毛竹PePGIP基因的克隆及表達(dá)分析

董南松 廖美振 婁永峰 肖復(fù)明

(1江西省植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330013；2安?？h陳山林場 江西安福 360830；3江西省林業(yè)科學(xué)院 南昌 330013)

毛竹PePGIP基因的克隆及表達(dá)分析

董南松1，2廖美振1，2婁永峰1，3肖復(fù)明1，3

(1江西省植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330013；2安福縣陳山林場 江西安福 360830；3江西省林業(yè)科學(xué)院 南昌 330013)

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白是一種重要的植物防御蛋白，在植物對真菌防御中發(fā)揮著重要作用。利用同源序列比對方法從毛竹 (Phyllostachys edulis)全長cDNA文庫中獲得1個PGIP同源基因序列(FP100022)，命名為PePGIP。該基因序列全長1370 bp，開放閱讀框1008 bp，編碼335個氨基酸，分子量為36.0 kDa。蛋白序列分析表明，該序列包含8個典型的亮氨酸重復(fù)序列，屬于植物胞外蛋白eLRR超家族。PePGIP與其他禾本科植物的PGIP均具有較高的同源性，聚類分析與來自二穗短柄草和水稻的PGIP聚在較近的分支。半定量RT－PCR分析結(jié)果表明，PePGIP在毛竹的根、莖、葉中均表達(dá)，且根中表達(dá)量最高。構(gòu)建pEASY－PePGIP原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了重組蛋白，分子量約為42 kDa。本研究為深入了解PePGIP的基因功能奠定了基礎(chǔ)。

毛竹；PGIP；克隆；表達(dá)分析

細(xì)胞壁是植物細(xì)胞防御病原真菌侵染的第1道防線，植物病原真菌在早期侵染中可分泌一系列酶來降解植物細(xì)胞壁[1]。多聚半乳糖醛酸酶 (PGs)是植物病原真菌侵染寄主時(shí)所分泌的第1個細(xì)胞壁降解酶，它可分解植物多聚半乳糖醛酸，降解植物細(xì)胞壁，這不僅使其他細(xì)胞壁降解酶對其底物的攻擊更容易，同時(shí)為病原真菌的生長和發(fā)育提供糖源[1－3]。研究表明，PGs是多種病原真菌的關(guān)鍵致病因子，而多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 (PGIPs)是植物中普遍存在的一種抗病蛋白，其能與病原真菌PGs特異性結(jié)合，從而部分抑制PGs的水解活性，阻止病原真菌的侵入和發(fā)展，同時(shí)可誘導(dǎo)植物體內(nèi)寡聚半乳糖醛酸的積累，激發(fā)特定的防御系統(tǒng)，增強(qiáng)植物的抗病性[4－6]。此外，PGIPs還參與植物的其他生理過程，例如花和果實(shí)的發(fā)育，抗凍性等[5，7－9]。 因此，PGIPs基因受到國內(nèi)外研究者的高度重視，并成為目前抗病蟲害基因工程及果實(shí)耐貯藏基因工程研究的焦點(diǎn)。

PGIPs屬于LRR蛋白家族，因?yàn)槠湟话阌?0個左右的不完整的富含亮氨酸重復(fù)序列 (LRR)組成，每個LRR由20～30個殘基組成，氨基酸序列通常為xxLxLxxNxLxGxIPxxLxxLxxL。LRR基序是與蛋白質(zhì)間相互作用的區(qū)域，PGIPs通過暴露于外表面的LRR基序殘基與PGs活性位點(diǎn)處的氨基酸殘基相互作用，從而抑制PGs的活性。此外，PGIPs分子中一般包含由24～29個氨基酸組成的信號肽，其參與PGIPs分子由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞間隙的轉(zhuǎn)運(yùn)[1，10]。

