66個玉米自交系的SSR引物篩選試驗初報

張微微 王莉萍 陳 岳 李 炯 俞平高*（上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院植物科學技術(shù)系，上海市松江區(qū) 0699；上海市農(nóng)業(yè)廣播電視學校，上海市松江區(qū) 0699；上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海市閔行區(qū) 000；上海粒粒豐農(nóng)業(yè)科技有限公司,上海市金山區(qū) 050）

66個玉米自交系的SSR引物篩選試驗初報

張微微1王莉萍2陳 岳3李 炯4俞平高1*（1上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院植物科學技術(shù)系，上海市松江區(qū) 201699；2上海市農(nóng)業(yè)廣播電視學校，上海市松江區(qū) 201699；3上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海市閔行區(qū) 200240；4上海粒粒豐農(nóng)業(yè)科技有限公司,上海市金山區(qū) 201503）

玉米作為上海地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的主要農(nóng)作物之一，其種質(zhì)資源的優(yōu)劣將直接影響到上海地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展水平和農(nóng)民的收益水平。為給上海地區(qū)玉米品種的遺傳資源評價和親緣關(guān)系分析提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，利用SSR分子標記技術(shù)進行了SSR引物篩選試驗。結(jié)果表明，以“SH376”“Z421-P1”“Z571”“Z226-P10”“Z678-P17”“Z710-P8”品系的基因組DNA為模板對103對引物進行篩選，可獲得30對多態(tài)性高的SSR引物；再對6 6份玉米自交系進行S S R分析，可擴增出1 2 1條譜帶，每個標記位點等位基因數(shù)2～8個，平均等位基因數(shù)為4.0，PIC值變幅為0.73～0.90，平均為0.82；選擇6個PIC值等于或高于0.85的SSR引物及2個PIC值低于0.85的引物組合成一套核心引物，可用于構(gòu)建6 6份玉米自交系的S S R指紋圖譜。

玉米；S S R；引物篩選；等位基因數(shù)；多態(tài)性信息

DNA指紋技術(shù)是基于DNA分子水平差異檢測進行個體識別的技術(shù)，具有覆蓋面全、多態(tài)性高、測試周期短和不受季節(jié)和測試時間限制等優(yōu)點。目前，該技術(shù)已廣泛應用于各種農(nóng)作物品種遺傳背景分析、指紋圖譜構(gòu)建、品種真實性和純度鑒定、區(qū)試品種質(zhì)量監(jiān)控等方面。作為第二代分子標記的SSR標記，是由2～6個堿基組成的重復序列，是建立在PCR反應基礎(chǔ)之上的一種遺傳標記技術(shù)。目前，該技術(shù)已被有效地應用于玉米指紋圖譜構(gòu)建工作中，如譚君等[1]構(gòu)建了四川常用73份玉米自交系和雜交種的SSR指紋圖譜；趙久然等[2]建立了中國玉米新品種DNA指紋庫；吳渝生等[3]建立了3個云南玉米雜交種及其親本DNA的指紋圖譜；李曉輝等[4]確定10 對核心引物，建立了86個雜交種的SSR指紋圖譜庫；李麗華等[5]對四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所近年選育的20個優(yōu)良自交系的指紋圖譜進行了構(gòu)建。

玉米作為上海地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的主要農(nóng)作物之一，其品種自交系常年種植面積在0.4萬hm2以上，玉米種質(zhì)資源的優(yōu)劣將直接影響到上海地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展水平和農(nóng)民的收益水平。為此，本研究利用SSR分子標記技術(shù)進行了SSR引物篩選試驗，以期對當?shù)赜衩灼贩N真實性和一致性進行鑒定，為上海地區(qū)玉米品種的遺傳資源評價和親緣關(guān)系分析提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

由上海粒粒豐農(nóng)業(yè)科技有限公司收集66份玉米自交系，見表1，包括甜玉米、糯玉米、少量甜糯玉米和普通玉米等類型，各品種均于2015年4月在上海粒粒豐農(nóng)業(yè)科技有限公司實驗基地種植，常規(guī)播種，于5月對每個自交系進行取樣，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

