固定化氧化還原介體加速Escherichia coli BL21還原Cr(Ⅵ)的影響因素研究

平佳芃，許志芳，郭延凱，郭建博，廉 靜

(1.河北科技大學環(huán)境科學與工程學院，河北石家莊 050018；2.河北省污染防治生物技術(shù)實驗室，河北石家莊 050018；3.華能國際電力股份有限公司上安電廠，河北石家莊 050000；4.天津城建大學市政與環(huán)境工程學院，天津 300384)

1008-1542(2017)05-0493-06

10.7535/hbkd.2017yx05013

固定化氧化還原介體加速EscherichiacoliBL21還原Cr(Ⅵ)的影響因素研究

平佳芃1,2，許志芳3，郭延凱1,2，郭建博4，廉 靜1,2

(1.河北科技大學環(huán)境科學與工程學院，河北石家莊 050018；2.河北省污染防治生物技術(shù)實驗室，河北石家莊 050018；3.華能國際電力股份有限公司上安電廠，河北石家莊 050000；4.天津城建大學市政與環(huán)境工程學院，天津 300384)

為了研究非水溶性醌類介體加速Cr(Ⅵ)生物還原過程的影響因素，采用乙酸纖維素包埋法固定非水溶性醌類介體，探討其調(diào)控EscherichiacoliBL21還原Cr(Ⅵ)的過程。結(jié)果表明，蒽醌、1-氯蒽醌、2-氯蒽醌、1,5-二氯蒽醌、1,8-二氯蒽醌和1,4,5,8-四氯蒽醌6種非水溶醌的加速順序為1-氯蒽醌>1,5-二氯蒽醌>2-氯蒽醌>1,8-二氯蒽醌>蒽醌>1,4,5,8-四氯蒽醌；1-氯蒽醌的最佳加速濃度為0.048 mol/L；生物還原的最佳pH值為7.00；最佳初始Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度為30 mg/L；在溫度范圍為20～60 ℃時，Cr(Ⅵ)的去除率隨溫度的上升而增加；在重復利用性實驗中，1-氯蒽醌乙酸纖維素小球循環(huán)使用6次，Cr(Ⅵ)生物還原速率仍是空白菌液5倍以上。乙酸纖維素固定非水溶性醌可以有效加速EscherichiacoliBL21還原Cr(Ⅵ)過程，具有良好的應用價值。

水污染防治工程；Cr(Ⅵ)；氧化還原介體；生物還原；固定化

鉻及其化合物是重要的工業(yè)原料，廣泛應用于電鍍、制革、木材防腐、合金制造等行業(yè)，導致大量含Cr(Ⅵ)廢水的產(chǎn)生，造成了嚴重的鉻污染[1-3]。鉻在水環(huán)境中的存在形態(tài)主要有2種：Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)。Cr(Ⅵ)毒性大，易遷移、易被人體吸收，可致癌、致突變，對生態(tài)環(huán)境和人類生存產(chǎn)生了巨大危害，是美國EPA公認的優(yōu)先污染物之一[4-5]，也被中國列入《重金屬污染綜合防治“十二五”規(guī)劃》總量控制指標之一[1，6]。與Cr(Ⅵ)相比，Cr(Ⅲ)的毒性較小，將較高毒性的Cr(Ⅵ)還原為較低毒性的Cr(Ⅲ)，是鉻污染修復的有效途徑，也因此成為國內(nèi)外學者的研究熱點[7]。目前，含Cr(Ⅵ)廢水的處理方法主要有物理法、化學法和生物法。其中，生物法具有處理成本低、二次污染小等特點[8]，具有較為廣泛的應用前景，但仍然存在處理速率慢的問題。目前，已有研究結(jié)果表明氧化還原介體能夠加速電子供體與電子受體間的電子傳遞速率，從而提高處理多種污染物的氧化還原速率[9-11]。另外，在實際應用過程中，水溶性醌類介體的使用易流失，從而造成二次污染，且連續(xù)投加增加運行成本，而將非水溶性醌類介體固定化后可以有效的避免這些問題。

本研究開展了利用乙酸纖維素包埋固定的非水溶性醌類介體加速EscherichiacoliBL21(簡稱E.coliBL21)還原Cr(Ⅵ)過程的特性研究，以期為非水溶性醌類介體在含重金屬廢水處理領(lǐng)域中的應用提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種來源及培養(yǎng)

