EoNPV對(duì)灰茶尺蠖的致病特性及高效毒株篩選

唐美君，郭華偉，葛超美，殷坤山，肖 強(qiáng)

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所， 浙江 杭州 310008； 2.農(nóng)業(yè)部茶葉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008)

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1686-1691

唐美君，郭華偉，葛超美，等. EoNPV對(duì)灰茶尺蠖的致病特性及高效毒株篩選[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(10)： 1686-1691.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.13

2017-04-11

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0200902)；浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃(2014C32095)

唐美君(1972—)，女，江蘇丹徒人，推廣研究員，主要從事茶樹病蟲防治技術(shù)研究。E-mail: tmjtea@tricaas.com

EoNPV對(duì)灰茶尺蠖的致病特性及高效毒株篩選

唐美君1，2，郭華偉1，2，葛超美1，殷坤山1，肖 強(qiáng)1，2

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所， 浙江 杭州 310008； 2.農(nóng)業(yè)部茶葉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008)

茶尺蠖核型多角體病毒(Ectropisobliquanucleopolyhedronviruses，EoNPV)是茶尺蠖的重要天敵。灰茶尺蠖(EctropisgrisescensWarren)是茶尺蠖的近緣種，也是茶樹主要害蟲。為了探明應(yīng)用EoNPV防控灰茶尺蠖的效果，發(fā)揮其對(duì)灰茶尺蠖的生物防治作用，通過(guò)生物測(cè)定，研究了EoNPV對(duì)灰茶尺蠖的致病特性，并進(jìn)行了高效毒株的篩選。結(jié)果表明，EoNPV對(duì)灰茶尺蠖1齡幼蟲致病力最強(qiáng)，2×104～2×108PIB·mL-1處理對(duì)1齡幼蟲的致死率達(dá)82.7%～100%；對(duì)灰茶尺蠖2齡幼蟲的LC50值為2.32×106PIB·mL-1(飼毒后9 d)；對(duì)不同代別灰茶尺蠖的致病力有明顯差別，以第2代為最高。從用灰茶尺蠖連續(xù)增殖5代的病毒樣品中，篩選出高效毒株QF4，該毒株對(duì)灰茶尺蠖致死率比原始毒株提高51.5%，致死中時(shí)間縮短1.5 d。研究表明，應(yīng)用EoNPV防治灰茶尺蠖最適宜在第2代1齡期施用；QF4可作為病毒生產(chǎn)用毒株。

EoNPV；灰茶尺蠖；致病特性；高效毒株；

茶尺蠖核型多角體病毒(Ectropisobliquanucleopolyhedronviruses，EoNPV)自1980年在茶尺蠖(EctropisobliquaProut)上首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)[1]，一直是茶園生物防治研究的重點(diǎn)，其生物學(xué)特性[2-5]、制劑研制[6-7]、田間應(yīng)用技術(shù)[8]等方面均得到了深入研究，并逐步實(shí)現(xiàn)了商品化，在出口茶和有機(jī)茶生產(chǎn)基地得到推廣應(yīng)用，取得了良好的防治效果[9]。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，EoNPV對(duì)茶尺蠖不同地理種群的致病力存在較大差異[10]，對(duì)很多地理種群(湖北、湖南、河南、浙江的大部分地區(qū)等)的防效不理想，田間病毒致死率僅20%～30%。進(jìn)一步研究表明，茶尺蠖不同地理種群已分化為2個(gè)種，即茶尺蠖(E.obliquaProut)和灰茶尺蠖(E.grisescensWarren)[11]。這兩種尺蠖幼蟲期外形相像，在生物學(xué)特性上也極其相似，肉眼幾乎難以區(qū)分，過(guò)去一直統(tǒng)稱為茶尺蠖。迄今為止，EoNPV對(duì)灰茶尺蠖的致病性尚未有研究報(bào)道。試驗(yàn)表明，灰茶尺蠖也能被茶尺蠖核型多角體病毒感染，但感染后死亡率與茶尺蠖相比存在較大差異。為了明確茶尺蠖核型多角體病毒對(duì)灰茶尺蠖的致病特性，提高病毒的防治效果，為田間應(yīng)用EoNPV防治灰茶尺蠖提供依據(jù)，我們測(cè)定了不同病毒液濃度、不同蟲齡和不同代別下EoNPV對(duì)灰茶尺蠖的致病力，并開展了高效毒株篩選的初步研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

