商陸PaHAK1與擬南芥HAK/KUP/KT家族基因的比較分析

譚鵬，鄧雯韜，田宇，蘇益，藺萬煌*

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商陸與擬南芥//家族基因的比較分析

譚鵬1,2，鄧雯韜1,2，田宇1,2，蘇益1,2，藺萬煌1,2*

(1.湖南農業(yè)大學植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；2.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙 410128)

為探明商陸高親和性K+轉運體基因()的結構、功能及商陸耐低鉀的原因，分析比較了商陸和擬南芥家族基因中15個基因編碼的高親和性鉀離子轉運體氨基酸序列、蛋白質結構及其理化性質。結果表明：基因家族編碼蛋白均定位于細胞膜上，含有多個跨膜結構且跨膜結構域是蛋白質的保守結構域；PaHAK1與AtKUP3的跨膜結構十分相似，低鉀脅迫下和的高表達與其高親和鉀轉運吸收功能密切相關。系統(tǒng)進化樹分析結果表明，PaHAK1與擬南芥基因家族中AtKUP8親緣關系最近，其氨基酸序列相似度為76.98%，推測還可能通過維持細胞內高水平鉀量在水分脅迫下發(fā)揮重要的調節(jié)作用。

商陸；擬南芥；；；高親和性鉀離子轉運體；生物信息學分析

鉀離子對植物的生長發(fā)育及維持細胞滲透壓有重要作用。中國土壤和作物中的鉀素含量普遍偏低[1–2]。利用已獲得的K+吸收轉運相關基因，可以改善作物的鉀素營養(yǎng)性狀，提高對環(huán)境中鉀素的利用率[3]。嚴蔚東等[4]在利用異源基因資源改良作物鉀素營養(yǎng)特性領域進行了探索，其將和導入水稻，獲得的轉基因植株在低鉀和高鉀條件下的鉀累積能力都有所提高。GUPTA等[5]從水稻中克隆到27個鉀轉運體家族基因，為通過基因工程的方法提高作物中這些基因的表達水平和改良鉀營養(yǎng)性狀打下了基礎。商陸(Roxb)吸收和富集鉀的能力非常突出，特定環(huán)境中其含鉀量最高可達到植株干物質質量的10%以上，又能在K+濃度極低(微摩爾水平)的土壤中正常生長發(fā)育[6]。為深入探討商陸基因功能，本研究中將獲得的商陸基因與擬南芥家族基因進行比較分析，旨在揭示商陸鉀素高效吸收轉運的分子機制，利用商陸高親和性K+吸收轉運基因進行作物鉀素營養(yǎng)性狀遺傳改良，現將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1　商陸HAK1及擬南芥HAK/KUP/KT基因家族基因的獲得

商陸基因由湖南農業(yè)大學植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室克隆并提供相關信息[7]。擬南芥基因家族的mRNA序列以及編碼的蛋白質序列從NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/)獲得。

1.2　擬南芥HAK/KUP/KT基因家族染色體定位及基因結構分析

從NCBI中獲取染色體定位信息，利用MapDraw V 2.1進行染色體定位作圖。

1.3　商陸HAK1及擬南芥HAK/KUP/KT基因家族基因蛋白質序列生物信息學分析

采用在線工具Protparam(http://web.expasy.org/ protparam/)對商陸及擬南芥基因編碼蛋白的理化性質進行分析預測，預測蛋白質的氨基酸序列、數量、等電點、分子量[8]。亞細胞定位采用在線軟件PSORT(http://www.genscript. com/tools/psort/)進行預測。應用結構域在線分析軟件SMART(http://smart.embl.de/)對保守結構域進行驗證和功能注釋?？缒そY構采用在線軟件TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM–2.0/)進行分析。蛋白跨膜結構模型采用PROTTER(http://wlab. ethz.ch/protter/start/)建立[9]。

1.4　商陸HAK1及擬南芥HAK/KUP/KT基因家族基因系統(tǒng)進化樹的構建

使用Clustal X 軟件對擬南芥中已知的15個基因家族蛋白及商陸基因編碼蛋白進行氨基酸序列比對，比對結果通過MEGA6軟件生成進化樹。進化樹的構建采用最大簡約法(maximum parsimony，MP)，Bootstrap值設置為1 000[10]。

2　結果與分析

2.1　HAK/KUP/KT家族基因染色體定位及基因結構分析

從表1可以看出，所有基因都包含6個以上的內含子，其長度表現出較大差異，外顯子數不同，因此擬南芥基因家族基因的結構存在較大差異。對已獲取的基因信息利用MapDraw V 2.1進行染色體定位作圖，結果(圖1)表明，基因家族在擬南芥1~5號染色體上均有分布，其中，4號染色體有6個基因家族基因，2號染色體有4個，1號和5號染色體各有2個，3號染色體上只有1個。