迄今為止， 已在水稻[6－7]、 小麥[9]、 蘋果[11]、黃瓜[12]、青花菜[13]等植物中克隆獲得了PGIPs基因，并在表達(dá)調(diào)控及轉(zhuǎn)基因等方面進(jìn)行了大量研究，但是在竹子中尚未見相關(guān)報(bào)道。竹子屬于禾本科(Poaceae)竹亞科 (Bambusoideae)植物，具有生長快、產(chǎn)量高、竹材強(qiáng)度大、纖維性能好等特性，在人類經(jīng)濟(jì)和生活環(huán)境中發(fā)揮著重要作用[14]。隨著對竹子價(jià)值的不斷開發(fā)，其應(yīng)用范圍越來越廣泛。然而，在栽培生產(chǎn)中，竹子因其生殖特性，一般容易形成大面積的竹子純林，加上溫暖、陰濕的生長環(huán)境，使得竹子容易遭受多種病蟲害的侵襲，其中由病原真菌誘發(fā)的竹稈銹病、竹煤污病等尤為嚴(yán)重，使竹子的生產(chǎn)受到很大威脅。因此，需要對竹子有關(guān)抗病性進(jìn)行研究。本研究以毛竹 (Phyllostachys edulis)為材料，獲得毛竹PGIP同源基因PePGIP，在充分分析該基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，研究其組織表達(dá)特異性及其原核表達(dá)，以期為今后基因功能的研究和通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗病竹子新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

毛竹新生的根、莖、葉等材料采自江西省林科院竹種園。材料置于－70℃保存，以備毛竹DNA及總RNA的提取。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA合成

利用 CTAB法提取毛竹葉片 DNA[15]。利用Invitrogen公司的Trizol reagent提取毛竹新鮮材料的總RNA，并根據(jù)大連TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法合成cDNA，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因克隆和序列分析

根據(jù)水稻OsPGIP1序列(AM180652)在毛竹全長cDNA文庫中查找同源基因序列。根據(jù)開放閱讀框 ORF區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物 PGIP-F:5'-ATGGCGTCGACCACCTCCTC-3'和 PGIP-R:5'-TCACAGCTGGTGGCACCCCT-3'。分別以毛竹基因組DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20 μL:10 × LA Buffer 2.0 μL， dNTPs Mixture(2.5 mM each)2.0 μL， 上下游引物 (10 μM) 各1.0 μL， 模板 1.0 μL， LA Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL)0.2 μL， 加水至總體積 20 μL。 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，60℃1 min，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后用Promega公司的膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α菌株。篩選陽性克隆，送上海生工進(jìn)行測序。最終獲得pMD19-PePGPI質(zhì)粒。

通過 DNAstar軟件對獲得的 cDNA序列進(jìn)行ORF的查找和蛋白質(zhì)翻譯等初步分析。在NCBI上對獲得的cDNA序列進(jìn)行Blast分析，將其推導(dǎo)的氨基酸序列與已知的PGIP蛋白在DNAMAN中進(jìn)行同源性比對分析，并通過MEGA 6.0軟件的Neighbor－Joining(N－J)方法進(jìn)行基于PGIP氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.4 PePGIP表達(dá)檢測

根據(jù)PePGIP基因的非保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物PGIPRT-F:5′-GTGGTAACAGCTCAAAGCTAGAAGG-3′和PGIP-RT-R:5′-GTCGGTAATCCAGGTACCATGTT-3′。以毛竹根、莖、葉的cDNA為模板，采用半定量RTPCR分析PePGIP基因的組織表達(dá)特異性。反應(yīng)體系如下:10 × PCR Buffer(Mg2＋plus)2.0 mL， dNTP Mixture(2.5 mM each)2.0 μL， PGIP-RT-F(10 μM)1.0 μL，PGIP-RT-R(10 μM)1.0 μL， cDNA 2.0 μL， rTaq(5 U/μL)0.2 μL，H2O 11.8 μL。 反應(yīng)過程:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min，25個循環(huán)；72℃延伸，10 min。

1.5 PePGIP原核表達(dá)

利用PGIP-F和PGIP-R引物，以pMD19-PeGPIG質(zhì)粒為模板，用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。獲得PCR產(chǎn)物與北京全式金生物公司的pEASY-Blunt E1表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，利用T7 promoter引物和PGIP-R引物篩選正確表達(dá)方向的陽性克隆，然后經(jīng)測序確認(rèn)。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEASY-PePGIP轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌種BL21(DE3)菌株中，通過菌液PCR篩選獲得陽性克隆。然后將其按1∶100的比例接種到新的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.6～1.0時(shí)，加入0.4 mM IPTG誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后，離心收集少量菌體2 mL，加入200 μL的PSB緩沖液，沸水加熱5 min，裂解細(xì)胞。然后加入SDS-PAGE上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 PePGIP基因克隆及序列分析