灰茶尺蠖幼蟲采集于浙江衢州茶園(118.88°E，28.97°N)，茶尺蠖幼蟲采集于杭州余杭區(qū)茶園(119.90°E，30.39°N)，室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)2代以上供試。EoNPV為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所實(shí)驗(yàn)室保存的EoNPV原液冷藏樣品，經(jīng)室內(nèi)活體繁殖獲得。尺蠖飼養(yǎng)及病毒繁殖提取方法同文獻(xiàn)[9]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物測(cè)定方法

病毒劑量和蟲齡試驗(yàn)：EoNPV使用劑量設(shè)2×108、2×107、2×106、2×105、2×104PIB·mL-15種處理，分別對(duì)灰茶尺蠖1齡、2齡、3齡幼蟲進(jìn)行室內(nèi)活性測(cè)定，以清水處理作對(duì)照。

不同代別試驗(yàn)：分別設(shè)第1代、第2代、第3代、第4代、第5代5種處理，采用浸葉法以1齡灰茶尺蠖幼蟲、2×106PIB·mL-1的病毒使用劑量進(jìn)行活性測(cè)定。不同蟲齡和劑量的試驗(yàn)均在(24±0.5)℃恒溫人工氣候室或恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，不同代別試驗(yàn)?zāi)M田間試驗(yàn)，在自然溫度下進(jìn)行。上述各處理均設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)20頭蟲以上。幼蟲開始死亡后，每天記錄死蟲數(shù)。統(tǒng)計(jì)計(jì)算逐日累計(jì)死亡率，并采用DPS分析軟件進(jìn)行差異顯著性分析和LC50、LT50計(jì)算。

1.2.2 毒株篩選方法

將EoNPV原始毒株稀釋成1×107PIB·mL-1的病毒液。從田間采集新鮮茶樹嫩梢，將嫩梢在已配好的病毒液中浸濕后晾干備用。取室內(nèi)大量飼養(yǎng)的2齡灰茶尺蠖幼蟲，用帶病毒的嫩梢飼養(yǎng)3 d，然后用無(wú)病毒的葉片繼續(xù)飼養(yǎng)。待幼蟲開始死亡后，每天將蟲尸收集在廣口瓶(250 mL)中。經(jīng)病毒提純定量后，即獲得病毒小樣QF1。用QF1重復(fù)上述增殖步驟，再次提純獲得的病毒小樣即為QF2，以此類推，共獲得QF1、QF2、…、QF66個(gè)小樣。放置在冰箱內(nèi)冷藏備用。

1.2.3 毒效測(cè)定方法

將各病毒樣品分別稀釋至1×106PIB·mL-1。剪取新鮮干凈茶梢，在病毒液中浸濕后自然晾干。剪下帶病毒茶梢放入玻璃罐頭瓶中，分別接入相應(yīng)供試種群的2齡幼蟲，在(24±0.5)℃條件下飼養(yǎng)。飼毒3 d后，更換無(wú)病毒葉片飼養(yǎng)，觀察記錄死蟲數(shù)與活蟲數(shù)。每處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)接蟲20頭以上。統(tǒng)計(jì)逐日累計(jì)死亡率和LT50。