表1　擬南芥HAK鉀離子轉運體基因的基本信息及結構

圖1　擬南芥HAK/KUP/KT基因家族染色體定位

2.2　HAK/KUP/KT基因編碼蛋白的理化性質分析

基因編碼蛋白的基本理化性質以及亞細胞定位見表2。PSORT預測結果顯示，編碼一個含有771個氨基酸的蛋白，其分子式為C3980H6199N1003O1092S34，分子量為86 662.11，等電點為7.54，包含帶正電殘基(Arg + Lys)72個，帶負電殘基(Asp + Glu)71個。進一步分析得到該蛋白的不穩(wěn)定系數為38.46，脂肪系數為107.94，說明編碼蛋白為穩(wěn)定蛋白，且在不同環(huán)境中穩(wěn)定性較好；平均親水性系數為0.269，大于0，說明該蛋白屬于疏水蛋白?；蚓幋a蛋白的氨基酸殘基數為593~880，最長的KT5含有880個氨基酸殘基，最短的KUP1只含有592個氨基酸殘基?；蚣易宕蠖鄶档鞍踪|都屬于疏水蛋白，只有KT1、KT2/3和KT5為親水性蛋白。擬南芥基因家族中有9個蛋白質穩(wěn)定性好，只有KT2、KT3、KUP3、KUP6、KUP7、KUP10在不同環(huán)境中穩(wěn)定性較差。

表2　HAK/KUP/KT基因編碼蛋白的基本理化性質分析

2.3　HAK/KUP/KT基因編碼蛋白結構域分析

采用SMART和TMHMM預測基因編碼蛋白的保守結構域及跨膜結構域的結果(圖2)表明，商陸和擬南芥基因家族成員的蛋白含有多個跨膜結構，除以外，其他的成員都只有跨膜結構。對比保守結構域和跨膜結構域可以看出，商陸以及擬南芥基因家族中的跨膜結構是蛋白保守結構。

保守結構域中藍色示跨膜結構(transmembrane region)；黃色cNMP示與蛋白質結合的環(huán)核苷酸(cyclic nucleotide–monophosphate binding domain)；綠色ANK示錨定蛋白重復序列(ankyrin repeats)；紫色示低復雜性區(qū)域(low complexity region)?？缒そY構域中紅色示跨膜結構(transmembrane region)；藍色示細胞內(intracellular)；紫色示細胞外(extracellular)。

2.4 HAK/KUP/KT基因編碼蛋白跨膜結構模型

對基因編碼蛋白的跨膜結構預測分析結果(圖3)顯示，不同蛋白跨膜次數有一定差異，但結構類似。16個HAK蛋白跨膜結構可初步分為3種模型：第1種模型，在第2和第3個跨膜區(qū)之間擁有一個較長的環(huán)狀結構(圖3–A)，共有11個蛋白具有這種結構；第2種模型，在第1和第2個跨膜區(qū)之間擁有一個較長的環(huán)狀結構(圖3–B)，PaHAK1和AtKUP3屬于此種模型；第3種模型，沒有明顯的環(huán)狀結構(圖3–C)，AtKT2/3、AtKUP1屬于此種模型。

2.5　HAK/KUP/KT基因編碼蛋白系統(tǒng)進化樹分析

采用鄰接法和最小進化法構建的系統(tǒng)進化樹具有一樣的拓撲結構，最大簡約法構建的系統(tǒng)樹也具有類似的拓撲結構，但由于Bootstrap值有的低于70，所以采用了最大似然法(maximum likelihood，ML)構建系統(tǒng)進化樹(圖4)由圖4可知，Bootstrap的值都大于70%，構建的進化樹可靠。

進化樹分析結果表明，PaHAK1與AtKUP8、AtKUP6親緣關系最近，其氨基酸序列相似度分別為76.98%、73.15%。從結構域預測發(fā)現PaHAK1和AtKUP8蛋白結構也相似。PaHAK1與AtKT1、AtKT2–3、AtKT5親緣關系比較遠，從序列比對結果看相似度均小于15%。

