370,412-414.

[9] 王蘋,盧紅蓉,吳黎雅,等.50例不同證型乳腺增生病乳腺組織中雌激素受體及雌激素受體基因的表達(dá)[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2004, 24(6)：499.

[10] 張衛(wèi)華,趙嫻,郭新榮.針刺對MGH模型大鼠乳腺組織雌孕激素受體的影響[J].陜西中醫(yī),2008,29(7)：909-910.

[11] 李朝平,崔海峰.通乳散癖湯對乳腺增生模型大鼠血清P含量和乳腺組織PR表達(dá)的影響[J].甘肅中醫(yī),2012,22(5)：70-71.

Effects ofGranules on Breast Tissue, Sex Hormones and Receptor Expression of Mammary Glands Hyperplasia Rats

ZHAO Xian1, HOU Mi2, QIAO Di3

To observe the effect ofGranules on the breast tissue pathology, ovarian hormone and receptor expression of mammary glands hyperplasia rats; To explore its mechanism of action.The model of mammary gland hyperplasia was established by intramuscular injection of estradiol benzoate for 20 days and intramuscular injection of progesterone for 5 d. 66 female SD rats were randomly divided into 6 groups, including blank group, model group, acupuncture group, TCM high-, medium- and low-dose groups, with 11 rats in each group. Acupuncture group chose group A (Wuyi, Hegu, on both sides, Tanzhong) and group B (Tianzong, Ganshu, Zusanli, on both sides), and the two groups were used alternately, one group per day. TCM groups received 1.1 g/mL, 0.55 g/mL, and 0.11 g/mL dose ofGranules for gavage, once a day. Abdominal aorta blood was collected after continuous treatment of 30 d. The contents of serum E2and P were detected through ELISA method, at the same time, the second left side of the breast was removed. The changes of the breast tissue was observed under light microscope, and the ER and PR positive expression was observed by SABC immunohistochemical method.Compared with the blank group, hyperplasia of mammary gland in the model group rats was more obvious, and serum E2, ER and PR positive expression of integral increased significantly (<0.01), but the content of P decreased significantly (<0.01); compared with the model group, hyperplasia of mammary gland was improved in all treatment groups, and serum E2, ER and PR positive expression of integral decreased significantly (<0.05); the content of P in acupuncture group increased significantly (<0.01), and the acupunture group and TCM low-dose group were the most obvious.Granules can effectively improve hyperplasia of mammary gland organization structure in rats caused by exogenous estrogen and progesterone, with TCM low-dose group and acupuncture group having the best efficacy. Its mechanism is related to reducing the contents of serum E2and ER, and PR positive expression in breast tissue, and increasing the content of serum P.

hyperplasia of mammary gland;Granules;acupuncture; hormone level;receptors; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.012

R285.5；R245

A

1005-5304(2017)11-0048-05

（2017-02-24）

（2017-03-30；編輯：華強）

國家自然科學(xué)基金面上項目（81473782）；陜西省中醫(yī)管理局資助項目（13-LC068）