2 結(jié)果與分析

2.1茶尺蠖核型多角體病毒對(duì)灰茶尺蠖的致病特性

2.1.1 EoNPV不同使用劑量對(duì)不同齡期灰茶尺蠖幼蟲的致病力

測(cè)定了EoNPV不同使用劑量(2×108、2×107、2×106、2×105、2×104PIB·mL-1)對(duì)灰茶尺蠖1～3齡幼蟲的致死率，圖1顯示，使用劑量越大、蟲齡越小則幼蟲死亡率越高、死亡速率越快。高劑量處理(2×107、2×108PIB·mL-1)對(duì)1～3齡幼蟲均有較高致死率，致死率在90%以上；2×106PIB·mL-1處理對(duì)1、2齡幼蟲可達(dá)100%致死率，但對(duì)3齡幼蟲致死率則不到20%；2×104、2×105PIB·mL-1處理對(duì)1齡幼蟲的致死率可達(dá)82.7%～95.4%，對(duì)2齡幼蟲的致死率下降為29.8%～76.1%，對(duì)3齡幼蟲則降至3.0%～11.4%(表1)。茶尺蠖核型多角體病毒對(duì)灰茶尺蠖的致病力隨病毒劑量的增大而增強(qiáng)，并隨灰茶尺蠖蟲齡的增加而下降。

EoNPV對(duì)灰茶尺蠖的致病力呈明顯的劑量效應(yīng)，以圖1中2齡幼蟲飼毒9 d后的數(shù)據(jù)計(jì)算，EoNPV對(duì)灰茶尺蠖2齡幼蟲的LC50值為2.32×106PIB·mL-1(95%置信限1.37×106～3.98×106PIB·mL-1)。與EoNPV對(duì)茶尺蠖2齡幼蟲的LC50值(1.26×103PIB·mL-1)[9]相比，LC50值提高了近2 000倍，說(shuō)明EoNPV對(duì)灰茶尺蠖的致病力低于茶尺蠖。

2.1.2 EoNPV對(duì)不同代別灰茶尺蠖幼蟲的致病力

分別以灰茶尺蠖第1、2、3、4、5代1齡幼蟲為對(duì)象，用2×106PIB·mL-1的EoNPV進(jìn)行活性測(cè)定，結(jié)果表明，第1、2、5代幼蟲期死亡率可達(dá)100%，極顯著高于第3、4代；幼蟲死亡速率以第2代為最快，LT50值(11.8 d)為最小(表2、圖2)。不同代別之間死亡率差異的原因主要與氣溫有關(guān)，第3、4代灰茶尺蠖發(fā)生于7、8月份，氣溫較高，而高溫對(duì)病毒有明顯的抑制作用[3，8]。且高溫季節(jié)灰茶尺蠖生長(zhǎng)發(fā)育快，尚未發(fā)病即化蛹。

圖1 不同EoNPV濃度處理對(duì)灰茶尺蠖1-3齡幼蟲的致死動(dòng)態(tài)Fig.1 Lethal dynamics for 1st-3rd instar of Ectropis grisescens infected with different concentrations of EoNPV

表1不同EoNPV濃度處理對(duì)灰茶尺蠖1-3齡幼蟲的致死率和LT50

Table1Lethality rate and LT50for 1st-3thinstar ofE.grisescensinfected with different concentrations of EoNPV

EoNPV濃度ConcentrationofEoNPV/(PIB·mL-1)幼蟲期死亡率Larvalmortality/%1齡1st2齡2nd3齡3rdLT50/d1齡1st2齡2nd3齡3rd2×108100aA100aA100aA32391072×107100aA100aA900aA39641302×106100aA100aA242bB61105—2×105954aA761bB30cC94145—2×104827bB298cC114cBC129——

同列數(shù)據(jù)后沒(méi)有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，沒(méi)有相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

The values in the same column followed by different lowercase letters or uppercase letters showed significance at the level of 0.05 or 0.01.