菌種為實驗室購買的E.coliBL21。將E.coliBL21按5%體積比接種到LB培養(yǎng)基中，37 ℃，140 r/min振蕩培養(yǎng)至OD660值為1.1。離心收集細胞(8 000×g，15 min)，用無菌磷酸鈉緩沖溶液(20 mmol/L，pH值為7.00)清洗2遍，按4%體積比轉(zhuǎn)接到重金屬還原培養(yǎng)基中，37 ℃，140 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。

LB培養(yǎng)基(富集培養(yǎng)基)(g/L)：酵母粉 5.0，胰蛋白胨 10.0，NaCl 10.0。pH值調(diào)至7.00±0.02，高壓蒸氣滅菌(1×105Pa滅菌30 min)。

重金屬還原培養(yǎng)基(g/L)：NH4Cl 1.0，NaHCO31.0，K2HPO40.2，MgSO40.1，NaCl 1.0，葡萄糖2.0，pH值調(diào)至7.20±0.02，高壓蒸氣滅菌(1×105Pa滅菌30 min)。

1.2 廢水來源

采用鉻酸鉀(K2CrO4，分析純)按所需濃度配置含Cr(Ⅵ)模擬廢水，高壓蒸氣滅菌(1×105Pa滅菌30 min)待用。

1.3 實驗材料

實驗所選6種氧化還原介體：蒽醌(AQ)、1-氯蒽醌(1-AQ)、2-氯蒽醌(2-AQ)、1,5-二氯蒽醌(1,5-AQ)、1,8-二氯蒽醌(1,8-AQ)和1,4,5,8-四氯蒽醌(1,4,5,8-AQ)6種醌類化合物為氧化還原介體，均購于上海試四赫維化工有限公司。

1.4 介體的固定

本實驗采用乙酸纖維素包埋法固定非水溶性醌[12]。

1.5 Cr(Ⅵ)還原的實驗步驟

將培養(yǎng)完成的E.coliBL21取出混勻后分裝到250 mL錐形瓶中，加入已滅菌的Cr(Ⅵ)儲備液使體系中初始Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度為35 mg/L，加入含有不同種類、不同濃度非水溶性醌的乙酸纖維素小球，用橡膠塞密封，通過注射器取樣。放置于37 ℃恒溫箱進行反應，每2 h取樣一次。

1.6 分析方法

Cr(Ⅵ)：使用722S分光光度計測定，采用二苯碳酰二肼分光光度法[13]。

pH值：使用PHS225C型數(shù)字酸度計測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 非水溶性醌對E.coli BL21還原Cr(Ⅵ)的影響

圖1 6種非水溶性醌對Cr(Ⅵ)質(zhì)量還原的影響Fig.1 Effect of six non-dissolved quinones on Cr(Ⅵ) reduction process

為了探討對還原Cr(Ⅵ)加速效果最佳的非水溶性醌，實驗考察了蒽醌，1-氯蒽醌，2-氯蒽醌，1,5-二氯蒽醌，1,8-二氯蒽醌，1,4,5,8-四氯蒽醌對Cr(Ⅵ)還原的加速作用，每種醌的投加量分別為0.036 mol/L，以空白菌液和空白小球作為對照，實驗結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，與空白菌液相比，6種非水溶性醌對Cr(Ⅵ)還原均有加速作用，加速快慢順序為1-氯蒽醌>1,5-二氯蒽醌>2-氯蒽醌>1,8-二氯蒽醌>蒽醌>1,4,5,8-四氯蒽醌。在降解10 h后，Cr(Ⅵ)去除率分別為91.43%，56.66%，55.20%，47.63%，45.89%，33.66%。其中1-氯蒽醌作用效果最明顯，故選擇1-氯蒽醌進行后續(xù)研究。CERVENTES[14]研究表明，醌類化合物加速機制大致有2種：一種是醌類化合物具有生物厭氧還原過程中輔酶所具有的結(jié)構(gòu)特征，在還原過程中起到類似輔酶的作用；另一種是醌類化合物在酶的作用下會形成活性高且有一定穩(wěn)定性的中間體，它們能從底物中獲得氫質(zhì)子或電子傳遞給最終電子受體，從而將其還原。STOLZ[15]研究表明，在有合適電子供體時，氧化還原介體還原為氫醌之后能夠還原多種氧化性化合物并且完成介體的再生，從而加速電子在電子供體和電子受體之間的傳遞過程。XI等[16]研究表明醌類化合物可以作為電子載體縮短反硝化時間，而且醌類化合物與反硝化中的輔酶甲基萘醌結(jié)構(gòu)相似。