圖4 擬南芥及商陸鉀離子轉運體蛋白的系統(tǒng)進化樹

3　結論與討論

基因家族是H+/K+同向轉運載體，主要負責植物根部細胞對K+的高親和吸收與轉運[11–13]，作為最大的K+吸收與轉運功能基因家族，基因家族已被證實參與調控植物體多種生理過程。前人的研究結果顯示，的關鍵作用是介導細胞內鉀離子的積累[14]。基因除了在植物根中表達外，在植物其他器官中都有特定表達，這表明K+轉運體基因不僅在根中介導K+吸收，同時也與植物體內K+的轉運、維持細胞內外K+動態(tài)平衡相關[15]。在外界環(huán)境K+濃度較低時，在介導擬南芥根部吸收與轉運K+的過程中發(fā)揮著重要的作用。具有雙親和K+轉運功能；基因是低親和K+轉運體基因，可以參與調控細胞的伸長和生長[16]；基因在根毛細胞中有特異表達，可以調節(jié)擬南芥根部K+的吸收，缺失該基因會使植物根系喪失向下生長的特性[17]。本研究結果表明，PaHAK1氨基酸序列與AtKUP8同源性非常高，KUP6和KUP8參與擬南芥根系鉀離子外流、平衡鉀穩(wěn)態(tài)，對細胞生長和干旱脅迫反應中的滲透調節(jié)起關鍵作用[18]。由此推測PaHAK1是通過平衡鉀穩(wěn)態(tài)對水分脅迫、干旱脅迫發(fā)揮滲透調節(jié)作用。

本研究結果表明，商陸PaHAK1是一個疏水蛋白，含有11個跨膜結構域，具有鉀離子吸收轉運體的普遍特征。商陸耐低鉀能力強，這與植物在低鉀條件下的強吸鉀能力密不可分。是高親和性鉀轉運體，基因的表達受到鉀離子濃度的影響, 隨著鉀離子濃度升高, 其表達量降低, 缺鉀和低鉀都能誘導基因在根中高表達[19]。有研究[7]表明，商陸中在根中的表達量受環(huán)境中鉀離子濃度的影響，環(huán)境中鉀離子濃度低時能誘導的高表達。另外，在商陸的莖葉中也有少量表達，其在莖葉中的表達量不會因為環(huán)境中的鉀離子濃度變化而變化，因此推測主要參與商陸根部鉀離子的吸收、轉運。

本研究結果表明，PaHAK1與AtKUP3的跨膜結構十分相似，在第1個跨膜結構與第2個的跨膜結構之間有一個比較長的非結構域部分，這一部分會形成一個較長的環(huán)狀結構，這與其他的擬南芥基因家族蛋白結構的第2和第3個跨膜結構之間有環(huán)狀結構不同。KIM等[20]的研究結果表明，在受到低鉀脅迫時，在根中的表達量轉錄水平顯著升高，推測在低鉀脅迫下商陸和擬南芥的高表達與其高親和鉀轉運吸收功能相關。

植物根系對植物獲取環(huán)境中的K+起決定性作用。商陸能夠在低鉀的條件下正常生長發(fā)育與鉀離子轉運體基因相關。在商陸根部能高表達，且具有高效的K+吸收轉運機制。在根中的表達量受環(huán)境中鉀離子濃度的影響，環(huán)境中K+濃度低時能誘導的高表達，并介導對K+的高效吸收與轉運。

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責任編輯：尹小紅

英文編輯：梁和

Comparative analysis ofgene family inandin

TAN Peng1,2, DENG Wentao1,2, TIAN Yu1,2, SU Yi1,2, LIN Wanhuang1,2*

(1.Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Changsha 410128, China)

In order to explore the structure and function of the high affinity potassium transporter gene ofRoxb() and analyze the reasons of toleranceto low potassium inRoxb, the amino acid sequences and protein structures and physicochemical properties of 15 high affinity potassium ion transporters ingene family ofandofRoxb were comparedThe results showed that all coding proteins were orientated on cell membrane, and they contained multiple transmembrane domain with conserve amino acid sequences. The transmembrane structure of PaHAK1 was very similar to that of AtKUP3, and the high expression ofandunder low potassium stress was closely related to the high affinity potassium transport and absorption function. Phylogenetic analysis showed that PaHAK1 had the closest evolutionary relationship with AtKUP8 ingene families. Their amino acid sequences similarity was 76.98%. It is suggested thatalso plays an important regulatory role under water stress by maintaining a high level of intracellular potassium.

Roxb;;;; high–affinity K+transporter; bioinformatics analysis

Q943.2

A

1007-1032(2017)05-0490-06

2017–04–10

2017–09–15

湖南省教育廳高校創(chuàng)新平臺開放基金資助項目(15K061)

譚鵬(1991—)，女，湖南望城人，碩士研究生，主要從事植物礦質營養(yǎng)學研究，695313374@qq.com；*通信作者，藺萬煌，博士，教授，主要從事植物生長發(fā)育與礦質營養(yǎng)學研究，linwhat@163.com

投稿網址：http://xb.hunau.edu.cn