表2不同代別下EoNPV對(duì)灰茶尺蠖的防治效果

Table2Control effect of EoNPV on the larvae of different generations ofE.grisescens

代別Generation幼蟲期死亡率Larvalmortality/%差異顯著性Significance最終死亡率Finalmortality/%差異顯著性SignificanceLT50/d相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficent1100A100A136097472100A100A118099173791B963B149096434784B897C160098385100A100A12909185

圖2 不同代別灰茶尺蠖感染EoNPV后的死亡動(dòng)態(tài)Fig.2 Lethal dynamics for the larvae of different generations of E. grisescens with the infection of EoNPV

因此，田間應(yīng)用EoNPV防治灰茶尺蠖以第2代為最佳，其次為第5代和第1代。

2.2茶尺蠖核型多角體病毒高效毒株的篩選

毒株篩選試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，QF4毒株的效果最好，12 d內(nèi)死亡率達(dá)100%，致死中時(shí)間僅7.7 d，比其他毒株的平均值縮短3.5 d。用QF4毒株分別對(duì)灰茶尺蠖和茶尺蠖進(jìn)行了毒效試驗(yàn)，結(jié)果表明，無(wú)論對(duì)灰茶尺蠖還是茶尺蠖，QF4毒株均比原始毒株EoNPV(CK)的效果好，致死中時(shí)間短(表4、表5)。

將篩選出的高效毒株QF4和原始毒株均用灰茶尺蠖進(jìn)行大量繁殖，獲得相應(yīng)的大量增殖病毒樣品，記為QF4(Q)和QV。分別用這兩個(gè)大量增殖樣品對(duì)灰茶尺蠖和茶尺蠖進(jìn)行生測(cè)，結(jié)果(表6)表明，QF4(Q)對(duì)灰茶尺蠖和茶尺蠖的毒效均有提高，QF4(Q)用于防治灰茶尺蠖，不僅死亡速度比對(duì)照快，致死中時(shí)間縮短1.5 d，而且最終防治效果比對(duì)照提高51.5%；用于防治茶尺蠖，QF4(Q)與QV最終防治效果相同，但死亡速度加快，致死中時(shí)間縮短1.6 d。

表3EoNPV不同毒株對(duì)灰茶尺蠖的毒效測(cè)定

Table3The evaluation of the effect of different strains of EoNPV againstE.grisescens

EoNPV毒株EoNPVstrain供試總蟲數(shù)Totalnumberofinsectstested重復(fù)Replication飼毒后不同時(shí)間死亡率Mortalityatdifferenttimesafterinoculation/%8d10d12d死亡率(y)對(duì)時(shí)間(x)的直線回歸式Thelinearregressionofmortality(y)versustime(x)相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficent(r)致死中時(shí)間Medianlethaltime(LT50)QF1863185513783y=1649x-1165809794101QF285396275519y=1046x-765409922121QF395334299585y=1137x-810709767115QF4843391798100y=1316x-51910995277QF586394291638y=1369x-1066209890114QF695364402674y=1101x-712109305111

表4EoNPV-QF4毒株對(duì)灰茶尺蠖的毒效

Table4Effect of EoNPV-QF4strain againstE.grisescens

毒株strain供試總蟲數(shù)Totalnumberofinsectstested重復(fù)Replication飼毒后不同時(shí)間死亡率Mortalityatdifferenttimesafterinoculation/%8d10d12d死亡率(y)對(duì)時(shí)間(x)的直線回歸式Thelinearregressionofmortality(y)versustime(x)相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficent(r)致死中時(shí)間Medianlethaltime(LT50)QF4963246612890y=160x-10020992294EONPV(CK)105300160y=88x-89309915158

表5EoNPV-QF4毒株對(duì)茶尺蠖的毒效

Table5Effect of EoNPV-QF4strain againstE.obliqua

毒株strain供試總蟲數(shù)Totalnumberofinsectstested重復(fù)Replication飼毒后不同時(shí)間死亡率Mortalityatdifferenttimesafterinoculation/%4d7d8d死亡率(y)對(duì)時(shí)間(x)的直線回歸式Thelinearregressionofmortality(y)versustime(x)相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficent(r)致死中時(shí)間Medianlethaltime(LT50)QF41043225842950y=200x-6460970757EoNPV(CK)107327431758y=211x-10510969074