圖2 不同濃度的1-氯蒽醌對Cr(Ⅵ)還原的影響Fig.2 Effect of different concentrations of 1-dichloroanthraquinone on Cr(Ⅵ) reduction process

2.2 不同濃度1-氯蒽醌對Cr(Ⅵ)還原的影響

為了考察不同1-氯蒽醌的濃度對E.coliBL21還原Cr(Ⅵ)的影響，實驗設置了不同濃度的1-氯蒽醌，分別為0.012，0.024，0.036，0.048，0.060 mol/L，以空白菌液和空白小球作為對照，考察1-氯蒽醌濃度對E.coliBL21還原Cr(Ⅵ)的影響。實驗結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，5種濃度的醌反應體系對Cr(Ⅵ)還原均有一定的加速作用。在降解10 h后，Cr(Ⅵ)去除率分別為48.6%，51.4%，64.3%，90.0%，63.9%?？梢钥闯?-氯蒽醌濃度為0.048 mol/L時加速效果最明顯。當體系中1-氯蒽醌濃度為0.012～0.048 mol/L時，還原速率隨著1-氯蒽醌濃度增加而增加；但當1-氯蒽醌濃度增加至0.060 mol/L時，還原速率與1-氯蒽醌濃度為0.048 mol/L相比出現(xiàn)了下降，可能是因為醌具有一定毒性，影響了菌的活性[17]。有研究表明[18]，醌類可以通過NADPH-細胞色素P450和NADH-細胞色素b5還原酶進行單電子酶還原，產(chǎn)生可以進行氧化還原循環(huán)的半醌基團，進而產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，包括超氧陰離子自由基、過氧化氫和羥基，導致了對細胞的毒性。故后續(xù)實驗使用0.048 mol/L 1-氯蒽醌進行研究。

2.3 初始Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度對還原的影響

圖3 不同初始Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度對還原的影響Fig.3 Effect of differentinitial Cr(Ⅵ) concentrations on Cr(Ⅵ) reduction process

為了考察不同初始Cr(Ⅵ)濃度對還原過程的影響，實驗設置了6種不同初始Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度，分別為10，20，30，40，50，60 mg/L，考察初始Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度對還原過程的影響，實驗結(jié)果如圖3所示。

圖4 不同初始pH值對Cr(Ⅵ)還原的影響Fig.4 Effect of different initial pH values on Cr(Ⅵ) reduction process

由圖3可知，在不同初始Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度下，E.coliBL21對Cr(Ⅵ)均有一定的還原作用，初始Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50，60 mg/L，還原體系的速率常數(shù)分別為8.05，8.05，8.37，7.08，6.61，6.34 mg Cr(Ⅵ)/(g·h)，可以看出，當初始Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度為30 mg/L時，Cr(Ⅵ)還原速率較大，與張娜[19]和趙欣欣[20]實驗結(jié)果類似。當Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度較高時對菌體有較強的毒性作用，這可能是其他對照組去除率較低的原因。RIDA等[21]研究結(jié)果顯示，Cr(Ⅵ)能引起細胞形態(tài)的改變，使細胞膜表面粗糙，出現(xiàn)褶皺且通透性增加。

2.4 初始pH值對Cr(Ⅵ)還原的影響

在微生物生命活動過程當中，大部分需要酶的參與，過高或者過低的pH值都會影響酶的活性，不同的酶最適pH值也不同[22]。因此本實驗研究了不同初始pH值對E.coliBL21還原Cr(Ⅵ)的影響。實驗設定了6種不同的初始pH值，分別為5.00，6.00，7.00，7.50，8.00，9.00，并以空白小球作為對照。實驗結(jié)果如圖4所示。