通過同源序列查找，在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫獲得了與水稻OsPGIP1基因同源序列FP100022，該序列全長1 370 bp，其中5′UTR長64 bp，3′UTR長298 bp，ORF長1 008 bp，擬命名為PePGIP。分別以毛竹cDNA和基因組DNA為模板，PGIP-F和PGIP-R為引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果各獲得1條約1 000 bp的特異性條帶(圖1)。測序結(jié)果表明，獲得的2個片段大小均為1 008 bp，與FP100022的ORF區(qū)域完全一致，表明PePGIP基因沒有內(nèi)含子。

圖1 毛竹PGIP基因PCR擴(kuò)增

序列分析表明，PePGIP預(yù)測編碼含335個氨基酸的蛋白，蛋白質(zhì)分子量為36.01 kD，等電點(diǎn)6.79。BlastP分析結(jié)果表明，毛竹PePGIP基因所編碼的PePGIP蛋白序列與二穗短柄草和水稻的序列同源性較高，分別為62%和59%。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，PePGIP包含8個典型的LRR結(jié)構(gòu)域 (圖2)。

2.2 PGIP系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI網(wǎng)站下載水稻、小麥、擬南芥等不同物種的PGIP基因編碼的氨基酸序列，利用Clustal X進(jìn)行同源性比對，結(jié)果輸入，用N－J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 (圖3)。從圖3中可知，不同物種間PGIP序列保守性較強(qiáng)，同科同屬的植物相似度較高，單子葉植物與雙子葉植物分別聚在一起，分成2個大組。毛竹和二穗短柄草分成一組，同源關(guān)系最近。

2.3 PePGIP基因的表達(dá)分析

圖2 PePGIP中的LRR結(jié)構(gòu)域 (雙向箭頭)

以毛竹PeActin基因?yàn)閮?nèi)參基因，以克隆的毛竹PePGIP基因序列特異性設(shè)計(jì)引物，對該基因在毛竹根、莖、葉等不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行半定量RT-PCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，在根中表達(dá)量最高，莖中表達(dá)較低，說明該基因表達(dá)具有組織特異性(圖4)。

2.4 PePGIP基因原核表達(dá)分析

圖3 基于PGIP基因編碼氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 PePGIP在毛竹根、莖、葉中的RT-PCR分析

利用北京全式金生物公司的pEASY-Blunt E1 Expression Kit構(gòu)建了PePGIP的原核表達(dá)載體pEASY-PePGIP，并將其轉(zhuǎn)化在BL21(DE3)中進(jìn)行了重組蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，經(jīng)0.4 mM IPTG誘導(dǎo)后，含有載體pEASY-PePGIP的表達(dá)產(chǎn)物約在42 kDa處有一個明顯的蛋白條帶，包括載體自身表達(dá)蛋白約5.08 kDa和目的基因編碼蛋白約36.0 kDa，這與預(yù)測的PePGIP表達(dá)融合蛋白分子量大小一致，而轉(zhuǎn)化空載體的菌株未見相應(yīng)蛋白表達(dá)。然而PePGIP在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)產(chǎn)物主要包涵體的形式出現(xiàn)，可溶性蛋白很少(圖5)。

3 討論

本研究從毛竹中克隆了1個新的PGIP基因，即PePGIP，該基因ORF全長為1 008 bp，沒有內(nèi)含子，與黃瓜[12]等物種的PGIP基因相似。PePGIP基因編碼含335個氨基酸的蛋白質(zhì)，蛋白序列分析結(jié)果顯示，PePGIP具有8個保守的LRR結(jié)構(gòu)域，屬于LRR蛋白家族。同源分析表明，PePGIP與來自禾本科植物二穗短柄草和水稻PGIP序列具有較高的同源性。

圖5 PePGIP原核表達(dá)載體構(gòu)建和原核表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