采用DNA提取試劑盒[DP320，天根生化科技(北京)有限公司]提取玉米幼嫩葉片基因組DNA，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用NanoDrop2000c紫外可見光譜儀(Thermo公司)進行DNA純度和濃度測定，稀釋至50 ng/μL工作液，于4 ℃冰箱儲藏備用。

1.2.2 SSR引物篩選

以“SH376”“Z421-P1”“Z571”“Z226-P10”“Z678-P17”“Z710-P8”品系的基因組DNA為模板進行SSR引物多態(tài)性篩選，引物試驗所用SSR引物均由生工生物工程股份(上海)有限公司合成。PCR反應總體積為10 μL，反應混合液為2×ES Taq mix(康為公司)5 μL、50 ng/μL 的DNA模板 1 μL、10 μM 的引物 0.5 μL、ddH2O 3.5 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物加入變性劑6 μL，95 ℃變性5 min，迅速于冰上冷卻，6%聚丙烯酰胺凝膠檢測，銀染法顯色。白熾燈下觀察電泳結(jié)果，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性篩選

以“SH376”“Z421-P1”“Z571”“Z226-P10”“Z678-P17”“Z710-P8”品系的基因組DNA為模板，對103對引物進行多態(tài)性篩選，結(jié)果篩選出30對條帶清晰、擴增穩(wěn)定、具有多態(tài)性的SSR引物，多態(tài)性比率為29.1%，見表2。

2.2 SSR標記分析

利用30對多態(tài)性引物對66份玉米自交系進行SSR分析，獲得的擴增譜帶清晰，可用于不同玉米自交系材料的區(qū)分。結(jié)果表明，30對多態(tài)性SSR引物共擴增出121條譜帶，每個標記位點等位基因數(shù)2～8個，平均等位基因數(shù)為4個；多態(tài)性信息量(PIC)是用來評估每對引物標記的多態(tài)性信息量水平，本試驗篩選出的30對SSR引物中，PIC值為0.73～0.90，平均為0.82，表明所篩選的引物具有較豐富的遺傳多樣性。

表1 66份玉米自交系名稱、類型和顏色信息

表2 30對多態(tài)性SSR引物名稱、等位基因數(shù)和多態(tài)性信息量

本研究選取多態(tài)性、穩(wěn)定性、重復性等綜合特性好的引物作為核心引物，從表2可看出，PI C值超過0.85的有bnlg615、bnlg1017、bnlg1018、bnlg1257、bnlg1265、umc1083和NC004等7個引物?？紤]特征譜帶、帶型統(tǒng)計和引物重復性等原因，最終確定將bnlg615、bnlg1017、bnlg1018、bnlg1257、bnlg1484、umc1083、Phi072和NC004等8個引物作為一套核心引物，其中，引物bnlg615對材料“Z1222”和“Z492-P11”、引物bnlg1017對材料“Z397-P2”、引物bnlg1018對材料“Z1255”、引物bnlg1257對材料“Z1222”和“Z758-P18”、引物bnlg1484對材料“Z710-P8”、引物Phi072對材料“Z1258”有特征性譜帶。5對引物bnlg615、bnlg1017、bnlg1018、bnlg1257和NC004組合可以將63份供試材料區(qū)分開，見表3，其他材料需用擴增特征譜帶引物區(qū)分。

此外，由于少數(shù)材料不易找出特征譜帶或不易區(qū)分，而可篩選的引物數(shù)量有限，只有個別PIC值較低的引物對其有特征性譜帶，或與其它引物組合才能區(qū)分開，如引物bnlg1484(0.82)和Phi072(0.81)。