表6EoNPV-QF4大量增殖樣品對(duì)灰茶尺蠖和茶尺蠖的毒效

Table6Effect of the mass multiplication sample of EoNPV-QF4strain againstE.grisescensandE.obliqua

3 結(jié)論與討論

昆蟲桿狀病毒具有很強(qiáng)的宿主專化性。一般來(lái)說(shuō)，一種NPV只能感染一種蟲，但也有例外，如AcMNPV(苜蓿銀紋夜蛾NPV)可感染苜蓿銀紋夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾、斜紋夜蛾等30多種害蟲。過(guò)去一直認(rèn)為，茶尺蠖是EoNPV的唯一宿主，而本研究結(jié)果表明，灰茶尺蠖也是EoNPV的宿主之一?；也璩唧短镩g分布區(qū)域廣于茶尺蠖[12]，在有些省份兩種尺蠖還混合發(fā)生，同時(shí)這兩種尺蠖的幼蟲肉眼難以區(qū)分。了解EoNPV對(duì)灰茶尺蠖的致病特性，篩選應(yīng)用高效毒株，對(duì)灰茶尺蠖和茶尺蠖的生物防治十分有益。本研究首次明確了EoNPV對(duì)灰茶尺蠖的致病特性，并篩選出1株高效毒株，研究結(jié)果對(duì)EoNPV生產(chǎn)與應(yīng)用有重要的實(shí)際意義和參考價(jià)值。

根據(jù)EoNPV對(duì)灰茶尺蠖的致病特性，使用EoNPV防治灰茶尺蠖時(shí)應(yīng)注意病毒的使用濃度、使用蟲齡和代別等方面。從本文試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，田間應(yīng)用時(shí)應(yīng)著重在低齡期(1齡期)施用，第2代防治為最佳。這與EoNPV防治茶尺蠖的研究結(jié)果[8]相似，但是防治期有所提前，防治齡期更小。本研究初步篩選出了1個(gè)高效毒株，但其高效的機(jī)制尚不清楚，是否是病毒的致病基因發(fā)生了變化還有待深入研究。

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PathogeniccharactersofEctropisobliquanucleopolyhedrovirusesonEctropisgrisescensWarrenandscreeningofhighefficientstrain

TANG Meijun1，2， GUO Huawei1，2， GE Chaomei1， YIN Kunshan1， XIAO Qiang1，2

(1.TeaResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310008，China; 2.KeyLaboratoryofTeaQualityandSafetyControl，MinistryofAgriculture，Hangzhou310008，China)

Ectropisobliquanucleopolyhedroviruses (EoNPV) is an effective pathogen ofEctropisobliquaProut larvae.EctropisgrisescensWarren is a related species ofE.obliqua， which is the major pest of tea plant. To investigate the using of EoNPV againstE.grisescens， the pathogenic characters of EoNPV onE.grisescensand screening of high efficient strain were studied. The results showed the 1stinstar larvae ofE.grisescenswas the most sensitive to EoNPV， the mortality was 82.7%-100% infected with EoNPV in the concentration of 2×104-2×108PIB·mL-1. The value of LC50for the 2ndinstar larvae was 2.32×106PIB·mL-1on the 9thday after inoculation. The virulence of EoNPV against the larvae of 2ndgeneration ofE.grisescenswas highest among the 1st-5thgenerations. The strain QF4was screened as high efficient strain through bioassay among all the strains which was extracted from the dead larvae ofE.grisescensinfected by EoNPV constantly. The mortality rate ofE.grisescensinfected by this virus strain increased by 51.5% than that of original strain， and the median lethal time was shortened by 1.5 days. Thus it is suggested that the suitable period of spraying in the field could be at the 1stinstar larvae of 2ndgenerations and the QF4stain could be used to multiply the virus.

EoNPV;Ectropisgrisescens; pathogenic character; high efficient strain

S435.711

A

1004-1524(2017)10-1686-06

（責(zé)任編輯張 韻)