如圖4可知，與空白小球相比，在不同pH值情況下，1-氯蒽醌對E.coliBL21還原Cr(Ⅵ)過程均有加速效果，當pH值為7.00時，作用效果最為明顯，其次是pH值為7.50時。與王雪艷[23]研究結(jié)果相似。MURUGAVELH等[24]研究結(jié)果表明，在pH值較低時可能導致細胞裂解；而在pH值較高時，細胞表面活性部位和解離狀態(tài)受到了抑制。另外，在極端條件下，反應體系的傳質(zhì)也受到制約，尤其是醌類化合物起到的調(diào)控作用會受到大幅度影響[12]。

2.5 溫度對Cr(Ⅵ)還原的影響

微生物的生長繁殖都有一個適宜的溫度范圍，溫度過高會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)變質(zhì)失活，溫度過低時會使微生物進入低溫休眠狀態(tài)[25]。本實驗考查了在20，30，37，40，50，60 ℃的條件下，1-氯蒽醌調(diào)控E.coliBL21還原Cr(Ⅵ)的影響，并設置空白小球作為對照。實驗結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出在溫度從20 ℃升高到60 ℃時，Cr(Ⅵ)還原速率呈上升趨勢。20，30，37，40，50，60 ℃還原體系的速率常數(shù)分別為7.15，8.62，12.35，14.11，23.48，28.17 mgCr(Ⅵ)/(g·h)。根據(jù)阿倫尼烏斯方程，擬合實驗數(shù)據(jù)可得到反應速率常數(shù)k與熱力學溫度T的相關(guān)性[10]，如圖6所示。從圖6可以看出，lnk和T-1具有高度的相關(guān)性(R2=0.962 7)，其線性關(guān)系式為y=-3.643x+14.314，由線性關(guān)系式和阿倫尼烏斯方程得到該反應條件下的活化能Ea=28.47 kJ/mol，指前因子A為14.87 mgCr(Ⅵ)/(g·h)。考慮到E.coliBL21的最佳生長溫度為37 ℃，選擇相應實驗的溫度條件均選擇為37 ℃。

2.6 1-氯蒽醌乙酸纖維素小球的重復利用性

為了確定1-氯蒽醌乙酸纖維素小球的可重復利用性，本實驗對比了6次連續(xù)重復使用1-氯蒽醌的乙酸纖維素小球體系與空白菌液體系，來判定固定后非水溶性醌的生物催化穩(wěn)定性，在37 ℃，pH值為7.00，Cr(Ⅵ)初始質(zhì)量濃度為35 mg/L的條件下進行對比。實驗結(jié)果如圖7所示。投加1-氯蒽醌的乙酸纖維素小球體系與空白菌液體系相比，6次重復利用后的還原速率仍是空白對照的5倍以上。由此可知，乙酸纖維素包埋非水溶性醌加速E.coliBL21還原Cr(Ⅵ)是一個操作性好，整體效率高且有實際應用價值的Cr(Ⅵ)生物修復的方法。

圖5 不同溫度對Cr(Ⅵ)還原的影響Fig.5 Effect of different temperatures on Cr(Ⅵ) reduction process

圖6 反應速率常數(shù)k與熱力學溫度T的相關(guān)性Fig.6 Relationship of reation rate constant and thermodynamic temperature

圖7 乙酸纖維素固定1-氯蒽醌調(diào)控還原Cr(Ⅵ)連續(xù)重復實驗的結(jié)果Fig.7 Immediate repeated experiment result of Cr(Ⅵ) reduction accelerated by cellulose acetate immobilized 1-dichloroanthraquinone

3 結(jié) 語

本研究通過批次實驗考察了非水溶性醌影響E.coliBL21還原Cr(Ⅵ)過程中的多種因素。結(jié)果表明:6種非水溶性醌對E.coliBL21還原Cr(Ⅵ)均有加速作用，其中1-氯蒽醌加速效果最為明顯，最佳濃度為0.048 mol/L；1-氯蒽醌調(diào)控E.coliBL21還原Cr(Ⅵ)最佳pH值為7.00;1-氯蒽醌乙酸纖維素小球在循環(huán)使用后仍能保持較高的Cr(Ⅵ)生物催化還原性能。