表3 部分引物組合區(qū)分自交系數(shù)統(tǒng)計分析

3 結(jié)論與討論

結(jié)果表明，以“SH376”“Z421-P1”“Z571”“Z226-P10”“Z678-P17”“Z710-P8”品系的基因組DNA為模板對103對引物進行篩選，可獲得30對多態(tài)性高的SSR引物；再對66份玉米自交系進行SSR分析，可擴增出121條譜帶，每個標記位點等位基因數(shù)2～8個，平均等位基因數(shù)為4.1個，平均PIC值為0.82，這與Xie等[6]研究的70對SSR引物在187份玉米自交系中檢測到的平均等位基因數(shù)(4.14)相近，但其平均PIC值(0.615)低于本試驗；本試驗檢測到的平均等位基因數(shù)和PIC值均高于肖木輯等[7]用70對SSR標記對37份遼寧省主要玉米自交系檢測的平均等位基因數(shù)(3.7)和平均PIC值(0.564)，分析原因，這可能與試驗所用材料和所選引物不同有關(guān)。本實驗所用SSR標記的平均PIC均高于文獻報道，表明所篩選引物具有較豐富的遺傳多樣性。

SSR標記具有簡單快速、重復性好、穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富和具共顯性等優(yōu)勢，是構(gòu)建玉米指紋圖譜采用最多的標記技術(shù)。DNA指紋圖譜的構(gòu)建應利用盡量少的標記分開盡量多的品種，而多態(tài)性信息量高的引物，其擴增產(chǎn)物多態(tài)性好，能區(qū)分更多的供試材料。因此，這就要求所用標記的多態(tài)性要好，以降低成本、提高檢測效率。本研究選擇6個PIC值等于或高于0.85的SSR引物及2個PIC值低于0.85的引物組合成一套核心引物，其中5對引物bnlg615、bnlg1017、bnlg1018、bnlg1257和NC004可將63份供試材料區(qū)分開，這有助于進一步構(gòu)建玉米自交系（上海地區(qū)）DN A指紋圖譜。但本研究僅對上海地區(qū)玉米自交系材料進行了分析，因此其等位基因數(shù)目和頻率值的準確性還有待印證，對于不同地區(qū)、不同玉米自交系材料，應針對引物合成成本、不同材料的引物多態(tài)性、引物穩(wěn)定性等多方面進行調(diào)整和人工優(yōu)化，從而確定最佳引物組合。

本研究利用SSR標記技術(shù)對玉米自交系（上海地區(qū)）進行了SSR引物篩選試驗，試驗結(jié)果對今后優(yōu)異基因資源的發(fā)掘、品種權(quán)益的保護及種子的真實性和純度鑒定均具有重要意義。

[1]譚君,丁仲芳,孫仕賢,等.西南常用玉米自交系SSR指紋圖譜構(gòu)建[J].西南農(nóng)業(yè)學報,2003,16(2):1-6.

[2]趙久然,王鳳格,郭景倫,等.中國玉米新品種DNA指紋庫建立系列研究Ⅱ.適于玉米自交系和雜交種指紋圖譜繪制的SSR核心引物的確定[J].玉米科學,2003,11(2):3-5.

[3]吳渝生,楊文鵬,鄭用璉.3個玉米雜交種和親本SSR指紋圖譜的構(gòu)建[J].作物學報,2003,29(4):496-500.

[4]李曉輝,李新海,高文偉,等.玉米雜交種DNA指紋圖譜及其在親子鑒定中的應用[J].作物學報,2005,31(3):386-391.

[5]李麗華,魏昕,潘光堂.20個骨干玉米自交系的SSR指紋圖譜構(gòu)建[J].西南農(nóng)業(yè)學報,2007,20(6):1172-1175.

[6]Xie C,Zhang S, Li M, et al. Inferring genome ancestry and estimating molecular relatedness among 187 Chinese maize inbred lines[J]. Journal of Genetics and Genomics,2007,34(8):738-748.

[7]肖木輯,李明順,孫有位,等.遼寧省主要玉米自交系的SSR遺傳多樣性分析[J].玉米科學,2006,14(1):33-36.

2017-08-20

*為通訊作者