研究表明，PGIP基因在不同組織中的表達(dá)存在較大差異。在水稻不同組織或器官中，7個PGIP基因的表達(dá)模式各不相同，OsPGIP1和OsPGIP4在根、葉、花序中表達(dá)量較高表達(dá)，而OsPGIP3在這3個組織中表達(dá)量均很低，OsPGIP2主要在幼穗期的葉片以及根和葉鞘中表達(dá)，此外OsPGIP7在所有檢測的組織中表達(dá)量都很低[16]。在黃瓜的各器官中均發(fā)現(xiàn)有CsPGIP的表達(dá)，在嫩葉中表達(dá)量最高，在莖中表達(dá)量最低[12]。但在種子中表達(dá)量最低，在營養(yǎng)芽和花中最高。白菜BnPGIP1在花蕾中表達(dá)豐度高，在根中相對較低。在本研究中毛竹PePGIP基因在根、莖、葉中均表達(dá)，但在莖中表達(dá)量最低，在根中的表達(dá)最高。這可能與土壤中含有大量的病原真菌，毛竹根系容易受到其侵染有關(guān)。

研究認(rèn)為，通過體外表達(dá)獲得的PGIP蛋白對黑曲霉、灰霉菌等的PGs具有抑制作用[17]。本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了PePGIP重組蛋白，這有利于后續(xù)體外活性分析。然而，PePGIP體外重組蛋白主要以包涵體形式出現(xiàn)，可溶性蛋白很少。這不利于后續(xù)蛋白純化等工作開展，因此需要進(jìn)一步優(yōu)化探索合適的PePGIP表達(dá)系統(tǒng)。

已有研究表明，梨PGIP基因在番茄、葡萄等植物中過量表達(dá)，能有效抑制由灰霉菌等病原菌引起的侵染[18]；同時(shí)，大豆PGIP基因可以提高玉米對玉米穗腐病菌 (Stenocarpella maydis)的抗性；而葡萄的VvPGIP1、辣椒的CaPGIP1等基因的過量表達(dá)能有效降低轉(zhuǎn)基因煙草對灰霉菌、炭疽菌等病菌的敏感性；牛心草的CkPGIP1基因能有效提高擬南芥對灰霉菌的抵抗力[3]。為了更好地了解PePGIP基因功能，本研究的后續(xù)試驗(yàn)將構(gòu)建該基因正義過量表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，研究該基因和不同病原菌間的互作關(guān)系。

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Cloning and Expression Analysis of PePGIP from Phyllostachys edulis

Dong Nansong1，2Liao Meizhen1，2Lou Yongfeng1，3Xiao Fuming1，3
(1 Jiangxi Provincial Key Lab for Plant Biotechnology， Nanchang 330013， Jiangxi， China；2 Chenshan Forest Farm， Anfu 360830， Jiangxi， China；3 Jiangxi Academy of Forestry， Nanchang 330013， Jiangxi， China)

Polygalacturonase inhibiting protein(PGIP)is one of important plant defense proteins，which plays an important role in the defense of fungi.Based on the sequence alignment method，a homologous gene ofPGIPwas obtained from the full length cDNA database ofPhyllostachys edulisand named asPePGIP(FP100022).The full length of cDNA ofPePGIPis 1370 bp including an open reading frame(ORF)of 1008 bp，which encodes a predicted protein of 335 amino acids with a calculated molecular weight of 36.0 kDa.Sequence analysis showed that there were 8 conserved leucine－rich repeats， indicating that it belongs to the eLRR superfamily.PePGIP had higher homology as PGIPs from other gramineous plants did，which was clustered in the clade with those ofBrachypodium distachyumandOryza sativa.RT－PCR analysis showed thatPePGIPwas expressed in roots， culms and leaves ofP.edulis， with the highest level in roots.The prokaryotic expression vector plasmid of pEASY－PePGIP was constructed and then transformed intoEscherichia colistrain BL21(DE3).The analysis of SDS－PAGE showed that the recombinant protein was around 42 kDa after being induced by IPTG.This study lays a foundation for an in－depth understanding ofPePGIPfunction.

Phyllostachys edulis，PGIP， cloning， expression analysis

10.13640/j.cnki.wbr.2017.05.002

江西省自然科學(xué)基金 (編號:20171BAB214033)。

董南松，男，主要從事林木遺傳育種研究。

婁永峰，男，主要從事林木遺傳育種研究。E－mail:330403612＠qq.com。