目前有許多關(guān)于氧化還原介體加速Cr(Ⅵ)生物還原的研究，LIU等[26]使用指甲花醌為氧化還原介體，4 h內(nèi)還原了質(zhì)量濃度為97.5 mg/L的Cr(Ⅵ)；GUO等[10]使用AQS為氧化還原介體，當Cr(Ⅵ)初始質(zhì)量濃度為32 mg/L時，經(jīng)過7.5 h的還原，Cr(Ⅵ)去除率為98.5%；CHEN等[27]使用AQDS作為氧化還原介體，當Cr(Ⅵ)初始質(zhì)量濃度為10 mg/L時，經(jīng)過30 h的還原，Cr(Ⅵ)去除率為100%。但是由于上述研究中均采用的是水溶性氧化還原介體，其使用過程中會帶來二次污染和成本增加的問題，而經(jīng)過固定后的氧化還原介體可有效解決上述問題。本研究中乙酸纖維素固定的1-氯蒽醌可有效加速E.coliBL21還原Cr(Ⅵ)的過程，且與以往GUO等[28]、郭建博等[29]、康麗等[30]的固定方法相比，具有較好的機械性能和可重復利用性。因此，利用乙酸纖維素包埋非水溶性氧化還原介體加速Cr(Ⅵ)生物還原是一種具有較高實際應用價值的Cr(Ⅵ)生物修復的方法。

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在本文中,將總信道帶寬劃分為多個等帶寬的子信道,通過各個子信道中的信息符號的調(diào)制,獲得各個子載波的調(diào)制頻率譜。最終,每個子信道符號將在時域持續(xù)的時間比單載波持續(xù)的時間長很多,使光信號因受多徑而衰落的影響就大大減弱了。

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Research of the influencing factors of the immobilized redox mediators accelerating Cr(Ⅵ) reduction by Escherichia coli BL21

PING Jiapeng1,2, XU Zhifang3, GUO Yankai1,2, GUO Jianbo4, LIAN Jing1,2

(1.School of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang,Hebei 050018,China; 2.Pollution Prevention Biotechnology Laboratory of Hebei Province, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018,China; 3.Shang’an Power Plant, Huaneng Power International Inc., Shijiazhuang, Hebei 050000, China; 4.Tianjin Key Laboratory of Aquatic Science and Technology, School of Environmental and Municipal Engineering, Tianjin Chengjian University, Tianjin 300384, China)

In order to study the influencing factors of non-dissolved redox mediators on Cr (Ⅵ) bioreduction, the accelerating effect of non-dissolved redox mediators immobilized by cellulose acetate (CA) on the reduction of Cr(Ⅵ) byEscherichiacoliBL21 is investigated. The results show that the accelerating order is 1-chloroanthraquinone>1,5-dichloroanthraquinone>2-chloroanthraquinone>1,8-dichloroanthraquinone>anthraquinone>1,4,5,8-tetrachloroanthtaquinone; the optimal concentration of 1-chloroanthraquinone pH and initial Cr(Ⅵ) concentration are 0.048 mol/L, 7.00 and 30 mg/L, respectively; the removal rate increases with the increasing temperature when it is in the range of 20～60 ℃; after 6 times of recycling experiments, and the Cr(Ⅵ) bioreduction rate with the immobilized 1-chloroanthraquinone maintains above 5 times of margin bacterium's. It indicates that non-dissolved redox mediators immobilized by CA can effectively accelerate the reduction rate of Cr(Ⅵ) byEscherichiacoliBL21, which has favourable application value.

water pollution control engineering; Cr(Ⅵ); redox mediators; bioreduction; immobilization

X712

A

2017-05-03；

2017-07-13；責任編輯：王海云

國家自然科學基金(51208170)

平佳芃(1993—)，女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事水處理方面的研究。

廉 靜副教授。E-mail：ningjingzhiyuan98@163.com

平佳芃，許志芳，郭延凱，等.固定化氧化還原介體加速EscherichiacoliBL21還原Cr(Ⅵ)的影響因素研究[J].河北科技大學學報,2017,38(5):493-498.

PINGJjiapeng，XU Zhifang，GUO Yankai，et al. Research of the influencing factors of the immobilized redox mediators accelerating Cr(Ⅵ) reduction byEscherichiacoliBL21[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2017,38(5):493-498.